补阳还五汤调控丝裂原活化蛋白激酶信号通路对2型糖尿病大鼠糖脂代谢的影响

林莉娴 龙邦盛 王宝爱

(1.海南省海口市中医医院内五科,海南 海口 570000;2.海南省海口市中医医院重症医学科,海南 海口 570000;3.海南省海口市中医医院内一科,海南 海口 570000)

糖尿病是一种以高血糖、胰岛素分泌障碍或其生物作用受损为主要临床表现的进展性疾病,2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是其最常见的类型,占所有糖尿病的90%以上[1-3]。抑制肝脏异常糖异生是治疗该病的关键所在[4]。T2DM属中医学消渴范畴,病机为气阴两虚、血行瘀滞等,以益气活血治疗。补阳还五汤有效成分是芍药苷、黄芪甲苷等,具有益气养血、活血通络的作用[5]。该方有改善高血糖、高血脂、调节免疫等药理作用[6],但其机制并未确定。有研究认为,丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路在糖脂代谢异常中有重要作用,可作为糖脂代谢异常人工干预及药物研发的新方向[7-8]。但补阳还五汤是否可通过调控该通路对T2DM大鼠产生作用,还不明确。因此,本研究通过T2DM大鼠模型,探讨补阳还五汤调控MAPK通路改善糖脂代谢的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与分组 选取60只Wistar雄性大鼠,体质量(180±20) g,饲养于无菌环境中,温度27 ℃左右;湿度55%左右,自由进食,适应性喂养1周后进行实验。按照随机数字表法分为6组,即空白组、模型组、阳性对照组和补阳还五汤低、中、高剂量组,每组10只。

1.1.2 药物制备 补阳还五汤(药物组成:黄芪120 g,当归6 g,赤芍5 g,川芎3 g,红花3 g,桃仁3 g,地龙3 g)所需药材均购自湖北省中药材公司,以上药材均为颗粒剂,各1袋溶于温水(30～40 ℃)11.3 mL中,配制成质量浓度约为12.8 g/mL(以颗粒剂总质量计)的药液,再用温水分别稀释成1.6、3.2、6.4 g/mL药液备用。二甲双胍片(中美上海施贵宝制药有限公司,国药准字H20023371),称取二甲双胍片2 g并粉碎,用蒸馏水配成浓度为20 mg/mL的二甲双胍混悬液,4 ℃储存备用,用时室温放置60 min,振摇使其混匀,每周配置1次。

1.1.3 仪器与试剂 磷酸盐缓冲液(PBS,成都中仕石化有限公司),石蜡(瑞沃德生命科技有限公司),乙醇、0.9%氯化钠注射液(南京化学试剂有限公司),空腹胰岛素(FINS)、糖化血红蛋白(HbA1c)试剂盒(上海酶联生物科技有限公司),链脲佐菌素(STZ,美国Sigma公司),RNA提取液(Invitrogen TRIzol,Thermo公司),离心机(大龙兴创实验仪器有限公司),凝胶成像仪(上海无陌光学仪器有限公司),AT1303002型酶标仪(上海元析仪器有限公司),实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)仪(美国Thermo Fisher公司),电泳仪(北京六一仪器厂),组织匀浆机(深圳欣博盛生物科技有限公司),MAPK、磷酸化MAPK(p-MAPK)、β-actin抗体(美国Thermo Fisher公司),全自动生化分析仪(上海科华生物工程股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型制备及给药 空白组予基础饲料,其余大鼠给予高脂饲料喂养6周,禁食12 h,腹腔注射100 mg/kg的STZ试剂,然后继续高脂饲料喂养4周,剪尾采血,以连续2天空腹血糖(FPG)≥13.9 mmol/L为造模成功。造模成功后予药物干预,补阳还五汤低、中、高剂量组分别给予1.6、3.2、6.4 g/kg生药灌胃,阳性对照组予二甲双胍混悬液0.2 g/kg灌胃,空白组、模型组均予等容积0.9%氯化钠注射液灌胃,每日1次,持续给药12周。

1.2.2 记录大鼠体质量和生存状态 于药物干预第12周末次给药后测定各组大鼠体质量,上代谢笼监测各组大鼠12 h的饮水量、摄食量和尿量。

1.2.3 测定大鼠血糖水平 于药物干预第12周末次给药后先对大鼠禁食12 h,末次给药后抽取其尾静脉血2 mL,检测空腹血糖(FPG),采用酶联免疫吸附(ELISA)检测FINS、HbA1c。

1.2.4 测定大鼠血脂水平 于药物干预第12周末次给药后麻醉大鼠,抽取其腹主动脉血,离心后于-20 ℃环境中保存,全自动生化分析仪测定大鼠血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。

