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CRNDE介导miR-33a-5p/CDK6轴影响细胞周期调控人体肝癌细胞增殖的实验研究

2023-09-19梅小平姚明周清河许浏周鸿鲲李彦

浙江临床医学 2023年8期
关键词:细胞株细胞周期肝癌

梅小平 姚明 周清河 许浏 周鸿鲲 李彦

肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)发病率和死亡率高,是我国最常见的恶性肿瘤之一。HCC起病隐匿,早期多无典型症状,临床发现时多已进入肿瘤中晚期,错过了可行根治性手术的最佳时机。即便接受了手术切除,HCC患者5年生存率仍较低[1]。CRNDE(Colorectal neoplasia differentially expressed)具有组织表达特异性,参与了多种肿瘤的发生、发展进程,是肿瘤的潜在治疗靶点[2]。CDK6(cyclin-dependent kinase 6)是影响细胞周期的重要蛋白之一,CDK6过表达可通过多种方式促进HCC的增殖,是细胞信号传导途径中的“中心节点”[3]。通过生物信息学分析,作者发现miR-33a-5p与CRNDE及CDK6均有潜在的结合位点[4]。本研究通过探讨CRNDE介导miR-33a-5p/CDK6轴影响细胞周期调控人体肝癌细胞增殖的作用机制,发现CRNDE能通过靶向调节作用抑制miR-33a-5p的表达,进而介导CDK6的升高,促进肝细胞肝癌的增殖,报道如下。

1 资料与方法

1.1 细胞培养与转染 HL-7702人体肝细胞株和HuH-7人体肝癌细胞株均购于中国科学院上海细胞库。细胞株按期进行传代,维持指数生长。构建稳定干扰CRNDE/低表达CRNDE人体肝癌细胞模型。正义链按5′→3′顺序序列为:酶切位点(Xho I)、干扰序列(21bp)、loop环(TTCAAGAGA)、干扰序列的反向序列、终止信号(TTTTTT);反义链按5′→3′顺序序列为:酶切位点(BamH I)、终止序列的序列(AAAAAA)、干扰序列(21bp)、环路环的序列(TCTCTTGAA)和干扰序列的反向序列。

1.2 实验分组 HL-7702人体肝细胞组、HuH-7人体肝癌细胞组及稳定干扰CRNDE/低表达CRNDE人体肝癌细胞shRNA-CRNDE-HuH-7组。

1.3 RT-qPCR及Western blotting检测HL-7702细胞株、HuH-7细胞株 shRNA-CRNDE-HuH-细胞株中CRNDE、miR-33a-5p及CDK6 mRNA的表达情况 (1)细胞RNA提取和实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR):总RNA提取使用SYBR® Green Realtime PCR Master Mix反应系统。在PCR扩增反应结束后绘制溶解曲线,Ct值的获取采用MJ Opticon Monitor2.5分析软件进行计算,最后以GAPDH mRNA作为内参进行标准化核算,计算标本中各RNA相对表达量。(2)Western blotting分析:总蛋白提取,BCA法测定蛋白浓度,采用超敏型ECL化学发光显色试剂对其进行显色,使用UVP凝胶成像仪检测其蛋白灰度并成像。

1.4 对HL-7702细胞株、HuH-7细胞株及shRNACRNDE-HuH-7细胞株分别进行细胞增殖实验 CCK8(收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,酶联免疫吸附实验检测在450 nm处 24 h、48 h、72 h OD值);细胞凋亡检测(收集细胞悬液,重悬于Binging Buffer,流式细胞仪检测,NovoExpressTM分析软件进行分析);细胞侵袭测试(采用Transwell检测,通过细胞血清饥饿、接种消化、染色等步骤后,显微镜观察细胞数/视野);细胞周期检测(收集细胞悬液,加入碘化丙啶,通过流式细胞技术测量细胞DNA含量,确定每个细胞周期中细胞的比例,NovoExpressTM分析软件进行分析)。通过上述方法评估在不同CRNDE表达情况下个别细胞株增殖、凋亡、侵袭能力及细胞周期的变化。

