菌剂对鸡粪-生物炭堆肥理化性质和微生物群落结构的影响

王瑞飞, 孔盈利, 魏艺璇, 白 双, 展莉平, 张 昊, 李明军, 杨清香

(1.河南师范大学生命科学学院,河南 新乡 453007; 2.河南省农业微生物生态与技术国际联合实验室,河南 新乡 453007)

禽畜粪便中含有大量营养成分,是一种潜在的生物质能源。中国每年的禽畜粪便产生量超过3.0×109t,但是其综合利用率不足60%[1]。禽畜粪便的不合理处置不仅造成大量养分流失,而且极易造成农业面源污染,给生态环境造成巨大压力[2]。因此,禽畜粪便的资源化利用不仅能降低禽畜粪便的污染风险,而且能够实现禽畜粪便的再利用,对推动禽畜养殖业的可持续发展具有十分重要的意义。

目前,高温堆肥已经成为中国实现禽畜粪便资源化的最有效方式之一[3],具有无害化处理彻底、附加值高、经济效益好等优点,但也存在腐熟周期长、营养流失多等问题。为了提高高温堆肥的效果,研究者主要围绕2个方面展开研究。一方面是高温堆肥过程中的条件(如物料成分、通风量、含水率等)的优化[4-5],另一方面是开发推进禽畜粪便腐熟进程的微生物菌剂、硝酸钾等外源添加剂[6]。研究发现,微生物是高温堆肥顺利进行的核心决定因素,其他条件和因素往往通过影响堆肥中的微生物来调控有机质转化和物料的腐殖化[7-8]。由于接种微生物菌剂可以直接调节堆肥物料中的微生物种类和数量,提高微生物活性,加速有机质的分解,因此,研究微生物菌剂对堆肥过程中微生物群落变化的影响及其作用机制已经成为目前堆肥研究中的热点[9-11]。

鸡粪是中国重要的有机肥源之一,生物炭是固体废弃物在缺氧条件下热解产生的具有发达空隙结构、比表面积大的稳定富碳物质。已有研究结果表明,生物炭与鸡粪混合后使堆肥物料的堆体密度更小、透气性更好,有利于微生物的繁殖和活性发挥[12]。近年来,伴随着高通量测序技术在各种环境微生物群落分析中的应用[13],部分研究者已经应用高通量测序技术对生物炭禽畜粪便堆肥中的微生物群落结构、多样性和丰度进行了分析。例如,Jiang等[14]通过内转录间隔区(Internal transcribed spacer,ITS)测序发现,牛粪生物炭堆肥中主要真菌属的丰富度随着堆制进程的推进而变化,在堆制初期的真菌主要是曲霉属真菌(Aspergillus)和未分类真菌(Unclassied fungi),在堆制末期的真菌主要是Myriococcum、未分类的小囊菌(UnclassifiedMicroascaceae)和枝顶孢属真菌(Acremonium),且与不加生物炭的牛粪堆肥中的微生物群落变化有明显区别;Duan等[15]通过16S rDNA、ITS测序发现,羊粪苹果树生物炭混合能够增加堆制过程中细菌的多样性,减少真菌群落的多样性,与微生物相关的酶活性也随之改变,从而加快了腐熟进程;Zhai等[16]通过高通量测序发现,在鸡粪生物炭混合堆肥堆制过程中,N2O释放相关微生物从22个下降到19个,从而削弱了反硝化进程,提升了堆肥质量。尽管目前相关研究已取得了一定进展,但是鲜有研究利用高通量测序技术全面评价菌剂对鸡粪-生物炭堆肥堆制过程中细菌、真菌群落演替的影响。

本研究首先分析微生物菌剂对鸡粪-生物炭堆肥理化性质的影响。随后,通过细菌16S rDNA、真菌ITS高通量测序技术和信息学分析,探讨菌剂对堆肥堆制中细菌、真菌群落演替的影响。最后,利用种子萌发试验初步评估菌剂腐熟鸡粪-生物炭堆肥对植物生长的潜在促进作用,以期为深入阐明菌剂促进禽畜粪便堆制过程中腐熟的微生物学机制提供理论借鉴,为堆肥腐熟菌剂的开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

上海青种子,购自河南省新乡市种子市场。2019年6月,在河南省焦作市武陟县某生物有机肥厂进行鸡粪-生物炭堆肥堆制试验。鸡粪含水率50%,总有机碳含量28.62%,全氮含量1.70%,碳氮质量比约17∶1;生物炭含水率10%,总有机碳含量30.11%,全氮含量1.11%,碳氮比约27∶1。

