芪黄汤治疗免疫性血小板减少症的疗效及对细胞相关因子和外周血T淋巴细胞程序性死亡受体-1/程序性死亡配体-1的影响※

周 林 戴 燚 刘毓玲

(1.湖北省武汉市中医医院检验科,湖北 武汉 430050;2.湖北省武汉市中医医院综合病区,湖北 武汉 430050)

免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia,ITP)是一种获得性自身免疫性疾病,由于体内免疫失衡导致血小板破坏增多、生成减少而导致以皮肤黏膜出血以及内脏出血为特征的一种自身免疫性疾病[1]。ITP是临床最为常见的出血性疾病,成人发病率为5～10/10万,育龄期女性发病率高于男性,60岁以上老年人是该病的高发群体[2]。ITP治疗策略在于阻止血小板过度破坏和促血小板生成,使血小板计数维持在安全水平内,控制出血[3]。2018年6月至2020年12月,我们在糖皮质激素治疗基础上应用芪黄汤治疗ITP 45例,并与糖皮质激素治疗45例对照,观察疗效及对细胞相关因子和外周血淋巴细胞程序性死亡受体-1(PD-1)/程序性死亡配体-1(PD-L1)的影响,结果如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 全部90例均为我院综合科住院患者,按照随机数字表法分为2组。治疗组45例,男17例,女28例;年龄18～80岁,平均(58.4±3.9)岁;病程4～50个月,平均(20.8±10.1)个月;体质量指数(BMI)21.65±5.47。对照组45例,男20例,女25例;年龄20～75岁,平均(60.1±2.3)岁;病程5～45个月,平均(22.3±9.5)个月;BMI 20.63±6.78。2组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2 病例选择

1.2.1 诊断标准 参照《成人原发免疫性血小板减少症诊断与治疗中国专家共识(2016年版)》[2]中ITP的诊断标准。

1.2.2 纳入标准 年龄18～80岁;3个月内未接受过糖皮质激素治疗的患者;临床资料完整;本研究经医院医学伦理委员会通过,患者自愿签署知情同意书。

1.2.3 排除标准 参与研究前接受过血小板输注或糖皮质激素治疗者;因其他疾病接受过糖皮质激素治疗或有糖皮质激素禁忌证等;妊娠或哺乳期女性患者;合并严重肝肾功能不全者;其他继发性血小板减少症。

1.3 治疗方法

1.3.1 对照组 予糖皮质激素治疗。氢化可的松琥珀酸钠(天津生物化学制药有限公司,国药准字H12020493)50～100 mg/d,加入0.9%氯化钠注射液100 mL中,每日1次静脉滴注,治疗5天。血小板(PLT)计数>80×109/L予醋酸泼尼松片(山东鲁抗医药集团赛特有限公司,国药准字H20033023)1.5～2 mg/(kg·d)口服,治疗1～2周,缓慢减量后以10 mg/d维持治疗。

1.3.2 治疗组 在对照组治疗基础上加芪黄汤。药物组成:黄芪15 g,生地黄15 g,熟地黄15 g,白术12 g,茯苓15 g,女贞子15 g,墨旱莲15 g,太子参15 g,菟丝子15 g,枸杞15 g,山药18 g,豆蔻12 g。日1剂,水煎2次取汁400 mL,分早、晚2次服。

1.3.3 疗程 2组均治疗2个月。

1.4 观察指标及方法 ①ITP出血评分[2]:年龄≥65岁1分,≥75岁2分;皮肤(淤点/淤斑/皮下血肿),头面部2分,其他部位1分;黏膜(鼻出血/牙龈出血/口腔血疱/结膜出血),偶发、可自止2分,多发、持续不止3分,伴贫血5分;深部器官(内脏出血如肺、胃肠道、泌尿生殖系统),不伴贫血3分,伴贫血5分,危及生命8分;中枢神经系统8分。②用EDTA-K2抗凝管采集患者静脉血2 mL,采用SYSMEX XT-1800i型全自动血液分析仪检测PLT计数;分离胶促凝管采集静脉血4 mL,离心取血清,采用Rayto RT-6000型酶标分析仪,采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测血小板相关抗体(PAIg)G、PAIgM、干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素10(IL-10)、转化生长因子-β(TGF-β)、IL-17;EDTA-K2抗凝管采集静脉血2 mL,采用BD FACS Calibur型流式细胞仪检测外周血T淋巴细胞CD4+PD-1+、CD8+PD-1+、CD4+PD-L1+、CD8+PD-L1+百分比。

1.5 疗效标准[2]完全反应:治疗后PLT计数≥100×109/L且无出血;有效:治疗后PLT计数≥30×109/L且至少比基础PLT计数增加2倍,且无出血;无效:治疗后PLT计数<30×109/L或PLT计数增加不到基础值的2倍或有出血。在定义完全反应或有效时,应至少检测2次,期间至少间隔7天。复发:治疗有效后,PLT计数<30×109/L或PLT计数降至不到基础值的2倍或出现出血症状,定义复发时至少检测2次PLT计数,期间至少间隔1天。总有效率=(完全反应例数+有效例数)/总例数×100%。复发率=复发例数/(完全反应例数+有效例数)×100%。

