Yes相关蛋白1和散乱蛋白2对Luminal型乳腺癌预后的影响

陈春国,陈橼,杨松,倪陈婷,张一心,倪启超

近些年,大量研究揭示多种基因、信号转录分子表达水平的变化及机体内调控细胞生物学活动相关信号通路异常的活性状态与乳腺癌的生物机制有着密切的联系,但是正常乳腺细胞如何发生突变导致无序生长,其具体作用机制尚未可知。国内外大量研究显示,Wnt信号传导通路异常激活参与乳腺癌的发生发展过程[1]。散乱蛋白2(dishevelled 2,DVL2)是细胞内Wnt信号通路中的重要组分之一,也是人类D基因家族的重要成员之一,其通过抑制胞质内β-catenin泛素化降解,致使细胞质内游离β-catenin不断蓄积,通过与Tcf/Lef形成复合物而进入细胞核,诱导下游等肿瘤相关基因的表达,参与肿瘤的发生发展过程[2]。Yes相关蛋白1(YAP1)信号通路是一类调控哺乳动物组织器官生长发育的重要信号通路,其调控肿瘤的发生发展过程。Hippo信号通路与Wnt/β-catenin信号通路之间存在耦联关系,Wnt/β-catenin信号通路可以调节MST 1/2激酶的活性,而MST 1/2激酶则是Hippo-YAP信号通路中重要的组成部分[3-4];有实验结果显示,DVL2与YAP/TAZ存在相互作用,Hippo信号中的YAP/TAZ能抑制Wnt3a诱导Wnt信号通路对DVL2磷酸化调节作用,间接调控Wnt/β-catenin信号通路中细胞信号的传递[5]。上述研究提示Wnt及Hippo信号通路间存在耦联作用可能与肿瘤的发生发展有关,但鲜有研究探讨DVL2、YAP1在乳腺癌中的相关性。本研究检测乳腺癌中DVL2、YAP1的表达水平,分析DVL2、YAP1与乳腺癌患者临床病理特征及预后的关系,探讨DVL2、YAP1在乳腺癌诊断及治疗中的潜在价值。

1 资料与方法

1.1 利用数据库分析YAP1、DVL2蛋白在乳腺癌中的表达情况 利用临床蛋白质组肿瘤分析协作组(Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium, CPTAC) (http://ualcan.path.uab.edu/analysis-prot.html)数据库分析DVL2、YAP1蛋白在不同类型乳腺癌中的表达差异。利用GEPIA2数据库(http://gepia2.cancer-pku.cn/#correlation)分析YAP1、DVL2在乳腺癌组织中的表达相关性。

1.2 临床资料 收集2008年1月至2010年6月在南通市肿瘤医院住院的乳腺癌患者的临床资料。纳入标准:①病理确诊为Luminal型浸润性乳腺癌,术后免疫组化证实为浸润性乳腺癌(ⅠB～ⅢA期)的女性患者;②术前未接受化疗、放疗、免疫治疗等其他抗肿瘤治疗措施;③手术切除范围为乳腺癌改良根治术切除范围;④术后按照乳腺癌相关诊疗指南[6]行常规治疗。最终有202例乳腺癌患者纳入本研究,年龄34～81(59.8±12.5)岁,平均无瘤生存时间(57.7±26.2)个月。收集患者的雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、人表皮生长因子受体2(HER)及Ki-67增殖指数水平。

1.3 免疫组织化学方法检测DVL2、YAP1表达情况 将手术切除的标本经甲醛溶液固定后,石蜡包埋,5 mm连续切片脱蜡,PBS洗3 min,洗2次;滴加一抗,室温2 h,PBS洗3 min,洗2次;滴加二抗,室温20～30 ℃,PBS洗3 min,洗2次;DAB显色后复染,分化水洗,脱水封片,高倍镜下观察染色结果。采用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照,已知阳性片作阳性对照。兔抗人DVL2多克隆抗体(货号:ab137528)及兔抗人活化的YAP1(非磷酸化)多克隆抗体(货号:ab205270)均购自美国Abcam公司。以细胞质中有棕褐色颗粒染色判为阳性。判断标准:①不着色:阴性,0分;②淡黄色:弱阳性,1分;③棕黄色:阳性,2分;④深棕黄色:强阳性,3分。敏感性评价标准:2～3分视为阳性;0～1分视为阴性[7]。

