不同初加工方法对滇龙胆药材品质的影响

2023-09-19金鹏程李林玉

安徽农业科学 2023年17期

杨雁,金鹏程,李林玉,杨斌,王馨,金航

(云南省农业科学院药用植物研究所,云南昆明 650200)

滇龙胆(GentianarigescensFranch.)为龙胆科(Gentianaceae)龙胆属(Gentiana)多年生草本植物,以根和根茎入药,性苦寒,归肝胆经,具有清热燥湿、泻肝胆火的功效[1],是我国常用大宗药材,具有悠久的药用历史,为历版《中华人民共和国药典》(以下简称《药典》)收载的龙胆基原植物之一,是我国传统中药复方龙胆泻肝丸、龙胆泻肝片等180多种中成药的主要原料[2]。赵志莲等[3-4]研究表明,龙胆属药用植物的主要活性成分是环烯醚萜类,其中龙胆苦苷、马钱苷酸、獐牙菜苦苷和当药苷是其主要药效成分,是滇龙胆质量评价的重要指标[5-8]。产地初加工方法是影响中药材品质形成的关键因素,决定了中药材、中药饮片及制剂的质量[9],是影响中药临床应用安全性和有效性的一项源头性工序[10]。药用植物在采收后会发生细胞缩水、破裂、变性、酶解、后熟、干燥等变化,根据药材性质和商品销售、运输和保管的要求,对中药材进行去除非药用部位、清洗、干燥等产地初加工,防止其霉变虫蛀,便于运输储存,保障中药材质量[9]。因此科学合理的产地初加工方法至关重要。

不同的产地初加工方法直接影响药材的质量,罗寅珠等[11]研究发现半夏药材晒干处理后外观性状较好、密度高,质坚实,药效成分含量整体较高;刘勇等[12]研究发现阴干法处理后的三七药材质地坚实,内部结构紧密,外观性状较好,并且药效成分含量较高。传统本草记载滇龙胆药材产地加工方法多为采后阴干[13-15],但当前滇龙胆人工种植面积较大,阴干场地和天气原因极大地限制了滇龙胆产地加工规模化发展。近年来,已有学者开展了滇龙胆产地加工研究,吴昕怡等[16]采用热烫的方法对滇龙胆进行加工处理,发现热烫处理后滇龙胆中3种有效成分的OD值呈先升高后降低的趋势;刘秀嶶等[17]研究了不同光质对滇龙胆药材干燥品质的影响,结果显示绿光能降低滇龙胆水分含量,并且显著提高其龙胆苦苷、獐牙菜苦苷和马钱苷酸的含量;沈涛等[18-21]对滇龙胆适生区范围和生物气候特征进行研究,以期为野生滇龙胆资源保护、持续利用与产地鉴别提供依据。但此类研究多是围绕滇龙胆资源分布、化学成分、药理作用、产地鉴别等方面开展,有关滇龙胆产地初加工方法的研究不多,很多加工方法并未结合生产实际,推广应用性不强,且在加工后药材整体质量评价方面研究较少。为探索不同加工方法对滇龙胆药材质量的影响,该研究采用9种不同的产地初加工方法,以滇龙胆的根及根茎为研究对象,测定干燥后滇龙胆样品中龙胆苦苷、马钱苷酸、獐牙菜苦苷和当药苷含量,以及总灰分、酸不溶性灰分和浸出物等指标,依据《药典》,对样品进行综合评价,以期为滇龙胆产地初加工规范化研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1试材。试验用新鲜滇龙胆药材样品,于2021年12月采自临沧市云县茂兰镇,经云南省农业科学院药用植物研究所金航研究员鉴定为龙胆科(Gentianaceae)龙胆属(Gentiana)植物滇龙胆(GentianarigescensFranch.)。

1.1.2仪器。ThermoFisher高效液相色谱仪UltiMate 3000系列(LPG-3400SD泵,WPS-3000SL全自动进样器,DAD-3000紫外可见检测器,190～900 nm);万分之一电子分析天平(赛多利斯电子天平);TB-5200DT型超声波清洗仪(天津市泰斯特联创生物技术公司);101-3AB型电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特联创生物技术公司)。

