晚期NSCLC中EGFR基因突变状态与PD-L1蛋白表达的相关性分析

尹志东 孔维珂 程路

肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是其最常见类型。晚期NSCLC患者主要依赖药物维持生存期，针对存在表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）突变的晚期患者一般采用分子靶向治疗，但通常1年左右会产生耐药。近年来，对NSCLC非手术治疗的研究热点正趋于由靶向治疗逐步转向免疫治疗。针对免疫检查点程序性死亡分子1（programmed death-1，PD-1）及其配体1（prograrmrled death ligand-1，PDL1）的免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors，ICIs）是晚期肺癌治疗的新进展。有文献揭示了PD-1/PD-L1通路与EGFR通路存在相互作用，既往有研究显示EGFR基因突变的患者接受ICIs治疗后生存期及存活率并未显著提高［1］。本研究主要探讨晚期NSCLC组织中EGFR基因突变与PD-L1蛋白表达及临床病理特征之间的关系，希望在肺癌的个体化治疗及预后评估方面能提供更多的参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2019年7月至2021年12月浙江大学医学院附属第二医院滨江院区病理科已确诊晚期非小细胞肺癌（NSCLC）病例74例。其中男50例，女24例；年龄33～88岁，平均年龄60.5岁；≥70岁38例，＜70岁36例；有吸烟史35例，无吸烟史39例；肿瘤细胞低分化25例，非低分化49例，肿瘤类型腺癌59例，非腺癌15例；TNM分期III期22例，IV期52例；远处转移骨转移35例，脑转移12例，肝转移6例，肾上腺转移6例等。

1.2 实验材料及仪器 NSCLC石蜡组织样本，核酸提取试剂盒（艾德生物），无水乙醇，二甲苯，恒温加热器，离心机，涡旋混合仪，紫外分光光度计，荧光PCR法人类EGFR基因外显子突变18-21检测试剂盒（艾德生物），SLAN全自动医用PCR分析仪，电脑，免疫组织化学法PD-L1（艾德生物），Leica BAND-III全自动染色机，75%、85%和95%乙醇，中性树胶，盖玻片，显微镜等。

1.3 荧光定量PCR法检测EGFR基因突变 取经过HE片评估后的NSCLC石蜡组织进行离心管脱蜡，根据艾德生物核酸提取试剂盒的操作方法和步骤进行组织裂解和DNA的提取。用微量紫外分光光度计测定DNA的浓度，需保证DNA浓度＞2 ng/μL且DNA的OD260/OD280应介于1.8～2.1。检测前，将样本的DNA浓度稀释至1.5～3 ng/μL，根据艾德生物荧光PCR法人类EGFR基因外显子突变18-21检测试剂盒的检验方法和步骤加好PCR反应板，之后采用SLAN全自动医用PCR分析仪进行上机检测。检测时设立阳性对照、阴性对照和空白对照。根据说明书上提供的PCR反应曲线和Ct值进行结果判定。

1.4 免疫组织化学法检测PD-L1蛋白表达 切取厚度3～5 μm已选好的NSCLC石蜡组织样本，将其粘附于阳离子防脱玻片上，玻片置于68 ℃烤片机上烤片1 h，以制成石蜡切片。玻片采用Leica BAND-III全自动染色机进行免疫组化染色，染色机主要经过脱蜡、抗原修复、封闭、一抗、二抗、显色、复染、清洗等步骤。上机时设置阳性对照、阴性对照和空白对照。下机后进行组织玻片的脱水和封片。病理医生对免疫组织化学检测结果进行判读及肿瘤细胞阳性比例（TPS）评分，PD-L1着色于肿瘤细胞的细胞膜。肿瘤细胞染色结果：TPS＜1%为阴性（不表达），即＜1%的肿瘤细胞膜呈现不同程度的着色或完全无着色；TPS≥1%为阳性（表达），即≥1%的肿瘤细胞膜呈现不同程度的着色或完全着色。其中TPS处于1%～49%为弱阳性（低表达），TPS≥50%为强阳性（高表达）。

