一株鸡源致病性大肠杆菌的分离鉴定及耐药性检测

陶宏卫，杜荣雪，郭广富，练国俊

（1.江苏农牧科技职业学院动物医学院，江苏泰州 225300；2.晟宠国际动物医院，北京朝阳 100020）

大肠埃希菌（E.coli）俗称大肠杆菌，为埃希菌属的代表菌。 大肠杆菌在肠道菌鉴别培养基，如麦康凯琼脂培养基上生长，因发酵乳糖产酸，使指示剂变红，形成红色菌落。 大肠杆菌对多种消毒药敏感，对各种广谱抗菌药也敏感，但易产生耐药性。 多数大肠杆菌为人和动物肠道内的正常菌群成员之一，少数为致病性细菌。 致病性大肠杆菌对动物具有致病性， 能引发人和动物的败血症、腹泻、肺炎、心内膜炎、泌尿道感染、幼畜或幼儿腹膜炎、脑炎等。 笔者在学校兽医实验室分离鉴定了一株致病性鸡源大肠杆菌，并进行耐药性检测，现予以介绍。

1 材料与方法

1.1 材料

普通营养肉汤、 伊红美蓝琼脂和药敏试验的药敏纸片中的环丙沙星均购自于杭州天和微生物试剂有限公司； 营养琼脂和药敏试验的药敏纸片中的青霉素G、 氨苄西林、头孢曲松、头孢唑啉、头孢噻肟、林可霉素、庆大霉素、四环素、强力霉素（多西环素）、红霉素、多黏菌素B、复方新诺明均购自于杭州滨和微生物试剂有限公司；麦康凯琼脂、氧化酶试验试剂、生化试验肠杆菌科细菌生化鉴定管（11 种×10 支）和其配套试剂（补充试剂）、药敏试验的药敏纸片中的阿莫西林、链霉素均购自于杭州微生物试剂有限公司。 试验动物选用的健康小白鼠由江苏农牧科技职业学院实验动物房提供； 病料来自于泰州某鸡场一病死鸡的肝脏。

1.2 方法

1.2.1 培养基制备及细菌分离

按说明书完成麦康凯培养基、 营养琼脂培养基、营养肉汤及伊红美蓝培养基的制备。 用灭菌的接种环取病料， 采用三线分区画法接种于麦康凯琼脂培养基上， 倒置于37℃恒温箱中培养24 小时后取符合大肠杆菌培养特性的红色菌落，接种营养琼脂培养基予以纯培养。

1.2.2 染色及生化试验

1.2.2.1 革兰染色

采集菌落， 制备细菌标本片， 进行革兰染色。 染色方法：（1）初染：草酸铵结晶紫，1～3 分钟，水洗；（2）媒染：革兰氏碘液，1～3 分钟，水洗；（3）脱色：95%酒精，30 秒，水洗；（4）复染：复红染液，1～3 分钟，水洗，显微镜油镜观察。

1.2.2.2 氧化酶试验

将析滤纸剪成三角形，沾取菌落后，滴加一滴氧化酶试验试剂，10 秒后观察结果。

1.2.2.3 肠杆菌科细菌生化鉴定管试验

将生化试验肠杆菌科细菌生化鉴定管（11种×10 支）和其配套试剂（补充试剂）、37℃恒温箱已培养24 小时的营养琼脂培养基和接种针等置于超净台。 将肠杆菌科细菌生化鉴定管用磨砂轮打开，接种针灭菌后，打开营养琼脂培养基沾取菌落，接种于鉴定管中，接种完成后，将鉴定管整齐放在灭菌后平皿中，37℃恒温箱24小时后观察结果。

1.2.3 动物致病性试验

取营养琼脂纯培养物接种到营养肉汤中，37℃培养18 小时后接种小白鼠， 腹腔注射0.2毫升/只；对照组予以腹腔注射无菌生理盐水，剂量相同。 在12～36 小时内观察对照组和实验组小白鼠的发病情况。 若有小白鼠发病或死亡，则解剖取其肝脏， 接种于伊红美蓝培养基进行菌种回收试验，其培养出菌落的特性、形态和染色反应都符合大肠杆菌时， 判定为致病性大肠杆菌。