1.5 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件包。计量资料以()表示,组间比较采用t检验,相关性分析采用Spearman法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 稳定干扰CRNDE/低表达CRNDE人体肝癌细胞株构建检测 RT-qPCR 检测结果显示:shRNA-CRNDEHuH-7细胞株中CRNDE表达量(1.081±0.141)相比HuH-7细胞株(3.014±0.361)减少,组间差异有统计学意义(P<0.05),见图1;Western blotting检测结果同以上结论。由此说明稳定干扰CRNDE/低表达CRNDE的shRNA-CRNDE-HuH-7人体肝癌细胞株的构建成功。

图1 RT-qPCR检测shRNA-CRNDE-HuH-7及HuH-7组CRNDE基因表达

2.2 HL-7702、shRNA-CRNDE-HuH-7及HuH-7三组细胞株中CRNDE、miR-33a-5p及CDK6的表达情况及相关性分析 RT-qPCR检测结果见表1;Western blotting检测结果同以上结论,见图2。当控制位点为CDK6时,HL-7702、shRNA-CRNDE-HuH-7及HuH-7三组细胞株中CRNDE表达量与其呈正相关(r=0.856,P<0.05;);当控制位点为miR-33a-5p时,三组细胞株中miR-33a-5p表达量与CDK6及CRNDE均呈负相关(r=-0.883,P<0.05;r=-0.937,P<0.05)。

表1 三组细胞株RT-qPCR 检测结果分析()

表1 三组细胞株RT-qPCR 检测结果分析()

组别CRNDEmiR-33a-5pCDK6 HL-77020.798±0.2133.014±0.3610.992±0.227 shRNA-CRNDE-HuH-71.081±0.1412.211±0.3431.981±0.276 HuH-73.014±0.3611.081±0.1413.021±0.303 t值2.7662.6982.031 P值0.0090.0090.027

图2 Western blotting检测三组细胞株CRNDE、miR-33a-5p及CDK6表达情况。

2.3 细胞增殖实验 采用CCK8法分别检测24 h、48 h、72 h OD值,绘制生长曲线,检测结果显示:HuH-7组细胞增殖能力显著,shRNA-CRNDE-HuH-7细胞增殖能力明显受到抑制,基本与HL-7702组细胞增殖曲线重合,见图3A;shRNA-CRNDE-HuH-7组24 h、48 h及72 h相对OD值与HL-7702组接近,但明显低于HuH-7组,差异有统计学意义(P<0.05),见图3B。

图3 CCK8法检测三组细胞声势浩大细胞增殖能力(*P<0.05)

2.4 Transwell测定法检测 shRNA-CRNDE-HuH-7细胞株迁移及侵袭能力,相比HuH-7组,shRNA-CRNDEHuH-7组细胞数明显减少,基本接近于HL-7702组细胞数,组间差异有统计学意义(P<0.05),表明shRNACRNDE-HuH-7细胞株相比HuH-7细胞株迁移及侵袭能力明显下降,见图4。

图4 Transwell 测定法检测三组细胞株迁移及侵袭能力(*P<0.05)

2.5 流式细胞仪检测 三组细胞株凋亡率分别为:HL-7702组33.19%±6.14%,shRNA-CRNDE-HuH-7组23.26%±4.86%,HuH-7组14.21%±3.92%。通过单因素方差分析统计,三组细胞株凋亡率差异有统计学意义(F=34.219,P<0.001),表明三组间细胞计数差异不同或不完全相同,进一步组间两两比较q检验:三组细胞凋亡率在不同栏,表明P值均<0.05,说明三组间细胞凋亡率两两比较差异均具有统计学意义。流式细胞仪检测三组细胞株,观察CRNDE低表达对肝癌细胞周期影响,结果显示,shRNA-CRNDE-HuH-7组G1期细胞比例增加,S期和G2期细胞比例减少,相比HuH-7组有明显差异(P<0.05),见图5,说明CRNDE低表达抑制了细胞从G1期向S期和G2期的转变。

图5 流式细胞仪检测下调CRNDE对HuH-7细胞株细胞周期影响(*P<0.05)