1.5 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件。计数资料以n或%表示，组间比较采用χ2检验，EGFR基因突变状态与PD-L1表达情况的相关性分析采用Pearson相关分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 晚期NSCLC中EGFR基因突变状态与临床病理特征的关系 在晚期NSCLC患者中，EGFR基因突变率为43.24%（32/74），其中有17例患者EGFR基因第19个外显子发生突变，12例患者EGFR基因第21个外显子发生突变，2例患者EGFR基因第20个外显子发生突变，1例患者EGFR基因第20个外显子和第21个外显子均发生突变。EGFR基因突变状态与临床病理特征的关系结果如下：IV期肺癌和腺癌患者的突变率较高（P=0.02和0.042），无吸烟史、肿瘤细胞低分化、女性和脑转移患者更倾向于具有较高的EGFR突变率（P值分别为0.052、0.163、0.189和0.074），突变率与患者年龄和骨转移情况均无关（P＞0.05，表1）。

表1 晚期NSCLC中EGFR突变和PD-L1表达与临床病理特征的关系（n）

2.2 晚期NSCLC中PD-L1表达情况与临床病理特征的关系 在晚期NSCLC患者中，肿瘤细胞TPS评分≥1%的患者占比率为60.81%（45/74），其中TPS评分介于1%～＜50%之间的占比率为71.11%（32/45），TPS评分≥50%的占比率为28.89%（13/45）（见图1）。肿瘤细胞低分化患者更倾向于具有较高的PD-L1表达率（P=0.159），PD-L1阳性表达率与患者年龄、性别、吸烟史、肿瘤类型、TNM分期、骨转移、脑转移均无明显相关性（P＞0.05，表1）。

图1 晚期NSCLC中PD-L1的表达情况（×200）。注：A. 肺鳞癌的HE染色；B. PD-L1阴性的肺鳞癌病例；C.PD-L1低表达的肺鳞癌病例；D. PD-L1高表达的肺鳞癌病例；E. 肺腺癌的HE染色；F. PD-L1阴性的肺腺癌病例；G. PD-L1低表达的肺腺癌病例；H. PD-L1高表达的肺腺癌病例

2.3 晚期NSCLC中EGFR突变与PD-L1表达的相关性 晚期NSCLC中，EGFR呈现为野生型PD-L1阴性者12例，EGFR呈现为野生型PD-L1阳性者30例，EGFR突变PD-L1阴性者17例，EGFR突变PD-L1阳性者15例；EGFR呈现为野生型PD-L1弱阳性者20例，EGFR呈现为野生型PD-L1强阳性者10例，EGFR突变PD-L1弱阳性者12例，EGFR突变PD-L1强阳性者3例。EGFR突变状态与PD-L1表达情况存在负相关（r=-0.249，P=0.032），EGFR基因突变状态与PD-L1阳性强弱程度无相关性（P＞0.05，表2）。

表2 晚期NSCLC中EGFR突变与PD-L1表达的相关性分析

3 讨论

肺癌是起源于肺部支气管黏膜或腺体的恶性肿瘤，是全球癌症相关死亡的首要原因，其发病率和死亡率均较高。NSCLC包括鳞癌、腺癌、大细胞癌，约占肺癌总数的80%以上，其绝大多数患者发现时已处于中晚期，无法手术，其5年生存率较低，系统化疗和放疗的作用也有限［2-4］。手术治疗是NSCLC患者的首选治疗，对于已失去手术机会的患者，其治疗的首要目标是延长生存期，提高生存质量，尽量争取带瘤长期生存。以吉非替尼、厄洛替尼、奥希替尼等为代表的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs）是EGFR基因突变的晚期肺癌患者分子靶向治疗的标准一线治疗方案，客观缓解率可＞70%，但通常1年左右患者会产生耐药［3-4］。免疫治疗是近年来NSCLC非手术治疗的研究热点，针对PD-1/PD-L1的免疫检查点抑制剂是晚期肺癌治疗的新进展，尤其对肿瘤细胞PD-L1高表达的进展期NSCLC患者更有益，如帕博利珠单抗，相比以铂类为基础的化疗，其可显著延长患者无进展生存期和总生存期且不良反应发生率较低［5］。

