贵州引进6个柑橘品种的有机酸组分和含量差异

李文云, 林 乾, 王小柯, 罗 怿, 李金强

(贵州省果树科学研究所, 贵州 贵阳 550006)

0 引言

【研究意义】柑橘果实酸甜可口、风味浓郁、馥郁芳香,其中有机酸在感官品质中发挥重要作用,是评价果实营养和感官特性的重要指标。有机酸不仅参与光合作用、呼吸作用,还参与酯类、氨基酸、酚类和芳香类物质的代谢[1],影响果实贮藏性和货架期,被广泛应用于食品、制药和生物材料行业[2-3]。柑橘新品种引进是品种结构调整和优势区域布局的重要环节,而品质分析和评价是新品种引进和生态适应性评价的重要内容。因此,测定分析明确引进柑橘品种的品质特征,对引进地推广应用具有重要的指导作用。【前人研究进展】果实有机酸组成和含量除受遗传因素影响外,还受温度、水分、光照强度环境条件和栽培技术等多个内在和外在因素的影响,使不同品种间有机酸含量和组成存在差异。姚改芳等[4]利用高效液相色谱法(HPLC)检测98个梨种质资源果实有机酸含量表明,在西洋梨中,63.16%的品种是柠檬酸优势型;在秋子梨中,94.74%的品种属于苹果酸优势型;在白梨、砂梨和新疆梨中,20.00%～22.22%的品种属于柠檬酸优势型。赵爱玲等[5]以219份枣种质脆熟期果实为试材,采用HPLC对7种有机酸进行分析表明,90.41%种质为苹果酸优势型,9.58%种质为奎宁酸优势型。此外,柠檬果实不同组织间也存在较大差异,如果肉和囊衣以积累柠檬酸为主,而黄皮层和白皮层以奎宁酸为主[6]。因此,受品种、环境条件和栽培技术等影响,不同产区果实有机酸含量和组成存在较大差异。【研究切入点】沃柑、大雅、纽荷尔、春见、晚熟8号血橙和濑户见为贵州省果树科学研究所引进种植的6个柑橘新品种,目前尚求购未见该6个引进品种的品质分析和评价相关研究报道。【拟解决的关键问题】利用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS)法,对上述6个柑橘品种成熟果实进行有机酸检测,分析品种间有机酸组成和含量差异,为引进种植的柑橘品质评价提供基础数据,并为贵州省柑橘品种结构调整提供决策参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 柑橘品种 6个柑橘品种分别为沃柑(WG)、大雅(DY)、纽荷尔(NHE)、春见(CJ)、晚熟8号血橙(XC)和濑户见(LHJ),贵州省果树科学研究所于2017年定植于德江县龙泉乡,砧木为香橙,栽培管理条件一致。在果实商品成熟期,选择长势良好、无病虫的植株3株,在树冠外围不同方位随机采摘健康、无病虫的果实带回实验室,用蒸馏水将果面清洗干净,擦拭果面水分,将果实随机分成3组,设置3次生物学重复,分离果肉迅速用液氮速冻,置于—80 ℃超低温冰箱保存待测。纽荷尔和晚熟8号血橙分别于2020年11月和2021年4月采样,其他品种均于2021年2月采样。

1.1.2 试剂与仪器 试剂:甲醇和甲酸(Thermo Fisher)均为分析纯,共16种标准品,反丁烯二酸和泛酸购于国药集团,苹果酸、顺丁烯二酸、柠檬酸、丙二酸、戊二酸、琥珀酸、3-羟基-3-甲基戊二酸购于TCI[梯希爱(上海)化成工业发展有限公司],葡萄糖醛酸购于沃凯生物科技有限公司,酒石酸购于上海羽朵生物科技有限公司,L-焦谷氨酸购于阿拉丁试剂有限公司,乙基丙二酸、苯丙酮酸和辛二酸购于上海源叶生物科技有限公司,DL-3-苯基乳酸购于西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。

仪器:Waters UPLC液相仪(Waters ACQUITY UPLC,沃特世科技有限公司)配置AB 4000三重四极杆质谱仪(AB 4000),涡旋仪(QILINBEIER QL866,其林贝尔仪器制造有限公司),冷冻离心机(湘仪,H1850R,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)。

1.2 有机酸提取及检测

准确称取50mg果肉样品置于2 mL离心管中,向离心管中加入0.5 mL 30%甲醇水溶液(含0.1%甲酸),加入100 mg玻璃珠,55 Hz研磨1 min,重复2次; 12 000 r/min 、4 ℃离心10 min,取上清液过0.22 μm微孔滤膜于上样瓶中[7]进行有机酸检测。

检测色谱条件:色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18(4.6×150 mm,5 μm,Agilent公司),进样量5 μL,柱温40 ℃,流动相A-水(含0.1%甲酸),B-甲醇水(含0.1%甲酸)。梯度洗脱条件:0～3 min,30% B;3～5 min,30%～50% B;5～7 min,50%～90% B;7～9 min,90% B;9～13 min,30% B。流速0.4 mL/min。质谱条件:电喷雾电离(ESI)源,负离子电离模式。离子源温度500 ℃,离子源电压4 500 V,碰撞气6 psi,气帘气30 psi,雾化气和辅助气均为50 psi。采用多重反应监测(MRM)进行扫描[8-9]。