1.2.4 药敏试验

先在玻璃板背后标上数字， 将菌液接种到培养基上，均匀涂开后，按对应数字用小镊子夹出药敏试验纸片贴与培养基上， 贴完后放置于37℃恒温箱中培养24 小时后观察结果。

2 结果

2.1 细菌分离

37℃恒温箱中培养24 小时后， 在麦康凯培养基上可见符合大肠杆菌培养特性的红色菌落（见图1）。

图1 麦康凯培养基分离结果

2.2 染色及生化试验

2.2.1 革兰氏染色

将分离菌株进行涂片、 革兰氏染色及油镜观察，结果显示革兰阴性中等大小的杆菌。

2.2.2 氧化酶试验

由图2 可看出， 氧化酶试验的结果呈现阳性。

图2 氧化酶试验试剂结果

2.2.3 肠杆菌科生化鉴定

分离菌株接种肠杆菌科细菌生化鉴定管，获得该菌株生化鉴定结果（见表），编号为A632，在编码鉴定表中查到答案为：大肠埃希氏菌。

2.3 动物致病性试验

大肠杆菌分离株肉汤培养物腹腔接种小白鼠后，在24 小时左右发病死亡。 剖检死亡小白鼠， 取其脏器， 用伊红美蓝培养基进行细菌分离， 结果培养基上呈现黑色、 有金属光泽的菌落，符合大肠杆菌生物学特性的菌落，革兰氏染色结果也一致。

根据以上试验的结果， 判定为该分离菌为鸡源致病性大肠杆菌。

2.4 药敏试验

根据CLSI 标准, 对抑菌圈直径按照 “耐药”、“敏感”、“中度”的判断。 药敏结果的判定标准：＜10 毫米为低度敏感，10～20 毫米为中度敏感，＞20 毫米为高度敏感。 结果显示分离菌株对多种抗生素均有不同程度的耐药， 其中对头孢噻肟高度敏感，对庆大霉素、头孢曲松和多粘菌素B 均中度敏感， 对其他药物呈现低度敏感或者无敏感性。

3 分析与讨论

麦康凯培养基或伊红美蓝平板培养基在实验室常用于大肠杆菌的分离。 本次试验首先使用麦康凯培养基从病死鸡的肝脏中分离到符合大肠杆菌生长特性及形态染色特点的细菌，然后借助生化试验完成大肠杆菌的鉴定。 对致病性试验发病的小白鼠取肝脏， 接种于伊红美蓝平板培养基进行菌种回收试验， 获得了较好结果。

当前家禽养殖业大肠杆菌存在一定程度的耐药情况。 林安等报道，某鸭场分离的大肠杆菌呈四重耐药；刘萍等报道，某鸡场分离的大肠杆菌对氨苄青霉素、四环素和氧氟沙星等10 种以上药物具有耐药；白茹等报道，一鸡群大肠杆杆菌分离株对大部分药物的敏感性较低， 表现为多重耐药。 本次试验对分离到大肠杆菌菌株进行14 种药物的药敏试验，结果：对青霉素G、氨苄西林、 阿莫西林等7 种药物耐药， 且对四环素、 头孢曲松、 庆大霉素等6 种药物敏感度很低，仅对头孢噻肟高度敏感。 这可能与临床上药物使用种类繁多、药物滥用等因素有关。

分离菌株的生化试验结果

从整体来看， 大肠杆菌的多重耐药性十分严重，有实验证明，饲养场内多重耐药的大肠杆菌在人体与动物之间传播， 有扩散的现象。 因此，建议临床上使用抗生素时，采用联合用药、轮换用药和科学给药等措施， 降低耐药性的产生。 另外，根据药敏试验的结果，合理选择药物，有利于获得良好的治疗或预防效果， 也避免因使用耐药性的抗生素而增加养殖的成本。 根据结果选择抗菌性高的药物， 严格控制药物剂量和使用时间， 也能在一定程度上减少细菌耐药性的产生。