托斯卡纳病毒的研究进展

郑宇珂,聂 凯,李 樊,李 浩,王环宇

托斯卡纳病毒(Toscana virus, TOSV)是一种白蛉传播病毒,属于布尼亚病毒目(Bunyavirales)、白纤病毒科(Phenuiviridae)、白蛉病毒属(Phlebovirus)[1]。TOSV于1971年在意大利托斯卡纳地区首次分离,以分离地点命名,该病毒主要流行于地中海地区,在地中海地区外国家也有零星报道[2]。白蛉作为该病的传播媒介,其空间分布与种群密度决定TOSV感染的流行情况。TOSV具有神经侵袭性,感染多发生于夏季,人、家畜和野生动物均可被感染。动物为无症状感染,人感染时除了发热,还会出现眼部和胃肠道等症状,严重时能引发脑膜炎和脑炎等中枢神经系统疾病。TOSV所属的白蛉传播病毒在我国属于被忽略的病毒,目前仅发现武乡病毒一种。该病毒2018年首次在我国山西省长治市武乡县采集的白蛉样本中分离得到,已有研究证明该病毒可以感染哺乳动物,故国外关于TOSV的研究可为我国探索武乡病毒感染机制提供思路与经验[3-4]。同时愈发频繁的国际交流、经济贸易和旅游业的发展提高了TOSV传入包括我国等非流行地区的风险,应增进对该病毒的了解。本文将从基因组构成与分型、流行概况、传播媒介与增殖宿主、临床表现和实验室诊断等方面对TOSV进行综述。

1 基因组构成与分型

1.1 基因组构成 TOSV是一种有包膜的RNA病毒,基因组由1 个单股双义RNA节段(S)和2 个单股负链RNA节段(M和L)组成。

S节段长1 869 bp,以双向策略编码蛋白,即以负义链为模板编码核蛋白N,以正义链为模板编码非结构蛋白(Nonstructural protein, NS)NSs[5]。核蛋白N能与病毒RNA相互作用形成核糖核蛋白复合物,该蛋白具有较强的免疫原性,能够诱导体液和细胞免疫。非结构蛋白NSs具有E3泛素连接酶活性,可通过泛素化-蛋白酶体降解途径降解视黄酸诱导基因蛋白I(Retinoic-acid Inducible Gene I),进而中断IFN-β的产生,抑制宿主细胞的天然抗病毒活性[6]。

M节段长4 215 bp,一个开放阅读框编码糖蛋白Gp和非结构蛋白NSm。糖蛋白Gp成熟后被进一步加工为蛋白Gn和蛋白Gc,这两种蛋白分子质量相同(65 kDa),为病毒包膜糖蛋白,负责病毒附着于靶细胞,在病毒吸附、进入、装配和出芽等过程中发挥重要作用[7]。非结构蛋白NSm的功能目前尚不清晰。

L节段长6 404 bp,该基因编码的L蛋白是RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP),主要负责病毒基因组在细胞内的复制和转录。

1.2 基因分型 根据L段核苷酸序列的差异,TOSV被分为A、B两个谱系[8]:A谱系(Lineage A)毒株首次分离于意大利,之后在意大利、法国、阿尔及利亚、突尼斯、罗马尼亚、塞浦路斯和土耳其广泛检测和分离到该谱系毒株[9-10];B谱系(Lineage B)毒株则先后在葡萄牙和西班牙分离,该谱系毒株的检出及感染病例的报告出现在葡萄牙、西班牙、法国、摩洛哥、克罗地亚和土耳其[11]。C谱系(Lineage C)毒株于2012年在克罗地亚斯普利特大学附属医院的一位TOSV中枢神经系统感染患者的脑脊液样本中被检出,目前尚未实现该谱系毒株的分离,仅在克罗地亚和希腊有C谱系毒株核酸检出的报道[12]。现已获得A谱系和B谱系毒株的完整基因序列,C谱系病毒株仅有L片段序列信息[13]。3种谱系间存在共传播,在克罗地亚(B和C)、法国(A和B)和土耳其(A和B)均有报道,但尚未有研究表明不同谱系毒株的毒力或临床表现有差异[14]。

