中药调节GLP-1的分子机制研究进展

钱紫星,陈 俊,2

(1. 湖北中医药大学,湖北 武汉 430061;2. 湖北省中医院,湖北 武汉 430061)

2型糖尿病(T2DM)是常见的慢性代谢性疾病,随着生活水平的提高及生活方式的改变,其发病率逐年升高,成为心脑血管疾病、肾衰竭、神经病变、认知障碍等疾病的重要风险因素[1-2],严重危害人类健康,因此如何有效控制血糖,延缓并发症的发生是治疗T2DM的主要方向。近年来,由肠道内分泌细胞分泌的肠促胰岛素胰高血糖素样肽-1(GLP-1)逐渐进入大众的视野,因其以葡萄糖依赖性的方式促进胰岛素分泌、保护胰岛细胞功能、参与糖脂代谢、抑制食欲、延缓胃排空等作用及特点,成为当下的研究热点,临床上GLP-1受体激动剂已广泛使用。目前大量实验已证实某些中药、中药提取物及中药复方可有效上调GLP-1水平降低血糖,其中部分研究通过探索其干预GLP-1的信号通路揭示了中药降糖作用的分子机制,笔者结合近年来基于促进GLP-1的中药降糖分子机制研究进行综述,以期为中药的临床应用及开发提供依据,为降糖机制研究提供参考。

1 GLP-1生理作用

GLP-1由近端结肠、远端回肠的肠道内分泌L细胞分泌,其特异性受体广泛分布于胰腺、胃肠、心脏、肾脏、垂体等多个器官[3-4],其表达、合成、分泌机制复杂。胰高血糖素原基因(PG)是 GLP-1的前体,在胰腺、肠L细胞及脑中表达,在L细胞中经前激素转化酶1/3(PC1/3)的作用生成GLP-1,另外,膳食摄入特别是一种富含脂肪和碳水化合物的食物,是GLP-1分泌的主要生理刺激因素,可通过相应感应受体激活相关途径促进GLP-1的分泌[3,5]。

当GLP-1与胰岛细胞上的受体结合后,通过激活环磷酸腺苷/蛋白激酶A(cAMP/PKA)途径,使细胞内cAMP浓度升高,促进胰岛素原基因转录和翻译,提高对葡萄糖刺激信号的敏感性,从而促进胰岛素合成与分泌[6-8]。而当血糖低于正常水平时,GLP-1对血糖的抑制作用减弱,不促进胰岛素分泌,避免了低血糖的发生[9]。同时,GLP-1可通过促进胰十二指肠同源基因盒-1(PDX-1)表达活化,促进胰岛B细胞增殖和分化[10-11],并通过上调抗凋亡因子,下调促凋亡因子减少胰岛细胞的凋亡[12-13]。

在胰腺外,GLP-1可直接作用于胃肠或通过调节迷走神经作用于中枢、外周神经系统及胃肠器官,使机体产生饱食感,降低食欲,延缓胃排空,进而减轻体重,调节餐后血糖状态[14]。另外,GLP-1通过调节PI3K/Akt通路对心肌细胞缺氧、应激损伤及凋亡起到拮抗作用,从而发挥其心脏保护作用[15-16]。

2 中药调节GLP-1分泌的分子机制

多项动物实验及临床实验已证实某些中药及复方可通过上调机体GLP-1水平发挥改善胰岛素抵抗、恢复胰岛细胞功能、控制血糖等作用,但是关于其调控GLP-1的分子机制有效通路却只占一小部分,因此如需理解中药降糖机制,应从分子水平进行深入探索。现有研究报道的分子机制复杂多样,证实中药可通过多靶点、多通路调节GLP-1的分泌,现将其影响机制总结如下。

2.1PG/PC1/3 GLP-1由胰高血糖素原(PG/GCG)基因表达,在肠道内分泌L细胞中,PC1/3将PG切割、转录、修饰为GLP-1,因此中药是否能通过干预PG或PC1/3表达影响GLP-1水平值得探究。李俊燕等[17]临床研究发现清化颗粒(黄芩、黄连、葛根)可显著降低糖尿病患者的血糖水平,提高血清GLP-1浓度;动物实验发现清化颗粒可明显提升db/db糖尿病小鼠的血清GLP-1水平,并可显著上调小鼠回肠组织中PG和PC1/3的基因和蛋白表达,并且具有剂量依赖效应,提示清化颗粒可能通过上调PG和PC1/3表达而促进GLP-1分泌。郑延坤等[18]通过黄芩素灌胃2型糖尿病模型小鼠,发现灌药后GLP-1水平明显升高,回肠组织中PG和PC1/3基因表达明显上调,提示黄芩素能够通过此通路促进糖尿病小鼠GLP-1的分泌。为证实黄连有效成分对GLP-1影响及机制,胡茹楠等[19]以NCI-H716细胞为模型,用已证实可以促进GLP-1分泌的盐酸小檗碱(BER)为阳性对照组,发现盐酸药根碱(JAT)、黄连碱(COP)以及高、低浓度BER+COP+JAT均能促进GLP-1的分泌,并且BER+COP+JAT组可通过促进GCG表达,进而在蛋白质水平促进GLP-1的合成,证实了其具有恢复内源性GLP-1的功能。上述研究不仅证实了中药可通过上调GLP-1水平从而发挥降糖效果,更是揭示了其可通过PG/PC1/3通路促进内源性GLP-1的分泌。

