昆虫生长阻滞肽研究进展

胡冬春, 徐富强, 刘 旭, 李树忠, 冯从经

(扬州大学植物保护学院,江苏 扬州 225009)

在自然界中,昆虫面对多种外源物侵染和环境胁迫。昆虫被具有致病性和感染性的病原微生物侵染会引发免疫反应。环境(如温度、辐射、重金属等)的刺激也会影响昆虫的发育、免疫和行为等[1-3]。环境胁迫会导致昆虫体内的生理代谢发生紊乱,而细胞作为生物体最基本的组成单位,在免疫、应激和生理代谢过程中发挥着重要作用。细胞因子是一种传递细胞间信号的蛋白质,几乎影响着昆虫所有的生理进程[4-5]。由于作用形式不同,特定的细胞因子具有不同的功能,如参与免疫调控、抵抗炎症、促进细胞增殖和分化、调节生长发育等[5]。

昆虫生长阻滞肽(Growth-blocking peptide, GBP)首次被发现于寄生蜂(Cotesiakariyai)寄生后黏虫(Pseudaletiaseparata)的血淋巴中,GBP导致被寄生幼虫血淋巴中保幼激素酯酶(JHE)活性降低,延缓了幼虫的生长发育[6]。近年来,GBP在不同种类昆虫生长发育和免疫防御中的调控功能已被多次验证[7-9]。

1 GBP及其同系物

GBP是昆虫细胞因子的重要成员,作为免疫反应的介质,促进胁迫下的免疫应答,也调控着昆虫的生长发育。将细胞因子GBP注射至黏虫的末龄幼虫中,显著干扰了幼虫的正常发育[6,10]。随后的研究结果进一步证实GBP可参与体液免疫、诱导麻痹、血细胞扩散、心率加速等生理过程。然而,目前仅在果蝇(Drosophilamelanogaster)体内鉴定出DmGBP(果蝇生长阻滞肽)的唯一受体蛋白Mthl10,通过基因敲降确定了GBP-Mthl10在果蝇抵御环境胁迫过程中发挥重要的作用[11]。此外,另一细胞因子应激反应肽(Stress-responsive peptide, SRP)被证明能够负反馈调节GBP,通过RNAi和注射PsGBP(黏虫生长阻滞肽),发现SRP可能是GBP下游的细胞因子,GBP转录水平的变化能够调节黏虫血淋巴中SRP的浓度,并通过减少觅食行为来诱导胁迫后的幼虫生长迟缓[8]。

GBP最早在鳞翅目昆虫中被发现,但近年来研究结果表明在其他种类昆虫中也存在GBP同源物,例如:鞘翅目、双翅目、膜翅目及半翅目[12]。迄今,已在至少10种鳞翅目昆虫中发现了GBP的同源肽,它们具有不同的生物活性,如:诱导麻痹、细胞增殖、刺激浆细胞等[13-14]。 这些GBP同源肽含有23～25个氨基酸残基,序列同源性约为70%～80%,基于它们共同的N端序列谷氨酸-天冬酰胺-苯丙氨酸-(Glu-Asn-Phe-),这些肽被称为ENF肽(图1)[13-16]。N端的活性结构部分对GBP蛋白的功能至关重要,Ishii等[17]合成了一种缺乏N端ENF残基的截短形式的麻痹肽(Paralytic peptide, PP),证实其缺乏诱导家蚕麻痹和肌肉收缩的能力。Aizawa等[14]通过合成GBP的缺失和点突变体蛋白发现N端活性部分的特定残基能够影响GBP的生物活性,如:有丝分裂和浆血细胞扩散活性。对PsGBP及BmPP(家蚕麻痹肽)蛋白的生长阻滞活性及核磁共振结构进行比对,发现其β-turn区域的结构差异造成2个肽不同的生物活性[18]。通过GBP及其同源肽的核磁共振波谱(NMR)分析推测这些细胞因子与哺乳动物的表皮生长因子(EGF)家族中的一个基序具有相似性[13]。目前,尚未在人类体内发现GBP的同源物,但有研究结果表明DmGBP与人类防御素BD2的序列、加工方式和通过IP/Ca2+级联信号的作用方式存在一定的相似性[19-22]。