1.4 Real-Time PCR检测YAP1、DVL2表达水平 提取乳腺癌及癌旁石蜡组织的RNA:将蜡块组织切成6～8 μm切片,置于1.5 mL离心管中,加入1.0 mL二甲苯,混匀,离心2 min。取上清液,加入1.0 mL无水乙醇,混匀,离心2 min,取上清液。加入150 μL Buffer PKD,重悬沉淀。加入10 μL蛋白酶K,混匀。56 ℃孵育15 min,20 000转离心15 min。取上清液至1.5 mL离心管中。提取方法参照文献[8]。Real-Time PCR试剂盒(货号:04887352001)购自美国Roche公司。引物购自上海生工公司,见表1。构建20 μL逆转录反应体系,混匀后37 ℃温浴5 min。42 ℃温浴60 min,70 ℃温浴10 min,终止反应。构建20 μL PCR反应体系,扩增条件:94 ℃ 10 min,(94 ℃ 20 s,55 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s)40个循环。用ABI 7500型实时荧光定量PCR仪进行分析。根据阴性对照调整阈值和基线,以确定各个标本的Ct值,并根据熔解曲线确定该Ct值是否有效。ΔCt(目的基因)=Ct(癌)-Ct(内参),ΔCt(癌旁)=Ct(癌旁)-Ct(内参),ΔΔCt=ΔCt(癌)-ΔCt(癌旁)。采用2-ΔΔCt法确定YAP1、DVL2表达水平,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内源性对照。以癌旁组织作为对照组进行定性分析:若癌中表达量>癌旁,则为阳性;癌中表达量≤癌旁,则为阴性。

表1 所用引物序列

表2 DVL2、YAP1表达水平与乳腺癌患者临床病理特征的关系

1.5 乳腺癌患者术后随访 自治疗后起0～2年:每间隔2个月行专科系统检查1次;3～5年:每间隔5个月行专科系统检查1次。专科系统检查项目包括专科体格检查、血液肿瘤标志物、超声及CT等影像学检查。无复发生存期(recurrence-free survival, RFS):手术后至首次发现肿瘤复发、转移(病理或影像学结果提示远处转移)的时间。随访截至2020年12月31日,患者最长随访时间126个月。

2 结果

2.1 YAP1、DVL2蛋白在Luminal型乳腺癌组织中的表达情况 经CPTAC数据库分析发现,DVL2蛋白在Luminal型浸润性乳腺癌组织中高表达,YAP1蛋白在乳腺癌组织中低表达,差异有统计学意义(图1)。本研究选择样本量较多的Luminal型浸润性乳腺癌作为研究对象。

图1 DVL2(1A)及YAP1(1B)在不同分子分型乳腺癌中的表达水平比较

2.2 YAP1、DVL2在乳腺癌组织中的表达相关性 以GAPDH为内参基因,通过GEPIA2数据库采用Spearman法分析发现,YAP1与DVL2呈正相关(R=0.7,P<0.001,图2)。

图2 YAP1、DVL2在乳腺癌组织中的表达相关性

2.3 YAP1和DVL2的免疫组化结果 YAP1和DVL2均定位于细胞质中,呈深褐色染色(图3)。

图3 DVL2和YAP1在乳腺癌组织中表达(免疫组化法,×100)

2.4 DVL2和YAP1表达水平与乳腺癌患者临床病理特征的关系 DVL2与乳腺癌患者的TNM分期、有无神经侵犯及癌栓有关,YAP1与腋窝淋巴结、TNM分期、有无神经侵犯及癌栓有关,DVL2与YAP1的高表达和低表达之间差异有统计学意义(表2)。

2.5 DVL2与YAP1 mRNA在Luminal型浸润性乳腺癌组织中表达的相关性 DVL2与YAP1 mRNA在Luminal型浸润性乳腺癌组织中的表达水平呈正相关(r=0.617,P<0.001)。乳腺癌组织中YAP1和DVL2的表达水平均高于癌旁组织(P<0.001,图4)。

图4 YAP1与DVL2 mRNA在Luminal型乳腺癌组织及癌旁组织中的表达 4A:YAP1与DVL2 mRNA在Luminal型乳腺癌组织中表达的相关性;4B:YAP1基因在Luminal型乳腺癌组织中的表达水平差异;4C: DVL2基因在Luminal型乳腺癌组织中的表达水平差异

2.6 DVL2和YAP1表达水平与乳腺癌患者无瘤生存时间的关系 单因素Cox回归分析发现,年龄、肿瘤直径、TNM分期、脉管癌栓、神经侵犯对RFS无影响,而腋窝淋巴结、Luminal分型、HER2、Ki-67、DVL2、YAP1表达水平与RFS有关,差异有统计学意义。多因素Cox回归分析发现,Luminal分型、HER2阳性、Ki-67、DVL2和YAP1表达水平为乳腺癌患者无瘤生存时间的独立影响因素(表3)。Kaplan-Meier生存分析发现:DVL2高表达组患者RFS低于低表达组(图5A),而YAP1则相反(图5B)。