2 结果

2.1 2组疗效比较 治疗组总有效率86.67%(39/45),复发率10.26%(4/39);对照组总有效率68.89%(31/45),复发率29.03%(9/31)。治疗组疗效优于对照组(P<0.05),复发率低于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 2组疗效比较 例

2.2 2组治疗前后ITP出血评分比较 2组治疗后ITP出血评分均较本组治疗前降低(P<0.05),且治疗组降低更明显(P<0.05),比较差异有统计学意义。见表2。

表2 2组治疗前后ITP出血评分比较 分,

2.3 2组治疗前后PLT计数、PAIgG、PAIgM比较 2组治疗后PLT计数较本组治疗前升高(P<0.05),PAIgG、PAIgM均较本组治疗前降低(P<0.05);治疗后治疗组PLT计数高于对照组(P<0.05),PAIgG、PAIgM均低于对照组(P<0.05),比较差异有统计学意义。见表3。

表3 2组治疗前后PLT、PAIgG、PAIgM比较

2.4 2组治疗前后IFN-γ、IL-10、TGF-β、IL-17水平比较 2组治疗后IFN-γ、IL-17水平均较本组治疗前降低(P<0.05),IL-10、TGF-β水平较本组治疗前升高(P<0.05);治疗后治疗组IFN-γ、IL-17水平均低于对照组(P<0.05),IL-10、TGF-β水平均高于对照组(P<0.05)。见表4。

表4 2组治疗前后IFN-γ、IL-10、TGF-β、IL-17水平比较

2.5 2组治疗前后外周血T淋巴细胞PD-1/PD-L1水平比较 2组治疗后外周血CD4+PD-1+、CD8+PD-1+、CD4+PD-L1+、CD8+PD-L1+水平均较本组治疗前降低(P<0.05);治疗后治疗组外周血CD4+PD-1+、CD4+PD-L1+水平均低于对照组(P<0.05)。见表5。

表5 2组治疗前后外周血T淋巴细胞PD-1/PD-L1水平比较

3 讨论

ITP的发病机制有自身抗体产生、机体免疫耐受失衡、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导的血小板破坏、骨髓巨核细胞发育成熟障碍及血小板生成减少[4-5]。

目前,现代医学治疗ITP主要应用糖皮质激素、免疫抑制剂及无效病例切脾等,但有相当部分病例治疗后反复迁延不愈而转化为难治性ITP,需要中医药辅助或支撑治疗。

ITP属中医学血证、紫斑、肌衄、葡萄疫等范畴,本病起病缓慢,病程迁延,临床表现为皮肤出现青紫斑点和斑块,还有头晕乏力、舌淡苔白、脉细无力等脾肾虚损之候。《诸病源候论·伤寒病诸候》提出“热毒乘虚,出于皮肤,所以发斑疮隐疹如锦纹”。《景岳全书·血证》提出“血本阴精,不宜动也,而动则为病;营气,不易损也,而损则为病。盖动者多因于火,火盛则逼血妄行;损者多由于气,气伤则血无以存”。现代中医提出,ITP外因为风寒火湿邪毒侵袭营血,内因为气血阴阳亏虚、血溢脉外,病机特点为阴虚火旺、气不摄血、热迫血行、瘀血阻滞,且这四种形式往往相互交错而又相互影响;脾肾虚弱是其病理基础,且贯穿疾病的全程,及脾者以脾不统血证候多见,及肾者以阴虚内热,血热妄行多见;归纳概括为外感温热病邪及内有脏腑虚损,导致机体脏腑、阴阳气血失调,血不循经而出血[6-7]。芪黄汤方中黄芪、地黄为君药,黄芪甘温,健脾益肾,补气固表,升提摄血;生地黄清热凉血,止血,养阴生津,熟地黄补血滋阴,益精填髓,两者配伍,生津补血,健脾益气,滋阴补肾,清热凉血。白术、茯苓、女贞子、墨旱莲共为臣药,脾为气血之源,主中气而统血,黄芪合白术、茯苓益气健脾增益明显。白术补益健脾,燥湿利水。墨旱莲甘、酸而寒,入肝、肾二经,补益肝肾之阴,凉血止血,补中有清,为清补之品,与女贞子配伍,既能补益肝肾,又能滋阴止血[8]。太子参益气生津;菟丝子、枸杞、山药滋阴补肾,培元固本;豆蔻化湿消痞,行气温中,共为佐、使药。全方配伍合理,主从有序,方证相合,运用益气摄血、清热凉血、补虚扶正、健脾益气之法,标本兼治。现代药理研究表明,黄芪多糖能调节细胞免疫,通过增加脾淋巴细胞而改善模型小鼠脾脏指数,从而促进血小板生成[9],能促进小鼠骨髓的恢复及外周三系血细胞的恢复[10];黄芪糖蛋白可通过不同程度促进Treg细胞的分化增殖,抑制辅助性T淋巴细胞17(Th17)的分化增殖,有效恢复Th17/Treg细胞平衡[11];熟地黄多糖对外周血象、骨髓有核细胞下降均有拮抗作用,对造血干细胞具有促进增殖、分化作用,地黄苷D可明显提高血小板数[12];白术内酯与白术多糖通过抑制炎症因子、调节免疫等方式治疗免疫系统疾病[13];茯苓酸通过抑制IFN-γ分泌,抑制CTL对靶细胞的杀伤[14];女贞子中红景天苷可通过提高其特异性免疫功能、巨噬细胞吞噬功能、机体非特异免疫功能、阻止骨髓细胞凋亡、诱导造血干细胞增殖分化等,从而调节其免疫功能[15]。