1.3 数据分析

根据标准品出峰时间和标准曲线分别对有机酸进行定性和定量分析。利用 Microsoft Office Excel(Microsoft,Seattle,WA)进行数据统计和作图,利用SPSS进行差异显著性分析。对挥发性物质进行归一化处理后,利用R软件绘制PCA(Principal Components Analysis,主成分分析)图和热图。

2 结果与分析

2.1 不同柑橘品种的有机酸组分及含量

从图1看出,6个柑橘品种中共检测出16种有机酸,其中,柠檬酸含量最高,为1 222.16～1 273.97 μg/g,平均1 240.62 μg/g,相对含量50.77%(WG)～62.53%(XC);其次是苹果酸,为425.00～670.20 μg/g,平均551.90 μg/g,相对含量21.04%(XC)～27.69%(WG);再次是泛酸,为310.55～551.08 μg/g,平均465.63 μg/g,相对含量15.38%(XC)～22.38%(LHJ)。其他13种有机酸平均含量低于15 μg/g,排序依次为琥珀酸(12.46 μg/g)>葡萄糖醛酸(3.55 μg/g)>顺丁烯二酸(2.89 μg/g)>反丁烯二酸(2.33 μg/g)>丙二酸(2.13 μg/g)>酒石酸(1.69 μg/g)>L-焦谷氨酸(1.19 μg/g)>3-羟基-3-甲基谷氨酸(0.83 μg/g)>辛二酸(0.27 μg/g)>苯丙酮酸(0.17 μg/g)>乙基丙二酸(0.12 μg/g)>DL-3-苯基乳酸(0.04 μg/g)>戊二酸(0.03 μg/g);相对含量均不足1%。

图1 不同柑橘品种的有机酸含量、相对含量和平均含量

6个柑橘品种的总有机酸含量为2 501.88～2 019.71 μg/g,以NHE最高,XC最低,两者相差482.17 μg/g。各品种总有机酸含量排序依次为NHE(2 501.88 μg/g)>WG(2 420.56 μg/g)>CJ(2 338.11 μg/g)>LHJ(2 226.73 μg/g)>DY(2 206.2 μg/g)>XC(2 019.71 μg/g)。

2.2 不同柑橘品种有机酸组成差异

从图2看出,6个柑橘品种中有机酸含量存在显著差异。柠檬酸含量以NHE最高,达1 273.97 μg/g,显著高于其他品种,其余依次是XC、WG和DY,三者间差异不显著;CJ和LHJ含量显著低于以上4个品种。苹果酸含量依次为WG>NHE>CJ>DY>LHJ>XC,含量最高的WG(670.20 μg/g)是最低XC(425.00 μg/g)的1.58倍,除DY与LHJ间差异不显著外,各品种间差异均达显著水平。泛酸含量依次为NHE>CJ>LHJ>WG>DY>XC,NHE显著高于其余5个品种,CJ与LHJ间差异不显著,均显著高于WG、DY和XC,WG、DY和XC间差异均达显著水平。除柠檬酸、苹果酸和泛酸外的其余13种有机酸中在6个品种间含量差异较大,DL-3-苯基乳酸在XC中未被检测到,辛二酸在WG、DY、NHE、CJ和LHJ中未被检测到,乙基丙二酸在DY、NHE、CJ和XC中未被检测到;不同品种间戊二酸含量差异不显著;琥珀酸含量WG最高,为21.93 μg/g,显著高于其余品种,其次是LHJ,显著高于NHE、XC、DY和CJ,NHE、XC、DY、CJ间差异均达显著水平,含量最高的WG是最低CJ(5.23 μg/g)的4.19倍;顺丁烯二酸和反丁烯二酸含量最高均为WG(4.38 μg/g和4.03 μg/g),均显著高于其余品种,含量最低均为XC(1.79 μg/g和1.58 μg/g),与最高间分别相差2.45倍和2.55倍;葡萄糖醛酸在不同品种的含量顺序为WG>XC>CJ>DY>LHJ>NHE,WG显著高于其余品种,XC、CJ和DY显著高于LHJ和NHE;丙二酸含量NHE(3.70 μg/g)显著高于其余品种,DY最低(1.25 μg/g),差异显著;酒石酸含量为WG>NHE>XC>CJ>LHJ>DY,WG和NHE均显著高于其余品种;L-焦谷氨酸含量为CJ>DY>WG>LHJ>NHE>XC,各品种间差异达显著水平;3-羟基-3-甲基谷氨酸含量WG最高,其次为NHE,均显著高于其他品种;苯丙酮酸含量为WG>LHJ>DY>CJ>NHE>XC,各品种间差异显著。

注:同一有机酸不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.3 不同柑橘品种有机酸主成分和热图分析