黑色部分表示8个序列完全相同的部分,方框部分表示保守部分,虚线为水解酶切割位点。MsGBP:黏虫生长阻滞肽(GenBank 登录号:AAB35742.1);HvGBP:绿棉铃虫生长阻滞肽(GenBank 登录号:ACR78449.1);MbGBP:甘蓝夜蛾生长阻滞肽(GenBank 登录号:BAD20461.1);SeGBP:甜菜夜蛾生长阻滞肽(GenBank 登录号:AGO02159.1);OfGBP:亚洲玉米螟生长阻滞肽(GenBank 登录号:QWX20072.1);HaGBP:棉铃虫生长阻滞肽(GenBank 登录号:AUB45120.1);SePP:甜菜夜蛾麻痹肽(GenBank 登录号:AEK12768.1);PmPSP:燕凤尾蝶浆细胞延展肽(GenBank 登录号:KPJ16907.1)。图1 昆虫生长阻滞肽(GBP)家族成员与其他ENF肽的氨基酸序列比对Fig.1 Amino acid sequence alignment between growth-blocking peptide (GBP) family members and other ENF peptides

2 GBP影响昆虫的生长发育

GBP对昆虫生长的调控与激素相关。GBP通过抑制JHE活性来延缓昆虫生长,但其抑制昆虫血淋巴中JHE活性的机制尚不清楚[6,23]。Noguchi等[24-25]发现在黏虫幼虫体内PsGBP能够显著调节多巴胺的水平。多巴胺在昆虫的生长周期中能够调控激素的合成,从而影响昆虫的发育过程[26-28],因此推测PsGBP可通过调节多巴胺的表达水平来影响昆虫的生长。为了进一步研究GBP的功能,以果蝇作为模式生物进行GBP调节生长机制的研究。Tsuzuki等[7]克隆并鉴定得到黑腹果蝇(D.melanogaster)的GBP同系物DmGBP1(CG15917),该基因编码含有118个氨基酸的蛋白质,与鳞翅目昆虫GBP的一级结构相似。对DmGBP1进行RNAi敲降以及过表达试验,结果发现DmGBP由脂肪体合成,分泌至血淋巴中,作用于雷帕霉素靶蛋白(TOR)信号传导途径的下游分子,刺激细胞产生和分泌胰岛素样肽(Insulin-like peptides, ILP),并增加大脑中胰岛素样肽生长因子的信号活性,促进营养生长[29],由此可推测GBP通过干预胰岛素通路来调节生长代谢。Meschi等[30]也发现GBP与胰岛素通路及营养生长有密切关系,GBP是表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor, EGFR)的一种非典型配体,由脂肪体合成的GBP激活EGFR后,作用于胰岛素合成细胞(Insulin-producing cells, IPC)和连接神经元(IPC-connecting neurons, ICN),可减轻ICN介导的IPC功能抑制,从而间接促进IPC分泌ILP,促进营养生长。DmGBP由脂肪体产生,通过血淋巴长距离转移至大脑,但尚不清楚其作用于ICN的分子机制与途径。

有研究结果表明,DmGBP在胚胎发生过程中发挥重要的作用。在果蝇胚胎发育早期,DmGBP将双侧叶融合在一起,促进了其前脑结构的形成[31]。已知Dfd转录表达能够促进幼虫头部上颌形态形成[32],而在黏虫中利用RNAi敲降Dfd表达的研究结果显示Dfd能够间接或直接调控DmGBP的表达水平,这些结果间接表明GBP可能参与昆虫的胚胎发育[31,33]。

在其他昆虫的发育过程中,GBP也扮演着十分重要的角色。蜕皮和变态是全变态昆虫的典型发育特征。如鳞翅目昆虫甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)完成其生活史需要经历卵、幼虫、蛹和成虫4个阶段,由保幼激素(JH)和蜕皮激素(MH)调控其发育历程。已有研究结果证明,用从杆状病毒侵染的昆虫细胞中纯化得到的SeGBP(甜菜夜蛾生长阻滞肽)注射甜菜夜蛾幼虫,可导致其生长延缓、化蛹时间延长且虫体质量显著降低;同时,蜕皮甾酮可上调SeGBP的表达,而保幼激素类似物下调SeGBP的表达,说明SeGBP在保幼激素和蜕皮甾酮的调控下作为一种生长因子调控甜菜夜蛾的发育进程[34]。此外,Duressa等[16]利用质谱法及生物测定法,分离鉴定了蝗虫(Locustamigratoria)体内GBP的同系物,在注射10～100 pmol的蝗虫GBP后,40%～50%的成虫延迟了蜕皮。