1.1.3试剂。龙胆苦苷、马钱苷酸、獐牙菜苦苷和当药苷对照品均购自上海诗丹德标准技术服务公司,批号分别为9306、9415、3456、7001。甲醇、乙腈(美国Fisher试剂公司);醋酸、磷酸(罗恩试剂公司,色谱纯);水(自制超纯水)。

1.2 试验方法

1.2.1不同初加工方法。采用9种不同初加工方法对样品进行处理,具体方法见表1。

表1 9种不同初加工方法(n=4)

1.2.2总灰分的测定。参照《药典》(2020版)[1]龙胆灰分测定法,测定用样品混合均匀后粉碎过100目筛,取3～5 g置炽灼至恒重的坩埚中,称定重量(准确至0.01 g),逐渐升高温度至500～600 ℃,待样品完全灰化并至恒重,称重,根据残渣重量,计算样品中总灰分的含量(%)。

1.2.3酸不溶性灰分的测定。取“1.2.2”项所得的灰分,加入稀盐酸10 mL至坩埚中,坩埚用表面皿覆盖,放置在水浴上加热10 min,用5 mL热水冲洗表面皿,洗液并入坩埚中,然后用无灰滤纸过滤,坩埚内的残渣用水洗于滤纸上,并洗涤至洗液不显氯化物反应为止。滤渣和滤纸移置同一坩埚中,干燥,炽灼至恒重。根据残渣重量,计算样品中酸不溶性灰分的含量(%)。

1.2.4浸出物的测定。参照《药典》(2020版)[1]龙胆浸出物测定法(通则2201),取样品2～4 g,精密称定,置于 250 mL的锥形瓶中,精密加水100 mL,密塞,称定重量,静置1 h后,连接回流冷凝管,加热至沸腾,并保持微沸1 h。放冷后,取下锥形瓶,密塞,再称定重量,用水补足减少的重量,摇匀后用干燥过滤器过滤,精密量取滤液25 mL,置于已干燥至恒重的蒸发皿中,在水浴上蒸干后,于105 ℃干燥3 h,再置于干燥器中冷却30 min,迅速精密称定重量。以干燥品计算样品中水溶性浸出物的含量(%)。

1.2.5有效成分含量的测定。

1.2.5.1色谱条件。4个有效成分的色谱柱均为Thermo液相色谱柱(AcclaimTM120A C18;250 mm×4.6 mm,5 μm);流速1.000 mL/min;进样量10 μL;柱温30.0 ℃。马钱苷酸流动相为乙腈-0.1%醋酸(9∶91),检测波长254 nm,理论塔板数不低于3 000;龙胆苦苷流动相为甲醇-水(25∶75),检测波长270 nm,理论塔板数不低于3 000;獐牙菜苦苷流动相为甲醇-0.05%磷酸(18∶82),检测波长237 nm,理论塔板数不低于5 000;当药苷流动相为甲醇-水(18∶82),检测波长247 nm,理论塔板数不低于6 000。

1.2.5.2供试品溶液制备。龙胆苦苷、马钱苷酸、獐牙菜苦苷、当药苷的制备分别参照《药典》(2020版)秦艽、龙胆、青叶胆、当药的含量检测方法制备。

1.2.5.3对照品溶液制备。精密称取对照品龙胆苦苷7 mg、马钱苷酸8 mg、獐牙菜苦苷7 mg和当药苷10 mg,分别用适量甲醇定容至25 mL,摇匀,4 ℃避光保存,备用。

1.2.5.4标准曲线绘制。精密量取“1.2.5.3”项下的对照品溶液各5 mL,定容至10 mL容量瓶中,连续等梯度稀释0.5倍6次,得到不同浓度梯度对照品溶液。以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线,计算得出回归方程,结果见表2。