本研究结果显示,治疗组总有效率高于对照组(P<0.05),复发率低于对照组(P<0.05);治疗后治疗组ITP出血评分低于对照组(P<0.05)。说明芪黄汤联用糖皮质激素较单独使用糖皮质激素治疗ITP具有更高的总有效率及更低的复发率,且ITP出血评分更低[16]。

血小板生成减少及自身抗体产生是ITP发病中重要的临床指标,患者血清主要检测到IgG及IgM型血小板抗体。本研究结果显示,2组治疗后PLT计数较治疗前升高(P<0.05),PAIgG、PAIgM均较本组治疗前降低(P<0.05);治疗后治疗组PLT计数高于对照组(P<0.05),PAIgG、PAIgM均低于对照组(P<0.05)。表明芪黄汤恢复患者PLT计数及减少血小板抗体较对照组具有更好疗效。

有研究发现,CD4+T淋巴细胞亚群的比例失调及其分泌的细胞因子失衡参与了ITP的发生发展[17]。ITP患者Th1/Th2失衡,Th1型占优势表达,且与疾病严重程度呈正相关[18],ITP患者同时存在Th17/Treg比例失衡[19]。IFN-γ来源于Th1细胞,促炎作用强,在疾病的发展中起主要作用,IL-10来源于Th2细胞,Th1和Th2之间通过分泌细胞因子相互制约,维持动态免疫平衡。Th17细胞分泌IL-17在ITP患者中明显增高[20],Treg细胞分泌TGF-β则引起免疫耐受,两者之间的动态平衡在维持机体免疫状态稳定中发挥重要作用。本研究结果发现,2组治疗后IFN-γ、IL-17水平均较本组治疗前降低(P<0.05),IL-10、TGF-β水平较本组治疗前升高(P<0.05);治疗后治疗组IFN-γ、IL-17水平均低于对照组(P<0.05),IL-10、TGF-β水平均高于对照组(P<0.05),提示芪黄汤可能通过降低Th1、Th17细胞因子表达,提高Th2、Treg细胞因子表达从而调整Th1/Th2和Th17/Treg平衡,达到治疗效果。

有研究表明,ITP患者CD4+T淋巴细胞表面PD-1比例升高,并且PD-1/PD-L1升高与ITP患者疾病活动程度有一定关系[21]。PD-1是一种Ⅰ型跨膜蛋白受体,属于免疫球蛋白CD28家族,表达于活化的T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞和树突状细胞等多种免疫细胞,在维持淋巴细胞稳态方面起关键作用;PD-1的配体PD-L1是Ⅰ型跨膜蛋白受体B7家族的成员,广泛表达于T淋巴细胞、B淋巴细胞、树突状细胞、巨噬细胞、间充质干细胞、骨髓来源的肥大细胞和一些非造血细胞[22-23]。PD-1/PD-L1在T淋巴细胞成熟、分化和增殖过程中能够提供负性共刺激信号,在机体免疫功能异常亢进时代偿性分泌增多,参与多种自身免疫性疾病的发生及发展过程[24-25]。本研究结果发现,2组治疗后外周血CD4+PD-1+、CD8+PD-1+、CD4+PD-L1+、CD8+PD-L1+水平均较本组治疗前降低(P<0.05);治疗后治疗组外周血CD4+PD-1+、CD4+PD-L1+水平均低于对照组(P<0.05),提示芪黄汤可能通过调节CD4+T淋巴细胞PD-1/PD-L1信号,使其处于低表达,免疫功能亢进被抑制,进而改善病情。

综上所述,芪黄汤治疗ITP,可提高患者PLT计数,降低PAIg水平和ITP出血评分,其机制可能与减少IFN-γ、IL-17分泌水平、提高IL-10、TGF-β表达水平,从而调节Th1/Th2和Th17/Treg免疫平衡、降低CD4+T淋巴细胞PD-1/PD-L1信号表达水平来干预细胞免疫环境相关。