在昆虫体内GBP的表达量时刻动态地变化着。适量的GBP表达水平会促进昆虫免疫应答和生长发育,但过量的GBP则导致幼虫形态异常,甚至死亡[35]。有研究结果表明,高浓度的GBP能够显著降低黏虫幼虫的生长速度[36],并且以浓度依赖的方式导致家蚕(Bombyxmori)四龄幼虫麻痹和死亡[18]。同时,将BmGBP(家蚕生长阻滞肽)注射至饥饿处理的四龄家蚕幼虫中,会导致其前肠极度肿胀,而未经饥饿处理的幼虫也出现同样的表征,并且引起前肠区域内食物堆积,这可能是由于高浓度的BmGBP紊乱了肠道的神经调节功能所致[35],BmGBP可能通过影响肠道生理功能来延缓幼虫生长。

3 GBP影响昆虫免疫

在复杂生境下,昆虫依赖天然免疫系统防御病原微生物的侵染并维持机体免疫内稳态。昆虫天然免疫主要由细胞免疫及体液免疫组成,抗菌肽是昆虫体液免疫的主要效应分子[37-38]。果蝇在感染黏质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)及受到温度胁迫、机械损伤胁迫后,脂肪体中的DmGBP基因以及抗菌肽编码基因被显著上调表达;单独RNAi干扰DmGBP导致抗菌肽表达量降低,而利用hs-Gal4/UAS-GBP体系过表达DmGBP会导致抗菌肽的表达量上升。上述研究结果证明外来细菌入侵和环境的物理胁迫都会导致DmGBP表达量上升,从而促进应激源诱导的抗菌肽表达[7]。另外,GBP同系物已经被证明在果蝇中发挥细胞因子的作用,能够促进一氧化氮的产生并诱导一氧化氮合酶的表达,调节免疫应激反应,进而防御外来病原物的侵染[17]。

在细胞试验中,从黑腹果蝇体内分离得到的DmGBP会促进血细胞扩散,这与在蝗虫体内注射GBP而导致血细胞扩散性增加的结果一致[7,16]。进一步的研究结果表明,DmGBP还在昆虫体内发挥调节体液免疫和细胞免疫的作用。DmGBP通过磷脂酶C/Ca2+信号级联作用,介导血小板衍生生长因子和血管内皮生长因子受体同源物的分泌,从而级联放大细胞外信号,调节蛋白质激酶来抑制抗菌肽的合成,即抑制体液免疫,促进血细胞扩散,调控细胞免疫[39]。使用蛋白质免疫印记和免疫荧光染色并结合分子生物学试验发现,SeGBP可与球孢白僵菌(Beauveriabassiana)的细胞壁结合,且在抗菌活性测定中发现SeGBP能够杀死球孢白僵菌,表明GBP及其同系物可能在昆虫体内具有类似抗菌肽的功能以抵御细菌入侵[34]。

4 GBP对昆虫其他生理活动的调控

通过靶向筛选编码膜蛋白基因的dsRNA文库,Sung等[11]鉴定到G蛋白偶联受体Mthl10是DmGBP的膜受体。通过敲降Mthl10,显著降低了果蝇对外界胁迫(如低温、细菌感染等)的防御和抵抗能力。但DmGBP与其受体Mthl10的结合不仅可以抵御外界胁迫,对于自身机体损伤的修复也同样发挥重要作用。有研究结果表明,DmGBP会参与细胞对伤口的修复,GBP作为Mthl10的配体,与Mthl10结合后激活下游Ca2+的释放,进一步促进伤口修复和免疫反应[40]。DmGBP诱导的Ca2+浓度增加还会导致多巴脱羧酶和酪氨酸羟化酶的特异性表达,从而影响黏虫幼虫表皮黑色素和多巴胺的合成[9,41]。

杆状病毒是一类大分子的双链DNA病毒,仅感染节肢动物,尤其是鳞翅目昆虫,而对非靶标生物无害[42]。利用转基因技术,将SeGBP的cDNA序列和蜜蜂蜂毒信号肽融合,插入杆状病毒转移载体 pBacPAK8中,成功在杆状病毒AcNPV中表达SeGBP,侵染草地贪夜蛾卵巢细胞(Sf9)后导致细胞活力显著降低。免疫荧光染色定位SeGBP位于Sf9的细胞质中,与野生型AcNPV侵染Sf9相比,重组 AcNPV显著诱导了Sf9细胞凋亡[43]。