2.2cAMP/PKA cAMP由腺苷酸环化酶(AC)催化的三磷酸腺苷(ATP)合成,是GCG编码的效应因子之一,cAMP的升高在GCG转录的激活及其编码的肽激素产生中也发挥了重要作用,其下游效应因子,包括PKA和Epac,在调节GLP-1的分泌中也有重要作用[7]。李俊燕等[20]对清化颗粒的另一项研究发现,清化颗粒干预后可明显增加db/db糖尿病小鼠肠组织cAMP的浓度,降低ATP的浓度,由此推测其促进GLP-1分泌的机制与cAMP通路相关,但是否能提升PKA或Epac浓度未进行进一步的研究。刘云西[21]分别进行体内动物模型实验究及体外实验,在基础状态下及病理状态下探究水菖蒲乙酸乙酯(ACE)对NCI-H716细胞GLP-1分泌的分子机制,体内实验显示ACE可明显增加葡萄糖刺激的血浆GLP-1水平,并伴随着GCG、PG1/3表达的增加,体外细胞实验发现生理及病理状态下ACE均可增加cAMP水平及其下游蛋白PKA的磷酸化水平,从而促进GLP-1分泌。

2.3Wnt信号通路 Wnt信号转导通路参与调节细胞的增殖、分化、迁移及凋亡等生物学过程,其中β-catenin蛋白是Wnt信号通路上的关键分子,β-catenin蛋白入核是激活Wnt/β-catenin通路的关键[22]。该通路的异常调控与肿瘤、肥胖、糖尿病、骨骼疾病、神经退行性疾病等存在密切联系[23]。研究证实Wnt信号通路可影响GLP-1的产生,该通路可通过两个关键效应子β-cat和TCF7L2,上调GCG mRNA表达和GLP-1在肠道内分泌L细胞中的产生[24-26]。邓姝颖等[27]发现,在枸杞多糖(LBP)的干预下,STC-1细胞核和细胞质中β-catenin的表达上调,并且随着干预浓度的增加,核转位愈发明显,转录因子TCF7L2与β-catenin的结合能力增强,GCG 基因和GLP-1的表达增加,表明LBP可通过激活调节Wnt信号通路,增加β-catenin 蛋白的分泌,进而促进GCG基因的表达,上调GLP-1的水平。刘云西[21]的实验研究亦发现ACE可促进β-catenin在核内的蛋白水平,减少其胞浆内水平,并增加该信号通路下游基因Cyclin D的蛋白水平,可见水菖蒲可通过多信号通路促进GLP-1分泌。

2.4GPCRs/GLP-1 G蛋白偶联受体(GPCRs)是人体中最大的膜蛋白家族,可通过胞外信号分子激活,与下游效应蛋白相互作用,完成信号转导,从而影响人体的生理活动。部分G蛋白偶联受体如GPR119、GPR40、GPR120等已证实可以引起cAMP升高,PKA活化,促进GLP-1的分泌,近年来,以G蛋白偶联受体为靶的抗糖尿病药物的研发成为新的热点[28-29]。葛根芩连汤是经方运用于治疗2型糖尿病的典型代表,陈俊等[30]以不同浓度葛根芩连汤含药血清培养NCI-H716细胞,不同浓度葛根芩连汤均可显著提高GLP-1、cAMP浓度,上调GLP-1和GPR119基因的表达,表明葛根芩连汤的降糖作用可能与其激活GPR119-cAMP-GLP-1通路有关。刘文科[31]对清热降浊方(黄连、苦瓜、知母、苦参、酸枣仁等)及黄连素促进GLP-1分泌作用进行体外试验观察,发现经清热降浊方或黄连素干预后,细胞上清液中GLP-1含量显著增加,并且随着葡萄糖浓度的增高,GPR119及cAMP分泌量也明显增加,其水平与葡萄糖浓度呈正相关,这表明清热降浊方及其主要成分黄连素可能对GPR119通路具有调控作用。