EGFR是上皮生长因子细胞增殖和信号传导的受体，是一种跨膜糖蛋白，属于酪氨酸激酶受体。当人体EGFR基因发生缺失、突变或重排时，EGFR可出现异常表达或高表达，其与肿瘤细胞的增殖、肿瘤血管的生成、肿瘤的浸润和转移、肿瘤的化疗抗性和预后密切相关［6］。EGFR基因位于人体第7号染色体短臂上，有28个外显子。NSCLC患者EGFR基因突变可发生于很多位点，常见位点主要位于酪氨酸激酶区18～21外显子上，其中19和21号外显子突变占EGFR突变的90%以上［7］。有相关研究显示，EGFR在NSCLC中的突变率存在较大地域差异性，亚洲人群远超非亚洲人群，突变率高达50%［8］。本次研究EGFR突变率为43.24%（32/74），其中19和21外显子突变率占93.75（30/32）。国内既往研究表明，EGFR基因突变与非吸烟女性肺腺癌患者密切相关［9］。本次研究表明IV期肺癌和腺癌患者的突变率较高（P=0.02和0.042），无吸烟史、肿瘤细胞低分化、女性和脑转移患者更倾向于具有较高的EGFR突变率（P=0.052、0.163、0.189和0.074），EGFR基因突变率与患者年龄和骨转移情况均无关。

PD-1是免疫球蛋白B7-CD28家族成员之一，主要在T细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞（natural kiiller，NK）、树突状细胞、单核-巨噬细胞等肿瘤浸润性淋巴结细胞上表达［10］。PD-L1又称B7-H1或CD274，是PD-1的主要配体。PD-L1与PD-1相结合，传递免疫抑制信号，抑制T细胞的活化和增殖，通过免疫逃逸、抑制免疫应答、逃避杀伤清除机制，增强肿瘤微环境对机体正常免疫的抵抗作用［11］。2016年免疫检查点抑制剂PD-1抗体Pembrolizumab 获批成为晚期NSCLC的一线治疗用药，用药效果与PD-L1的表达水平相关。目前关于PD-L1在NSCLC中表达的异质性研究相对较少，尤其是与临床病理特征和分子特征之间的相关性方面，结论有着较大的矛盾，其中PD-L1在NSCLC 中的阳性率为39.9%～53.1%［12］。本次研究PD-L1的阳性表达占60.81%（45/74），其中TPS评分介于1%～49%的占比为71.11%（32/45），TPS评分≥50%的患者占比为28.89%（13/45），肿瘤细胞低分化患者更倾向于具有较高的PD-L1表达率（P=0.159），晚期NSCLC患者中PD-L1阳性表达率与患者年龄、性别、吸烟史、肿瘤类型、TNM分期、骨转移、脑转移均无明显相关性。

目前，对NSCLC患者的EGFR突变与PD-L1表达的相关性研究结果存在差异性［13］。本次研究中EGFR基因突变阳性的患者PD-L1阳性表达率低（P=0.032），患者的EGFR基因突变状态与PD-L1阳性表达的高低无关（P＞0.05）。EGFR基因突变状态与PD-L1阳性表达存在负相关（r=-0.249，P=0.032），EGFR基因突变状态与PD-L1阳性强弱程度无相关性。

本次研究是回顾性研究，受限于本研究的病例数较少，上述部分结果未达到预设的统计学差异，未来作者将纳入更多的病例用于进一步探究EGFR基因突变状态与PD-L1蛋白表达情况和上述临床特征的相关性。本研究分析发现，VI期不吸烟腺癌患者更易发生EGFR基因突变，患者的EGFR基因突变状态与PD-L1蛋白表达存在负相关性。提示在NSCLC的发生和发展过程中EGFR和PD-L1之间可能存在相关作用，希望可以为晚期NSCLC患者的靶向或免疫治疗及临床药物实验方面提供新思路。