3 讨论

CRNDE最早在结直肠恶性肿瘤的研究中被发现存在差异表达,可参与染色质的表观遗传学调控[5]。随着研究的进展,GRNDE被发现可通过多种方式调控肿瘤的进展,尤其是通过调节组蛋白甲基化状态来影响相关基因的转录,影响肿瘤的发生与发展,起到了促进肿瘤增殖的作用[6]。为探究CRNDE对人原发性肝癌细胞的影响,作者对人原发性肝癌细胞(Huh-7细胞株)CRNDE的表达进行RT-qPCR检测,发现对比正常人体肝细胞(HL-7702细胞株),其表达量明显增加。同时,利用质粒转染技术,沉默CRNDE的表达,作者构建了CRNDE低表达的shRNA-CRNDE-HuH-7细胞株,发现其细胞的增殖、迁移及侵袭能力相比Huh-7细胞株明显下降。以上结果均表明CRNDE在人体肝癌中的高表达,促进了肿瘤的发生或发展。

为了进一步探究CRNDE促进肝癌增殖的机制及可能的下游靶基因,作者查阅相关文献,ZHANG C等[7]通过生物信息学预测发现miR-33a-5p可能是CRNDE及CDK6的潜在靶点。为了明确三者之间可能的关系,作者对其进行了相关性分析,结果显示,CRNDE的表达与CDK6呈正相关(P<0.05),而miR-33a-5p与CDK6及CRNDE均存在显著的负相关性(P<0.05),从侧面验证了CRNDE可介导miR-33a-5p/CDK6轴的假说。

CDK6属于细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclindependent kinases,CDKs)家族成员,是细胞周期调控机制的最核心成员之一[8]。近年来,相关研究发现,CDK6在恶性肿瘤中过表达并与多种恶性肿瘤的发生、发展相关,被称为细胞信号传导的“中心节点”。miRNA-33a是一种位于甾醇反应元件结合蛋白基因(sequences of the sterol-response-element-binding protein gene,SREBF2)内含子序列中的内含子miRNA,在肿瘤的发生、发展中发挥着重要的作用。WU等[9]发现,在乳腺癌组织中,miRNA-33a的下调与淋巴转移有关,其过表达可显著降低细胞增殖和侵袭,抑制肿瘤生长和肺转移。HAN等[10]也发现,miRNA-33a-5p的下调与HCC转移和生存不良显著相关,低表达的miRNA-33a-5p预示较低的5年生存率及早期复发率。本研究结果也支持上述观点,miRNA-33a-5p的表达在HL-7702、shRNACRNDE-HuH-7及HL-7702三组细胞株中逐渐下调,差异有统计学意义(P<0.05),而在CCK8、Transwell及流式细胞仪等检测中,此三组细胞株的增殖、迁移、侵袭能力却逐步增强,说明miRNA-33a-5p的低表达与人原发性肝癌的进展及预后密切相关。

本研究中RT-qPCR及Western blotting结果显示,Huh-7细胞株中miR-33a-5p为低表达,而通过慢病毒转染CRNDE低表达的shRNA-CRNDE-HuH-7细胞株及HL-7702细胞株中miR-33a-5p的表达却显著上调(P<0.05)。同时有研究[11]显示,在人结直肠癌细胞双荧光酶素实验中,CRNDE与miR-33a-5p能有效结合,抑制肿瘤增殖,使野生型CRNDE结合的荧光信号显著降低,这与本研究中通过质粒转染沉默Huh-7细胞株CRNDE的效果相同。为了进一步验证 miR-33a-5p与CDK6 间存在靶向关系。本研究通过RT-qPCR及Western blotting检测,结果显示Huh-7细胞株中CDK6的表达显著升高,而沉默CRNDE或过表达miR-33a-5p后的shRNA-CRNDE-HuH-7及HL-7702细胞株中CDK6的表达逐级下调,差异有统计学意义(P<0.05),说明CRNDE是miRNA-33a-5p的上游基因,而CDK6处于CRNDE及miR-33a-5p的下游,且miR-33a-5p与CDK6间存在靶向关系。

综上所述,CRNDE能通过靶向调节作用抑制miR-33a-5p的表达,进而介导CDK6的升高,可能通过CRNDE/miRNA-33a-5p/CDK6轴促进肝癌增殖,其肿瘤生物学行为主要表现在影响肿瘤细胞周期的增殖调控上。作者预测CRNDE很可能成为人体肝细胞肝癌新的肿瘤标志物和分子生物治疗靶点。

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