2.5肠道菌群/SCFAs/GLP-1和肠道菌群/BA/GLP-1 短链脂肪酸(SCFAs)由肠道菌群通过发酵膳食纤维产生,主要包括丁酸、丙酸和乙酸等,SCFAs中丙酸、丁酸可与GPR41和GPR43作用,促进GLP-1和酪酪肽(PYY)等肠道激素分泌[32];胆汁酸(BA)可通过法尼醇X受体(FXR)和G蛋白偶联受体5(TGR5)调节脂质、葡萄糖、能量代谢和炎症反应,肠道菌群通过胆汁酸代谢,作用于靶点TGR5,促使cAMP水平升高,进而GLP-1分泌增加[33-36]。穆国华[37]抓住2型糖尿病“火热”病机及“补肾水阴寒之需”治疗之要,以交泰丸组成黄连-肉桂药对为研究对象,以肠道菌群及胆汁酸代谢途径为研究方向进行动物实验,发现黄连-肉桂能够影响db/db小鼠肠道菌群的分布,提高TGR-5、GLP-1的表达,表明此药对可以通过改善小肠状态,修复其屏障功能,同时作用于BA/TGR5/GLP-1信号通路发挥治疗糖尿病的作用。黄连素的降糖、改善肠道菌群作用均已得到实验证实,为研究其相关性及作用机制,夏敬胜等[38]以小、大剂量黄连素分别灌胃2型糖尿病大鼠模型,以利拉鲁肽药物组为阳性组,结果显示小、大剂量黄连素组均明显增加梭杆菌属以及乳酸杆菌属含量,显著增加糖尿病大鼠GPR43、TGR5、GCG及PC1/3 mRNA的表达,增加糖尿病大鼠血清GLP-1、GLP-1R mRNA及GLP-1蛋白表达,表明黄连素可能通过肠道菌群的代谢产物SCFAs以及BA的作用,激活GPR43、TGR5活性,上调GCG及PC1/3表达,从而促进GLP-1分泌。为探究逍遥散通过调节糖代谢抗抑郁的作用靶点,宋美芳[39]以肝郁脾虚型抑郁症大鼠为模型,给药组分别用逍遥散和氟西汀治疗,结果显示逍遥散组大鼠结肠和肝组织中TGR5、GLP-1的蛋白表达量增高,证实逍遥散可通过激活BA-TGR5-GLP-1通路调节葡萄糖代谢来发挥抗抑郁作用,然而此研究未进行上游信号分子胆汁酸浓度的测定,此机制能否运用于2型糖尿病的治疗值得进一步探究。Le等[40]研究发现番泻叶苷A(SA)作用于通过膳食补充剂在高脂肪饮食(HFD)诱导的肥胖小鼠,可有效改善肥胖和高血脂症,修复结肠黏膜结构,调节肠道微生物群,恢复SCFAs,促进GPR43和GPR41生成,上调GLP-1表达,纠正线粒体功能障碍,表明SA可能通过影响肠道菌群/SCFAs/GLP-1轴发挥其作用。

另有研究显示,桑枝总生物碱(SZ-A)可调节粪便中菌群多样性及组成比例,使促进短链脂肪酸生成的菌种显著增加,上调PG及GLP-1的表达发挥其抗糖尿病作用[41];参芪复方可调节增加产丁酸菌的相对丰度,促进GLP-1的分泌[42],但关于其中间作用机制仍需进一步深入。

2.6味觉受体/GLP-1 研究发现,苦味中药可通过激活肠道内分泌L细胞苦味感受受体(TAS2R)刺激GLP-1分泌。肠道上TAS2R受到苦味刺激物后并与其结合,激活α-味导素(Gαgust)及磷脂酶C(PLC)通路和磷酸二酯酶(PDE)通路,促进三磷酸肌醇(IP3)生成,刺激细胞内Ca2+释放,进而诱导GLP-1的分泌,从而调节血糖[43-45]。 郭舜等[46]基于肠苦味受体途径,利用小鼠肠分泌细胞株(STC-1)探索苦参碱促进GLP-1分泌的机制,发现苦参碱可抑制STC-1细胞增殖,并具有浓度和时间依赖性;苦参碱中、高剂量组可显著升高STC-1细胞内IP3含量及游离钙离子的浓度,高剂量组可明显升高Gαgust表达,同时PLC-β2蛋白表达水平也呈现增加的趋势,表明苦参碱可通过激活肠上苦味受体/Gαgust/PLC-β2/IP3途径刺激GLP-1分泌。Yu等[47]研究发现小檗碱孵育后的NCI-H716细胞GLP-1分泌显著增加,但其作用被TAS2R38抗体浓度依赖性抑制,不同浓度小檗碱(100,200 mmol/L)孵育均增强NCI-H716细胞中TAS2R38蛋白表达,但两种浓度间无明显差异。另外进一步用siRNA敲除NCI-H716细胞TAS2R38后,小檗碱组GLP-1分泌减少,同时PLC抑制剂U73122可浓度依赖性地抑制小檗碱介导的GLP-1分泌,表明小檗碱可作用于肠道TAS2R,并调控PLC通路从而促进GLP-1的分泌[48]。Yue等[49]研究也印证了小檗碱诱导的GLP-1从肠内分泌细胞释放通过苦味受体激活的过程以PLC依赖性方式调节。刘珍秀等[50]研究发现,清化颗粒方低、中、高剂量均能上调db/db糖尿病小鼠肠道TAS2Rs7、TAS2Rs9、TAS2Rs38的基因表达和回肠PDE1A蛋白的表达,该复方可能通过PDE通路刺激小鼠肠道内分泌细胞分泌GLP-1。