2 流行概况

TOSV广泛分布于地中海地区,详见图1。目前该病毒感染的确诊病例分布在地中海北部的葡萄牙、西班牙、法国、意大利、克罗地亚、罗马尼亚、希腊和土耳其,地中海南部的突尼斯和马耳他[10, 13, 15-22]。对在意大利托斯卡纳地区2011-2019年间每年5-10月采集的总计1 073 份无菌性脑膜炎患者脑脊液样本进行病毒筛查,结果表明TOSV在纳入筛查的常见引起无菌性脑膜炎的病毒中占比最大,为4.6%,提示应加强对TOSV感染的监测[23]。2018年,意大利将TOSV神经性感染纳入国家虫媒病毒感染监测系统,定期发布监测报告,至2021年共报告病例182 例,病死率为0.05%[24]。

TOSV感染病例在非地中海地区国家呈零星报告,病例多为输入性,有意大利和西班牙等病毒流行地区旅游史,归国后因出现临床症状而入院就医,经实验室检测确诊。此类病例在美国、英国、德国、澳大利亚、瑞士和瑞典有报道,多数病例的就诊原因为连续多日的发热和头痛,其中部分病例出现神经系统症状或有旅行期间的昆虫叮咬史[11, 25-30]。

对于尚无确诊病例报告的地中海国家,则有血清学或分子生物学证据表明当地存在TOSV感染风险,一些国家开展的血清学调查表明当地居民或动物体内普遍存在TOSV抗体,如地中海北部的波斯尼亚和黑塞哥维那、保加利亚和科索沃地区以及地中海南部的阿尔及利亚、塞浦路斯和利比亚[31-36];而地中海南部的摩洛哥是通过分子生物学方法在当地白蛉样本中检测到TOSV核酸[37]。

3 传播媒介与增殖宿主

3.1 传播媒介 白蛉属于双翅目、毛蛉科、白蛉亚科,在欧洲和美洲俗称沙蝇。全球已知白蛉亚科有24 属,其中白蛉属(Phlebotomus)白蛉是包括TOSV等多数白蛉病毒属成员的主要传播媒介。TOSV可以在白蛉间垂直传播,但感染率随着传代的增加而逐渐下降。病毒在白蛉体内复制后可以通过唾液腺屏障,经叮咬的方式传播给易感人群或动物。白蛉也可以通过吸食受感染人群或动物的血液而感染TOSV[38]。

TOSV最初分离自恶毒白蛉(Phlebotomusperniciosus),该品种白蛉主要分布在西班牙和葡萄牙等国[39]。在克罗地亚和意大利等国的白蛉体内均能分离或检出TOSV,详见表1。形态学或分子生物学水平鉴定结果显示这些白蛉主要为恶毒白蛉与佩氏白蛉(Ph.perfiliewi),Ph.longicuspis、Ph.sergenti、Ph.tobbi、Ph.neglectus和Sergentomyiaminuta也是TOSV潜在的传播媒介[40]。

表1 地中海地区TOSV感染流行现状Tab.1 Distribution of TOSV infections in the Mediterranean basin

地中海地区白蛉的活动高峰期为7-9月,与TOSV神经性感染报告病例高峰期一致[24, 41]。年平均温度是影响白蛉空间分布的重要因素,全球气候变暖使地中海地区白蛉的地理分布范围向外扩散,近年来已在德国和澳大利亚发现恶毒白蛉的存在,说明非地中海地区国家面临着TOSV感染本土流行的风险[42]。意大利研究者基于拉韦纳白蛉采集数据建立种群密度计算模型,进而计算出意大利其他地区白蛉种群密度,并与当地同期人群TOSV血清抗体阳性率数据进行logistic回归分析,结果显示为正相关,说明白蛉种群密度是TOSV感染流行的影响因素[43]。

3.2 可能的增殖宿主 TOSV能感染家畜和野生动物,且感染后无临床表现。意大利和葡萄牙等国开展的动物血清学调查(表1)发现,牛、羊、山羊、猫和狗体内普遍存在TOSV抗体[11, 32, 44-46]。除此之外,意大利在库氏伏翼蝠(Pipistrellus kuhlii)的脑组织样本中分离出TOSV;西班牙在四种蝙蝠血液样本中检出TOSV的中和抗体[47];土耳其在安纳托利亚半岛的野生鸟类(大火烈鸟、大白鹈鹕和黑鹳)脑组织样本和肾脏样本中检出TOSV核酸[48]。但至今尚未明确这些动物在TOSV传播中的作用。