表2 龙胆苦苷、马钱苷酸、獐牙菜苦苷和当药苷标准曲线

1.3 数据分析采用IBM SPSS Statistics 26软件对4种有效成分含量以及总灰分、酸不溶性灰分和浸出物测定结果进行方差分析、聚类分析和主成分分析。

2 结果与分析

2.1 不同干燥温度对滇龙胆有效成分含量的影响该研究设计了7组干燥温度、自然阴干、自然晒干共9个处理。将采收的新鲜滇龙胆按标准进行去杂质、去除非药用部位、清洗等加工步骤,样品混匀后随机分组,每组试验设置4个重复,9个处理的具体方法见表1,分析结果见表3。

表3 不同干燥温度对滇龙胆有效成分含量的影响(n=4)

从表3可以看出,不同干燥温度条件下,40 ℃干燥温度条件下龙胆苦苷含量最高,平均值达9.25%,是《药典》(2020版)规定(龙胆苦苷含量不得少于1.5%)的6.17倍,同时,测定的马钱苷酸、獐牙菜苦苷和当药苷含量也较高;晒干的样品龙胆苦苷含量最低,仅为5.65%,比40 ℃烘干样品龙胆苦苷含量低3.60百分点,但晒干样品的龙胆苦苷含量也达到了《药典》(2020版)规定的最低标准。因此,40 ℃为滇龙胆烘干的最佳温度,在设计不同加工方法中滇龙胆的干燥温度选择40 ℃。

2.2 不同加工方法对滇龙胆总灰分、酸不溶性灰分和浸出物的影响滇龙胆加工过程中,总灰分、酸不溶性灰分和浸出物是《药典》(2020版)中评价药材质量的一个重要指标。从表4可以看出,所有免洗处理(MXYG、WMYG、WMSG、MXSG)样品的总灰分均显著高于水洗样品,其中,免洗阴干(MXYG)处理样品的总灰分最高,为9.08%,是《药典》(2020版)规定(总灰分不得过7.0%)的1.30倍;酸不溶性灰分也是免洗处理样品高于水洗样品,按照《药典》规定酸不溶性灰分不得过3.0%,免洗阴干(MXYG)处理样品的酸不溶性灰分最高,为5.52%,是《药典》(2020版)规定的1.84倍;免洗阴干(MXYG)和微波免洗阴干(WMYG)处理样品的浸出物显著低于其他处理,按照《药典》(2020版)规定的水溶性浸出物不得少于36.0%,免洗阴干(32.40%)和微波免洗阴干(28.17%)处理后的样品达不到《药典》(2020版)标准。水洗烘干(SXHG)处理样品的总灰分、酸不溶性灰分和浸出物均达到了《药典》(2020版)标准。

表4 不同初加工方法对总灰分、酸不溶性灰分和浸出物的影响(n=4)

2.3 不同加工方法对滇龙胆中4种有效成分含量的影响从表5可以看出,不同加工处理方法滇龙胆中4种有效成分含量有一定差异。其中,水洗烘干(SXHG)处理滇龙胆的龙胆苦苷含量最高,为9.25%,是《药典》(2020版)规定(龙胆苦苷含量不得少于1.5%)的6.17倍,免洗微波处理1 min后晒干(WMSG)样品的龙胆苦苷含量最低(4.62%),是《药典》(2020版)标准的3.08倍;水洗烘干(SXHG)处理滇龙胆的马钱苷酸含量也显著高于其他处理;同时,水洗烘干处理的干燥时间最短,仅为12 h,远低于其他处理。

表5 不同初加工方法对滇龙胆有效成分含量的影响(n=4)