2.7葡萄糖转运蛋白/GLP-1 人体内由葡萄糖转运蛋白(GLUTs)及钠/葡萄糖协同转运蛋白(SGLTs)共同参与调节体内葡萄糖稳态。GLUTs是一类调控葡萄糖入胞的跨膜蛋白,主要参与机体能量供给、糖代谢稳态调节等过程,其包括多个亚型,如GLUT-2、GLUT-4等[51]。SGLTs主要在肠道及肾脏中表达,负责肠道中的活性葡萄糖和半乳糖吸收以及肾脏中的葡萄糖重吸收,常见亚型有SGLT1、SGLT2等[52-53]。目前SGLT2抑制剂如达格列净、恩格列净等已广泛运用于临床。现有实验表明SGLT1和GLUT2在小肠中参与了GLP-1的葡萄糖依赖性刺激和GIP分泌,其作用机制可能与甜味受体T1R2/T1R3的活化、ATP、Ca+通道等密切相关[54-55]。 小檗碱已被证实具有促进GLP-1分泌的作用,为探索其机制,杨欣妤等[56]以肠道L细胞的葡萄糖转运体为研究对象,发现小檗碱10,50 μmol/L可使STC-1细胞葡萄糖消耗率显著增加,并可显著升高SGLT1 mRNA表达,并且50 μmol/L小檗碱可显著上调SGLT1蛋白表达,而各组对GLUT2 mRNA及GLUT2蛋白表达无明显作用。结果证实小檗碱可通过上调SGLT1表达促进葡萄糖转运,进一步增强肠道L细胞感应葡萄糖,从而促进GLP-1的分泌,而对GLUT2无明显影响。该实验日后可通过研究敲除SGLT1后小檗碱对GLP-1的影响进行更深入的探索。李俊燕等[57-58]在对清化颗粒的进一步研究实验中发现,与模型组(0.9%氯化钠溶液)相比,清化颗粒可显著上调GLP-1水平,并且清化颗粒低、中、高剂量组db/db回肠组织中的SGLT1 mRNA的相对表达量分别增加31.5%、51.2%、60.6%,并可明显上调SGLT1蛋白的相对表达量;另有实验发现清化颗粒各剂量组均可显著上升调GLUT2 mRNA和蛋白的表达水平,因此两项研究证实清化颗粒可能通过影响GLUT2、SGLT1的表达来促进GLP-1的分泌,但该通路的中间分子机制值得进一步深入。

3 小 结

随着对糖尿病的深入了解及GLP-1的深入研究,目前众多GLP-1受体激动剂如利拉鲁肽、度拉糖肽、司美格鲁肽等已运用于临床并取得了显著的疗效,因此基于促进GLP-1研究中药的降糖作用机制为临床运用提供了良好的理论依据。综合上述众多研究可以发现,促进GLP-1分泌的中药及复方中黄芩、黄连出现频率较高,并以苦味药物为多,具有清热燥湿、泻火存阴之功,与仝小林教授所认为2型糖尿病“中满内热”的基本病机不谋而合[59]。另外多种药物可通过多个通路促进GLP-1分泌,并且除了上述作用机制外,中药能否通过其余途径促进GLP-1的分泌或激活GLP-1受体或激活其下游通路如cAMP/PKA、PKA/PDX-1、PI3K/Akt等表达亦值得深入研究,进一步探索中药多靶点、多途径的降糖作用。需要注意临床运用中药治疗2型糖尿病不可拘泥于机制通路,应结合中医辨证,补泻结合,防止药性伤人。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。