图5 YAP1(5A)、DVL2(5B)表达水平对Luminal型乳腺癌患者无复发生存时间的影响

根据YAP1和DVL2表达水平将本组202例患者分为4个组,即DVL2(+)/YAP1(+)组(47例),DVL2(-)/YAP1(+)组(56例),DVL2(+)/YAP1(-)组(76例),YAP1(-)/DVL2(-)组(23例),结果显示:DVL2(-)YAP1(+)组中Luminal乳腺癌患者的RFS高于其他3组,而DVL2(+)YAP1(-)组中Luminal乳腺癌患者预后最差(图6A)。两种不同分子分型中,DVL2(+)YAP1(-)组中Luminal乳腺癌患者预后最差(P<0.05),DVL2(+)YAP1(+)患者预后优于DVL2(+)YAP(-)患者(P<0.05,图6B、6C)。

图6 不同亚型Luminal型乳腺癌患者的生存曲线 6A:Luminal 型乳腺癌患者不同亚型中无瘤生存时间;6B:Luminal A型乳腺癌患者不同亚型中无瘤生存时间;6C:Luminal B型乳腺癌患者不同亚型中无瘤生存时间

3 讨论

流行病学调查结果显示,我国乳腺癌的发病率约为29/10万,且每年以3%～5%的递增速度逐年上升,目前其发病率已经上升到女性恶性肿瘤的第2位;2021年底,我国乳腺癌患者人数将突破220万[9-10]。

DVL2作为人类DVL家族成员重要成员之一,是Wnt信号通路中的核心组成部分,通过抑制丝/苏氨酸激酶的活性,减少β-catenin泛素化降解的生物学过程,最终导致游离β-catenin在胞浆内蓄积,促进游离的β-catenin与Tcf/Lef原件相结合而进入细胞核,进而调控Wnt信号通路核内部分,诱导下游细胞周期蛋白-D1、C-myc等肿瘤相关转录因子的表达[11]。研究表明DVL2在食管癌[12]、胃癌[13]、鼻咽癌[14]等肿瘤模型中表达异常。在原发性肝癌中,DVL2在肿瘤组织中的表达水平明显高于癌旁正常组织,并与肝癌的不良预后密切相关[15]。另有研究显示,在乳腺癌细胞模型中,DVL2是乳腺癌细胞迁移所必需的信号通路关键位点,通过抑制DVL2的磷酸化可明显减少乳腺癌细胞的迁移活动[16-17]。

Hippo信号通路在哺乳动物的组织器官生长发育调节方面有着重要作用,其介导的磷酸化作用可以激活Hippo信号通路的关键转录因子YAP蛋白,磷酸化状态的YAP蛋白能够进入细胞核发挥作用,维持细胞的分化增殖与细胞凋亡的相对平衡,调节组织器官的生长发育,维持组织器官的稳态。YAP1作为YAP家族中的一员,其异常表达参与肿瘤的形成过程[18]。有研究在非小细胞肺癌、胃癌、结直肠癌、肝细胞肝癌等多种肿瘤模型中均发现异常表达的YAP1蛋白[19-21]。YAP1的作用机制目前尚不明确,在某些肿瘤模型中,YAP1表现出癌基因的特性,而在另一些肿瘤模型中则表现出抑癌基因的作用。Yuan等[22]在2008年首次报道了YAP1在乳腺癌中作为肿瘤抑制因子存在,其乳腺癌中的表达降低,影响肿瘤的信号通路。而Muhammad等[23]研究发现,YAP1与雌二醇(E2)呈正相关,在激素依赖的乳腺癌模型中YAP1 mRNA高表达,通过下调DNA甲基转移酶3B,降低其启动子区域的甲基化水平,加速乳腺癌细胞的恶性转化,促进细胞的自噬、抑制凋亡并诱导乳腺癌细胞的无限增殖。本研究显示,YAP1高表达的乳腺癌患者无瘤生存时间高于YAP1低表达患者,而且合并淋巴结转移、脉管癌栓及神经浸润的乳腺癌患者YAP1的阳性表达率不高,提示YAP1发挥着类似抑癌基因的作用。