2.4 聚类分析对9种不同加工方法处理的36批(n=4)滇龙胆样品进行聚类分析,结果见图1。由图1可知,当临界值在5时,可将加工方法分为4大类,其中,WSYG、SXYG、MXYG处理样品划分为第1类,此类样品龙胆苦苷含量相近;SXHG处理样品单独划分为第2类,此类样品龙胆苦苷含量最高;WMSG处理样品划分为第3类,此类样品龙胆苦苷含量最低;WMYG、WSSG、MXSG和SXSG处理样品划分为第4类,此类样品龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、马钱苷酸和当药苷含量相近。当临界值在10时,可将加工方法分为2大类,其中,WSYG、SXYG、MXYG和SXHG处理样品划分为第1类,此类样品龙胆苦苷含量均在7.0%以上,显著高于其他样品,除前处理方法不同外,加工方法以阴干为主;WMSG、WSSG、SXSG、MXSG和WMYG处理样品划分为第2类,此类样品龙胆苦苷含量低于6.5%,加工方法以晒干为主。

图1 不同加工方法滇龙胆样品聚类分析树状图

2.5 主成分分析用SPSS 26.0对9种不同加工方法处理的36批(n=4)滇龙胆样品中龙胆苦苷、马钱苷酸、獐牙菜苦苷和当药苷含量进行主成分分析。由表6可知,以特征值大于1为提取标准,得到2个主成分(PCA1和PCA2)。PCA1的特征值为1.779,其贡献率最大,方差贡献率为44.464%,由成分的载荷矩阵(表7)可知,龙胆苦苷在主成分1上的载荷值最高,对主成分1贡献较大。PCA2的特征值为1.070,其总方差贡献率为26.746%。前2个主成分的累计方差贡献率达到71.210%,表达全部信息的71.210%。

表6 主成分的特征根及贡献率

表7 成分载荷矩阵

通过SPSS软件处理后得出主成分得分系数(表8),第一主成分贡献最大,其中第一主成分中系数最大的为龙胆苦苷,说明龙胆苦苷在滇龙胆的质量控制中起着重要作用。根据主成分计算公式和主成分得分系数可以算出前2个主成分与4种有效成分的线性组合为:

表8 主成分得分系数

F1=0.588X1+ 0.502X2-0.164X3+0.058X4

F2=-0.175X1+0.113X2+0.759X3+0.500X4

计算主成分综合得分及排序(表9)。由综合得分可知,不同加工方法滇龙胆样品中以水洗烘干(SXHG)综合质量最好;免洗阴干(MXYG)综合质量次之,但该方法加工的样品总灰分和浸出物未达到《药典》标准;水洗阴干(SXYG)在传统生产中农户广泛使用,可根据天气、场地等实际情况在产地加工中作为辅助干燥方法。

表9 不同加工方法滇龙胆药材的主成分因子及品质综合评价

3 讨论

中药材经产地加工后不仅便于药材的运输和储藏,而且不同的产地加工方法对药材品质也有极大影响。中药材产地初加工方法的选择和形成通常是基于原产地习用方法、操作简单、技术要求低、投入较少等原则[12],因此,该研究比较了9种不同产地初加工方法,通过综合评价,结果表明不同产地初加工方法对滇龙胆药材品质有较大影响。传统的免洗阴干和晒干虽然也能较好地保证药材原有性状,干燥成本低,但其耗时较久,所需干燥场地大,受天气等因素影响较大,药材容易发生霉变[22-23],而且未经水洗的药材总灰分、酸不溶性灰分较高,水溶性浸出物较低,未能达到《药典》(2020版)规定标准,因此探索替代传统干燥方法的新技术、新方法成为滇龙胆产地加工的重要任务。

该研究通过选取不同的滇龙胆初加工方法,研究结果发现滇龙胆经水洗后新鲜药材表面的灰尘和杂质都大大减少,药材的外观形态和色泽较未洗过的更佳,并且总灰分、酸不溶性灰分和浸出物均能达到《药典》标准;从有效成分含量测定的结果可以看出,40 ℃烘干能较好地保留滇龙胆中的苷类成分,结合主成分综合评价得分结果、总灰分、酸不溶性灰分和浸出物等指标比较,可知水洗后40 ℃烘干相对来说接近于传统干燥方法,干燥后的样品外观性状好,操作简单,干燥时间短,并且所得样品有效成分含量也较其他加工方法最高。