1.2.5 苏木素-伊红染色(HE)观察大鼠肝脏病理学组织 于药物干预第12周末次给药后麻醉大鼠,打开腹部暴露脏器,小心摘取肝脏,用0.9%氯化钠注射液充分冲洗后再用多聚甲醛固定,脱水,待石蜡完全浸入组织块后包埋,连续4 μm切片,进行HE染色,放大200倍后观察各组大鼠肝脏组织病理学变化。

1.2.6 蛋白免疫印迹(western blot,WB)法检测MAPK通路相关蛋白表达 肝脏组织匀浆后提取总蛋白,加入十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE,上海信裕生物科技有限公司)后进行电泳,分离后进行转膜用牛血清白蛋白(BSA,上海麦克林生化科技股份有限公司)封闭聚偏二氟乙烯膜(PVDF,碧云天生物有限公司)1 h,然后洗脱5 min,孵育一抗:加入MAPK、p-MAPK一抗,4 ℃冷室孵育过夜。洗膜后加入二抗孵育,再次摇动洗涤,进行化学发光反应,然后浸入显影液中显色,最后凝胶成像,计算蛋白表达。

1.2.7 qRT-PCR检测MAPK、成纤维细胞生长因子21(FGF21)mRNA表达 提取肝脏组织于匀浆器中,加入TRIzol试剂提取总RNA,按逆转录试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司)说明书要求,将提取的总RNA反转录成cDNA,然后再进行扩增,以β-actin为内参,采用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量。见表1。

2 结果

2.1 各组大鼠体质量、饮水量、摄食量和尿量比较 与空白组比较,模型组大鼠体质量降低(P<0.05),12 h饮水量、摄食量及尿量均升高(P<0.05);阳性对照组及补阳还五汤低、中、高剂量组体质量均高于模型组(P<0.05),12 h饮水量、摄食量、尿量均低于模型组(P<0.05)。与阳性对照组比较,补阳还五汤低剂量组体质量较低(P<0.05),补阳还五汤高剂量组体质量明显较高(P<0.05);与阳性对照组比较,补阳还五汤低、中剂量组12 h饮水量、尿量较高(P<0.05);与阳性对照组比较,补阳还五汤低剂量组摄食量较高(P<0.05),补阳还五汤高剂量组摄食量较低(P<0.05);与阳性对照组比较,补阳还五汤低、中剂量组尿量较高(P<0.05)。随着补阳还五汤剂量增加,大鼠体质量呈递增趋势,12 h饮水量及摄食量呈递减趋势,且各组间两两比较差异有统计学意义(P<0.05);随着补阳还五汤剂量增加,大鼠尿量递减(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠体质量、饮水量、摄食量和尿量比较

2.2 各组大鼠FPG、FINS、HbA1c水平比较 与空白组比较,模型组FPG、FINS、HbA1c水平均升高(P<0.05);阳性对照组及补阳还五汤低、中、高剂量组FPG、FINS、HbA1c水平均低于模型组(P<0.05)。与阳性对照组比较,补阳还五汤低剂量组FPG、FINS、HbA1c水平均升高(P<0.05),补阳还五汤中剂量组FINS、HbA1c水平均升高(P<0.05),补阳还五汤高剂量组FINS水平降低(P<0.05)。随着补阳还五汤剂量增加,FINS、HbA1c、FPG水平均逐渐降低(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠FPG、FINS、HbA1c水平比较

2.3 各组大鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C水平比较 与空白组比较,模型组TC、TG、LDL-C水平均升高(P<0.05),HDL-C水平降低(P<0.05);阳性对照组及补阳还五汤低、中、高剂量组TC、TG、LDL-C水平均低于模型组(P<0.05),HDL-C水平高于模型组(P<0.05)。与阳性对照组比较,补阳还五汤低剂量组TC、TG、LDL-C水平均升高(P<0.05),HDL-C水平降低(P<0.05)。与补阳还五汤低剂量组比较,补阳还五汤中剂量组TC水平降低(P<0.05),补阳还五汤高剂量组TC、TG、LDL-C水平均降低(P<0.05),HDL-C水平升高(P<0.05);与补阳还五汤中剂量组比较,补阳还五汤高剂量组TG、LDL-C水平均降低(P<0.05),HDL-C水平升高(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C水平比较

2.4 各组大鼠肝脏组织病理学变化 空白组大鼠肝脏组织结构和细胞状态均无异常,排列整齐,脂质染色无空泡;模型组大鼠肝脏组织出现明显的病理改变:组织结构紊乱,细胞形态异常,体积发生变化,出现脂质空泡;阳性对照组和补阳还五汤各剂量组大鼠肝脏组织均在不同程度上有明显改善,且高剂量组效果最显著。见图1。