目前诸多研究致力于解释狗在TOSV自然循环中的作用。狗是白蛉传播婴儿利什曼原虫(Leishmania infantum)的主要储存宿主,可以同时感染婴儿利什曼原虫与TOSV[49]。白蛉喜食狗血,而狗血清中常能检测出白蛉病毒属病毒的中和抗体,因此狗被认为是TOSV最可能的增殖宿主[46, 50]。但一项以5 只6～20月龄比格犬进行的动物实验表明,经静脉注射TOSV的4 只实验组比格犬没有出现病毒感染的临床症状,体内也没有产生针对性中和抗体,血浆样本中仅检测到低载量病毒。以上实验结果表明比格犬对TOSV不易感,且感染后不会出现明显的病毒血症[51]。因此,狗能否作为TOSV的增殖宿主仍无定论。

4 临床表现

TOSV感染的潜伏期一般为3～7 d,最长可达2周。该病毒具有神经系统侵袭性,轻度感染时表现为发热,体温常高于38 ℃,并伴有头痛、恶心和呕吐等症状;严重感染时会造成中枢神经系统病变,引发脑膜炎和脑炎,此类病例一般在入院后经实验室诊断确诊为TOSV神经性感染。

为了解TOSV感染的不同临床表现,Ayhan N对864位确诊病例的病历记录进行整理和分析,结果显示绝大多数病例表现出发热、头痛、恶心、呕吐和颈项强直等症状;约半数病例出现眼部症状(如结膜炎、视力模糊和复视等)、胃肠道症状(如腹泻、腹部痉挛和胃肠炎等)、皮肤症状(如皮疹和发热性红斑等);少数病例出现神经系统症状(如意识障碍、癫痫、共济失调和吉兰巴雷综合症等)和肌肉症状(如肌炎、筋膜炎和肌肉僵硬等);极少数病例出现食欲不振和睾丸炎症等非典型症状[52];多数感染病例预后良好,但也存在病例因严重感染导致死亡[11]。

5 实验室诊断

随着确诊病例不断增加,医护人员对人感染TOSV的临床表现有了更全面的了解。目前尚缺乏明确的临床依据区分TOSV感染与其他虫媒病毒或病原体感染,主要借助病毒分离、核酸检测和血清学检测等实验室方法实现对疑似TOSV感染者的诊断。

5.1 病毒分离 病毒分离是诊断TOSV感染的金标准。最佳样本为疑似感染者发热后2～4 d的脑脊液样本,因该类样本不易获取,故也可采集疑似感染者同时期的血液样本用于病毒分离。TOSV可以通过敏感细胞株和1～3 d龄乳鼠的颅内接种分离培养,常用的敏感细胞系包括:非洲绿猴肾细胞(Vero)、金黄地鼠肾细胞(BHK-21)和人肾上腺皮质小细胞癌细胞(SW13)。一旦分离出TOSV,即可确诊。该法具有高特异性,缺点是细胞培养需要无菌环境,需在配备生物安全柜的无菌实验室中进行操作;样本需采集自病毒血症期感染者,对含低滴度病毒样品的分离阳性率低;耗时长,不适用于临床快速诊断。

5.2 核酸检测 核酸检测相比于病毒分离技术更快速、灵敏,缺点是检测结果准确性易因病毒基因组降解而受影响。常采集疑似感染者发热5 d内的脑脊液和血液样本进行核酸检测,有证据表明尿液也可作为检测样本[53]。TOSV核酸的检测方法主要包括逆转录酶聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)、实时荧光定量RT-PCR和深度测序(next generation sequencing, NGS)。