主成分图(PCA)用于分析有机酸间含量与品种间关系,实现种质类别的预测,以及检测样品间的重复性优劣。从图3看出,不同品种3个生物学重复均聚类在一起,表明样品重复性较好,数据可靠。6个品种明显分为6组,表明6个样品有机酸存在差异。主成分1(PC1)和主成分2(PC1)可以解释68.9%的方差,其中,主成分1(PC1)解释44.6%的方差,主成分2(PC1)解释24.3%的方差。聚类热图(图4)更直观地将检测到的16种有机酸表达丰度呈现出来,也进一步说明6个品种有机酸存在明显差异。

图3 主成分分析不同柑橘品种有机酸

注:红色表示相对丰度高,蓝色表示相对丰度低。

3 讨论

有机酸是糖酵解、三羧酸循环和糖异生等代谢活动的重要底物,是果实品质形成的物质和能量基础,是评价果实风味、口感、成熟度和耐贮性的重要品质指标[10],对消费者的购买偏好性具有决定性作用。

根据成熟果实有机酸积累特征,将果实分为柠檬酸积累型、苹果酸积累型和酒石酸积累型[11]。大部分园艺作物为柠檬酸积累型和苹果酸积累型,少部分为酒石酸积累型,如柑橘[12-13]、果梅[14]、菠萝[15]等以积累柠檬酸为主,属于柠檬酸积累型;桃[16]、苹果[17]、欧李[18]等以积累苹果酸为主,属于苹果酸积累型;葡萄[19]是酒石酸积累型的典型代表。然而同一类型不同品种间有机酸含量和组成也存在较大的差异,如大部分梨以积累苹果酸为主[20]。李甲明等[21]研究表明,鸭梨×京白梨杂交后代高酸个体(GS-Y14)为苹果酸积累型,低酸个体(DS-Y182)为柠檬酸积累型。张微等[22]在分析普通型和大果型苹果梨不同发育时期果实有机酸组分时也表明,苹果梨按有机酸积累类型可分为柠檬酸型和苹果酸型。研究表明,纽荷尔、沃柑等6个柑橘品种成熟果实均以柠檬酸含量最高,属于柠檬酸积累型,即柠檬酸是6个柑橘品种的特征有机酸,是酸度品质的重要贡献者。虽然6个品种柠檬酸平均含量达1 240.62 μg/g;而苹果酸和泛酸的平均含量分别为551.90 μg/g和465.63 μg/g,品种间均达到显著差异。除以上3种主要有机酸外,其他13种平均含量均较低,均在15 μg/g以下,对酸度品质的贡献较小。因此,总有机酸的差异主要由苹果酸和泛酸含量引起。

在大多数果实中,有机酸在果实发育前期逐渐升高,临近成熟时降低[23-24]。果实有机酸代谢是个复杂的过程,除受环境条件和栽培技术影响外,还受到自身复杂的代谢网络调控。其中,自身复杂的代谢网络调控是影响有机酸积累的根本因素。大部分果实以积累1～2种有机酸为主,其他有机酸含量较低。参与这些主要有机酸代谢可能与(Citrate Synthase,CS)、顺乌头酸酶(Aconitase,ACO)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate Carboxykinase,PEPC)、磷酸烯醇丙酮酸(Phosphoenolpyruvate,PEP)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Phosphoenolpyruvate Carboxykinase,PEPCK)等结构基因存在密切联系,还可能受到各类调节基因单独或协同调控[25-27]。品种间有机酸的积累差异可能是以上一种或多种因素综合调控的结果。

4 结论

贵州引进纽荷尔、沃柑等6个柑橘品种共检测出16种有机酸,分别为柠檬酸、苹果酸、泛酸、琥珀酸、葡萄糖醛酸、顺丁烯二酸、反丁烯二酸、丙二酸、酒石酸、L-焦谷氨酸、3-羟基-3-甲基谷氨酸、辛二酸、苯丙酮酸、乙基丙二酸、DL-3-苯基乳酸和戊二酸,其中,柠檬酸相对含量最高,平均为1 240.62 μg/g,占总有机酸含量的50%以上,是酸度品质的重要贡献者;其次是苹果酸和泛酸,两者平均含量分别为551.90 μg/g和465.63 μg/g,且6个品种间均达显著差异,其他13种有机酸平均含量低于15 μg/g,相对含量均不足1%。6个柑橘品种总有机酸含量表现为纽荷尔(2 501.88 μg/g)>沃柑(2 420.56 μg/g)>春见(2 338.11 μg/g)>濑户见(2 226.73 μg/g)>大雅(2 206.2 μg/g)>晚熟8号血橙(2 019.71 μg/g),其中,苹果酸含量依次为沃柑>纽荷尔>春见>大雅>濑户见>血橙,泛酸含量依次为纽荷尔>春见>濑户见>沃柑>大雅>血橙。柠檬酸、苹果酸和泛酸为主要有机酸,三者相对总量占有机酸总量的87.19%,6个品种总有机酸的差异主要由苹果酸和泛酸含量引起。