图1 各组大鼠肝脏组织病理学变化(HE,×200)

2.5 各组大鼠MAPK、p-MAPK蛋白表达比较 与空白组比较,模型组MAPK、p-MAPK蛋白表达降低(P<0.05);阳性对照组及补阳还五汤低、中、高剂量组MAPK、p-MAPK蛋白表达均高于模型组(P<0.05)。与阳性对照组比较,补阳还五汤低、中剂量组MAPK、p-MAPK蛋白表达降低(P<0.05),补阳还五汤高剂量组MAPK、p-MAPK蛋白表达升高(P<0.05)。随着补阳还五汤剂量增加,MAPK、p-MAPK蛋白表达均逐渐升高,两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表5,图2。

图2 各组大鼠MAPK、p-MAPK蛋白表达比较

表5 各组大鼠MAPK、p-MAPK蛋白表达比较

2.6 各组大鼠肝脏组织MAPK mRNA、FGF21 mRNA表达比较 与空白组比较,模型组MAPK mRNA、FGF21 mRNA表达降低(P<0.05);阳性对照组及补阳还五汤低、中、高剂量组MAPK mRNA、FGF21 mRNA均高于模型组(P<0.05)。与阳性对照组比较,补阳还五汤低、中剂量组MAPK mRNA、FGF21 mRNA表达均降低(P<0.05)。随着补阳还五汤剂量增加,MAPK mRNA、FGF21 mRNA表达差异逐渐升高,且补阳还五汤低、中、高剂量组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表6。

表6 各组大鼠肝脏组织MAPK mRNA、FGF21 mRNA表达比较

3 讨论

T2DM可由多种原因引起,其病机十分复杂[9]。临床上常以口服药物或注射胰岛素的方法控制病情,但效果并不明显,且具有毒副作用。中医学认为,T2DM多为“气虚”“血瘀”[10]。因此,本研究使用补气活血、祛瘀通络的补阳还五汤来干预。

本研究中,模型组大鼠体质量明显减轻,且出现多饮、多食、多尿的症状,此为T2DM的临床特征,表明造模成功。补阳还五汤各剂量组大鼠较模型组体质量升高,12 h饮水量、摄食量、尿量有所降低,这说明补阳还五汤可有效改善临床症状。T2DM患者会伴随不同程度的糖脂代谢紊乱,临床上血糖、血脂水平是监测糖脂代谢的重要指标。本研究中,模型组FPG、FINS、HbA1c和TC、TG、LDL-C水平较高,HDL-C水平较低;补阳还五汤治疗后各指标均改善。说明补阳还五汤对T2DM大鼠的糖脂代谢有调节作用,临床效果明显。有学者研究的补阳还五汤的作用效果与本研究基本一致[11-12]。HE结果也显示造模后大鼠肝脏组织出现了非常明显的病变,但经补阳还五汤治疗后,出现了明显的改善,与药物剂量呈正相关,进一步提示补阳还五汤可以减轻甚至是逆转T2DM大鼠肝脏病理损伤,为该药调节糖脂代谢提供了有力依据。

MAPK信号通路对T2DM胰岛素细胞功能、糖脂代谢及炎性反应、细胞增殖与凋亡、氧化应激、炎症因子等均有调控作用[13-14]。FGF21是一种新的可以调节机体新陈代谢的因子,还参与体内糖脂代谢,调节能量、血脂等[15-16],而肝脏是FGF21最主要的表达器官[17-18],FGF21表达增加可以显著降低T2DM大鼠体质量和血糖,促进糖的再吸收。FGF21可以通过激活下游的信号通路进一步参与机体生物学功能的过程,而MAPK就是其下游的一个关键分子。MAPK可通过靶蛋白的磷酸化调节通路,调节糖的吸收与利用、控制肝糖的输出、降低脂肪以及TG的合成,从而调节能量代谢[19-20]。因此,本研究进一步对MAPK通路的相关蛋白及mRNA及FGF21的mRNA表达进行检测。研究显示,与空白组比较,模型组MAPK、p-MAPK蛋白及MAPK、FGF21 mRNA表达较低,补阳还五汤治疗后其表达明显升高。这说明,补阳还五汤可增加MAPK的表达并促进MAPK磷酸化,从而改善糖脂代谢。

综上所述,补阳还五汤对T2DM大鼠糖脂代谢有调节作用,其作用机制可能与激活MAPK信号通路有关,这为该病的临床治疗提供了新思路,不过补阳还五汤调控T2DM大鼠糖脂代谢的作用是否涉及其他通路还需进一步研究。