5 GBPs参与的信号通路

在果蝇这一模式动物中,GBP信号通路研究得较为清楚。当果蝇受到外源刺激时,可通过血淋巴中的活性氧刺激血细胞细胞质中的Ca2+浓度上升,释放出一种未知的、相对分子质量大小约为50 000的激活因子来激活DmGBP水解蛋白,从而将脂肪体中ProGBP的N-端活性肽部分水解而激活,激活后的DmGBP与其受体结合,通过免疫缺陷(IMD)通路中的转化生长因子激酶下游分支,激活c-Jun氨基末端激酶信号通路,促进抗菌肽的表达,并通过激活细胞外信号调节激酶信号通路,调节细胞免疫反应。当果蝇在正常的环境下生长时,雷帕霉素靶蛋白(Target of rapamycin,TOR)能够感知营养状态,使适量的DmGBP通过血淋巴长距离转移至大脑,促进胰岛素的分泌,从而促进生长(图2)[11,29,39-40,44-45]。

GBP:生长阻滞肽;PLC:磷脂酶C;Pvf:血小板衍生生长因子;Pvr:血管内皮生长因子受体; JNK:c-Jun氨基末端激酶;IMD:免疫缺陷;Mthl 10:GBP受体;FoxO:叉头盒蛋白O。图2 生长阻滞肽(GBP)参与昆虫生理调控的工作模型Fig.2 Working model of growth-blocking peptide (GBP) participating in insect physiological regulation

GBP在血淋巴中的浓度由GBP结合蛋白(GBP-binding protein,GBP-BP)调控。Matsumoto等[46]发现PsGBP激活细胞免疫反应后,类绛色细胞在PsGBP刺激下裂解释放PsGBP-BP,该蛋白质能够显著降低血淋巴中PsGBP的浓度。后续的试验结果证明这一调节反应可能是由昆虫蜕皮激素调控,Zhuo等[47]使用20羟基蜕皮酮(20E)处理棉铃虫(Helicoverpaarmigera)后,由类绛色细胞释放的HaGBP-BP通过其N端结合并清除血浆中的HaGBP,从而抑制了HaGBP诱导的浆血细胞扩散和包囊作用,有利于昆虫迅速实现从细胞免疫到体液免疫的转变。这一负反馈调节似乎再次验证了GBP在平衡昆虫细胞免疫和体液免疫中起到至关重要的作用。

6 展 望

关于GBP的功能和调控机制尚有诸多未解之谜。GBP是一种双重生长调节因子,在高浓度时抑制幼虫生长,在低浓度时促进细胞增殖[36]。通过敲除与过表达试验,Koyama等[29]验证了GBP在果蝇体内产生作用具有剂量依赖性,证明适度表达量下的GBP可能对昆虫的生长有积极作用。但在昆虫体内,是何物质调控GBP及通过什么途径维持GBP的平衡仍需要更进一步的研究。

哺乳动物中,脂肪组织与中枢神经系统的信息交流在维持机体稳态中发挥重要的作用。在发生慢性炎症时,往往会产生错误的能量存储和信号转导。最新的研究结果揭示了神经元介导的哺乳动物大脑与脂肪组织间的连接与通信是保持内稳态的关键因素[48]。而在昆虫体内,激活免疫反应需要庞大的能量供应,因此需要减少非免疫组织代谢的信号传导与能量分配[49]。目前,已有研究结果表明昆虫免疫反应和生长代谢之间平衡的相关分子机制。果蝇在进行免疫应激反应时,体内的Toll信号途径会抑制胰岛素信号,从而降低营养存储和生长代谢,以增强对外源胁迫的抵抗性和适应性[50]。由脂肪体产生的细胞因子GBP能够激活免疫反应,也可传递至大脑中促进胰岛素的合成,从而促进生长。研究GBP权衡这2种存在能量分配的生理过程的分子机制,分析机体如何调控GBP进行组织间的转运与分布,或许会为揭示昆虫体内“脂肪体-大脑”的组织间通信交流、生物适应环境胁迫的机制提供新思路。

GBP与寄生体系密切相关[6]。被内寄生蜂(C.kariyai)寄生后的黏虫(P.separata)神经节中GBP的表达量比未寄生幼虫高2～3倍[51]。有研究结果表明,在寄生或注射多分DNA病毒(Polydnavirus, PDV)后,黏虫幼虫脂肪体中的ProGBP与GBP加工酶的活性水平显著提高[36]。寄生蜂通过寄生因子调控寄主昆虫免疫与发育已被多次验证[52]。在功能上,GBP参与的生理调节反应与寄生因子相近,主要包括抑制或延缓寄主昆虫发育,调节其免疫反应等。推测GBP可能被寄生蜂的寄生因子调控,从而改变寄主昆虫体内的免疫与代谢水平,为寄生蜂子代创造最佳生长发育环境。深入研究GBP与寄生物及宿主昆虫之间的联系,并结合“以虫治虫”的方法,可有助于开发出针对害虫防治的植保新技术。