TOSV基因组中S片段的已知序列数量最多,且序列较保守,常以此片段设计核酸检测所需的引物与探针。RT-PCR法为传统的核酸检测方法,目前有商品化的一步多重RT-PCR法试剂盒用于检测包括TOSV等8种能引起急性脑膜炎和脑炎的病毒[54]。实时荧光定量RT-PCR法较RT-PCR法有敏感性及特异性高、快速、可进行绝对定量的优势[55]。目前已针对TOSV S片段设计了3套引物与探针,建立实时荧光定量RT-PCR方法,扩增3个不同片段,片段互不重合,减少了假阴性结果产生,使结果更为可信[56]。NGS能够在核酸浓度低条件下保证检测结果的高准确性和高敏感性,可以对TOSV进行准确的基因检测和分型,缺点是检测成本高、周期长,难以满足临床上快速检测大量样本的需求。

5.3 血清学检测 通过血清学检测方法在疑似感染者的血清样本中检出TOSV IgG/IgM抗体是实验室诊断TOSV感染的常用方法。IgM抗体在感染后3～4 d即可在血中检出,持续3～6月;IgG抗体出现较晚于IgM抗体,滴度峰值出现在感染后10～15 d,可持续存在数年[57]。疑似感染者病毒血症期和恢复期的血清均能作为临床检测样本,常用的方法包括中和实验(neutralization test,NT)、酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)、胶体金免疫层析法(gold immunochromatography assay, GICA)和间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay, IFA)。

NT需要患者急性期和恢复期的血清样本,具有高敏感性和特异性,缺点是耗时长、对操作人员要求较高,临床上不常使用。有市售的基于TOSV重组N蛋白进行96孔板包被的ELISA检测试剂盒,可用于大量样本的筛查。GICA不需配备特殊仪器、15 min内即可出结果且肉眼易判断,满足了临床检测方法应简单、快速的要求,缺点是敏感性不足[58]。IFA集血清学反应、荧光色素应用和显微镜检查法于一体,敏感性和特异性高,缺点是对操作人员的经验和设备要求高,市售试剂盒可用于检测包括TOSV等4种白蛉病毒属病毒。由于TOSV与其他白蛉病毒属成员间存在交叉表位,易发生交叉反应,因此通过ELISA、GICA和IFA进行TOSV感染诊断时存在产生假阳性的可能。

现行的TOSV感染实验室诊断方法中病毒分离因费时费力、需配备特殊仪器及对操作人员要求高不能成为主要的诊断方法。血清学抗体检测经济简便、敏感性和特异性较高,是目前初筛TOSV感染的方法,缺点是易发生交叉反应造成假阳性结果。核酸检测是最快速准确的TOSV感染早期诊断方法,但昂贵的仪器和试剂限制其在临床上的应用。各诊断方法特点详见表2。

表2 不同TOSV实验室诊断方法特点Tab.2 Features of TOSV laboratory diagnostic methods

6 总 结

TOSV是一种白蛉传播病毒,具有神经侵袭性。家畜和野生动物感染后无临床表现,人感染后表现为发热、眼部症状和胃肠道症状等,严重感染时还会出现脑膜炎和脑炎等中枢神经系统疾病,甚至引起死亡。TOSV感染在地中海地区流行,德国和澳大利亚等非地中海地区国家也有零星报道。恶毒白蛉和佩氏白蛉等白蛉是TOSV的传播媒介,其分布范围随全球气候变暖扩散至地中海外地区,进而增加了非地中海地区国家感染TOSV的风险。目前尚未研制出针对TOSV的疫苗,人群普遍易感。我国至今未有TOSV感染病例的输入,但随着经济发展、全球交通更加便利和人群流动性增大,TOSV输入包括我国等非地中海地区国家的风险日益加剧。因此,为有效应对可能的病毒输入,首先应加强媒介白蛉中携带病原体的筛查及密度监测工作,以期为我国TOSV感染本土疫情提供预警;其次应加强口岸出入境卫生检疫工作,对于有病毒流行地区旅居史的不明原因发热或脑膜炎和脑炎患者,应考虑其为TOSV感染,尽早发现病例,防止病毒输入和进一步扩散;最后应在不断优化现有方法的同时,积极建立符合临床应用需求的TOSV诊断方法,为防控打好技术基础。

利益冲突:无

引用本文格式:郑宇珂,聂凯,李樊,等.托斯卡纳病毒的研究进展[J].中国人兽共患病学报,2023,39(8):789-796. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2023.00.087