有研究发现,YAP/TAZ既可以在细胞核中作为Wnt信号的转录介质,也可以在细胞质中作为Wnt/β-catenin的抑制剂[24]。在细胞质中,YAP/TAZ通过与β-catenin或DVL的相互作用调节Wnt/β-catenin信号通路,YAP/TAZ既能抑制β-catenin入核,又能被DVL2抑制YAP/TAZ磷酸化[25-26]。在肝癌[24]、胃肠道组织肿瘤[3,27]、乳腺癌[28]中,可见Hippo/Wnt/β-catenin相互作用。有研究发现,Wnt/β-catenin的表达下调可上调间充质样三阴性乳腺癌细胞中YAP靶基因的表达[28]。而DVL2通过抑制胞质内β-catenin泛素化降解,胞浆内游离β-catenin不断蓄积,抑制YAP相关靶基因的表达[29]。加拿大学者通过免疫共沉淀发现,相对于DVL的其他同源异构体,YAP1/TAZ偏好于DVL2[27]。有研究通过转基因小鼠研究肠干细胞发现YAP1也与DVL2相互作用,在细胞质中YAP1和TAZ结合DVL,DVL2作为Wnt信号通路中的的关键调控因子,高表达抑制YAP1/TAZ活性,YAP1敲除导致DLD1细胞中DVL2堆积,在YAP缺失的情况下,DVL2和DVL3部分或完全恢复Wnt靶基因功能,提示YAP1具有阻断DVL2诱导Wnt信号的能力,该研究还发现YAP1在人类结直肠癌中发挥肿瘤抑制作用[29]。

本研究通过分析网络数据发现,DVL2与YAP1密切相关,DVL2在乳腺癌肿瘤组织中表达明显高于癌旁正常组织,DVL2高表达的乳腺癌患者无瘤生存时间明显缩短,可能与DVL2激活Wnt信号通路有关,提示DVL2参与乳腺癌的发生发展过程,并可能是影响患者预后的因素之一。本研究还发现,乳腺癌肿瘤分期越晚,DVL2表达水平越高,且伴有脉管浸润,神经浸润患者的DVL2阳性率升高,预后不理想,提示DVL2表达水平可用于评估乳腺癌患者的治疗效果及临床预后。本研究还发现乳腺癌中YAP1 mRNA与DVL2 mRNA的表达呈正相关,与GEPIA2数据库的预测结果基本一致,但是蛋白表达水平却相反,说明蛋白表达受到了抑制。目前的理论普遍认为限制YAP的转录活性是Hippo通路抑制肿瘤生长的主要机制,目前的治疗努力旨在降低许多恶性肿瘤中的YAP蛋白水平,包括结肠癌[29]、肝癌[24]。但哈佛学者通过转基因和基因敲除小鼠及临床研究发现,YAP1可能在人类结直肠癌中发挥肿瘤抑制作用,过度抑制YAP1可能会导致肿瘤生长增加,YAP1的靶向治疗应以破坏YAP/TEAD的相互作用或诱导YAP的细胞质易位为目标[29]。

国外有研究显示,当Hippo信号通路处于失活或静息状态时,YAP/TAZ能够与核-环蛋白结合形成复合物,级联放大Wnt信号通路中的细胞增殖信号的传递,抑制细胞凋亡,促进组织器官的生长发育[30]。另一方面,在生物体内缺乏Wnt蛋白的情况下,YAP/TAZ蛋白也可以募集β-TrCP,对Wnt信号传导通路起到负性调控作用,使Wnt信号通路维持在静息状态;一旦体内存在的Wnt信号蛋白激活Wnt信号通路时,YAP/TAZ从YAP/TAZ/β-TrCP结构复合物中解离,参与Wnt信号通路诱导的细胞增殖信号传导过程[31],提示Wnt信号通路与Hippo信号通路间可能存在交叉作用。本研究发现DVL2和YAP1在乳腺癌组织中高表达,但YAP1在临床表现中却表现出类似于抑癌基因的作用,该现象与国外学者研究的基本一致[24,29],可能与Wnt信号通路、Hippo信号通路之间潜在的相互作用有关,具体作用机制有待进一步研究验证。

综上所述,YAP1和DVL2的异常表达在乳腺癌的发生发展中起重要作用,与乳腺癌的临床预后相关。本研究为单中心研究,虽样本量不大,但已为YAP1和DVL2的联合检测提供了有益的探索并得到初步结果;其在乳腺癌中的临床价值有待大样本量、多中心的研究进一步验证,YAP1与DVL2在乳腺癌中的具体作用机制及潜在的交叉作用有待在转基因分子水平层面进一步探讨。