菌剂菌种的制备。芽孢杆菌(Bacillussp.)BA、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)K1、巨大芽孢杆菌(Bacillusmagaterium)J2和木霉(Trichodermasp.)M1,均为笔者所在课题组自行筛选并保藏。用无机盐培养基(4 g磷酸氢二铵,2 g硫酸钾,1 g氯化钠,20 g葡萄糖,10 ml 100倍浓缩的微量元素,0.6 g七水合硫酸镁,1 000 ml蒸馏水,pH值7.0)进行细菌发酵培养(37 ℃,24 h),调整活菌数达1×108CFU/ml;用麸皮培养基(含有40%水分的麸皮)对木霉M1进行培养(28 ℃,7 d),用无菌水冲洗收集孢子,调节孢子含量至1×108CFU/ml。堆肥堆制前将细菌和孢子等量混合。

1.2 试验设计和样品的采集

将鸡粪和生物炭混合均匀,调节含水率约为50%,碳氮比约为21∶1,采集初始混合样品(CS),然后将混合物料分为对照组、处理组(各5 t混合物料),处理组接种细菌和真菌混合菌剂(1×106CFU/kg);对照接入与处理组等量的无菌水。堆体表面覆土,每周翻堆1次。堆肥堆制持续64 d,在堆肥堆制的第4 d、14 d、30 d、53 d,于同一堆体5个不同点距堆体表面20 cm处分别取样,均匀混合作为1个样品,并分成2份,分别用于堆肥理化性质测定、DNA提取(高通量测序)。根据采样时间,分别将对照组样品命名为C4(4 d)、C14(14 d)、C30(30 d)、C53(53 d),分别将处理组样品命名为T4(4 d)、T14(14 d)、T30(30 d)、T53(53 d)。

1.3 堆肥理化性质测定

每天8:30-9:30用温度计分别测定堆体中心面3个位置距表面20 cm处的温度,取其平均值作为堆体温度,同时记录环境温度;用105 ℃烘干法测定堆体含水率,将堆肥样品与蒸馏水按照1∶10(质量体积比)混匀后测定pH值[17];采用总有机碳(Total organic carbon,TOC)仪测定总有机碳含量[18];用连续流动分析仪(AA3型)测定全氮含量[19];铵态氮、有效磷、速效钾含量的测定方法参考NY525-2012《有机肥料》[20]。

1.4 高通量测序

用FastDNA®Spin Kit for Soil试剂盒提取样品DNA,用NanoDrop2000 Spectrophotomete(美国赛默飞世尔科技公司)检测DNA纯度和浓度,用上海美吉公司的Illumina MiSeq平台进行细菌16S rRNA基因V3、V4区(338F:5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′;806R:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)和真菌ITS区(ITS1F:5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′;ITS2R:5′-GCTGCGTTCTTCATCGA-3′)的扩增测序[21]。

1.5 种子萌发试验

种子萌发试验参考已有的方法[22],并做适当修改,具体操作如下:将5 g腐熟后的鸡粪-生物炭堆肥与去离子水按1∶10(质量体积比)混合后浸提30 min,获得浸提液,将上海青种子先用1%次氯酸钠溶液浸泡15 min,再用蒸馏水清洗3遍。取5 ml浸提液,加入铺有滤纸的直径90 mm的培养皿中,每皿放置30粒种子(共2皿),25 ℃培养48 h。记录种子发芽情况和根长,以去离子水代替浸提液的处理作为对照。

1.6 数据分析与处理

用Graphpad prism 8.0、Origin 2018和Excel 2007进行数据统计分析,借助上海美吉公司云平台(https://cloud.majorbio.com/)进行高通量数据分析。分别用FLASH 1.2.11、QIIME 1.9.1和UCHIME 8.1进行高通量测序数据原始读数合并、质量控制和数据优化,用Uparse 7.0.1090、Bayesian算法获得操作分类单元(OTU,相似度97%),用Silva细菌16S rRNA数据库、真菌ITS数据库进行细菌、真菌分类,用Mothur 1.30.2计算Shannon指数。

2 结果与分析

2.1 菌剂对鸡粪-生物炭堆肥堆制过程中理化特性的影响

2.1.1 菌剂对堆肥堆制过程中物料颜色、状态及气味的影响 颜色和状态是堆肥物料腐殖化的重要表观特征[23]。随着堆肥堆制过程中水分、多糖类物质含量的变化,物料通常由块状、易粘结、有恶臭味逐渐变得均匀松散且有土腥味。图1显示,鲜鸡粪与生物炭混合后,堆体呈现粘结状,内部呈黑色,臭味明显。随着堆制过程的推进,对照(未接种菌剂)和处理组(接种菌剂)堆体的颜色均渐变为褐色。但是,处理组堆体的颜色变化早于对照。在堆肥堆制的第4 d时,处理组的块状堆体物料团块已明显变小,刺激性粪臭味基本消除,蚊蝇聚集减少;在堆肥堆制第14 d时,堆体物料已呈现团粒状松散状态;在堆肥堆制第53 d,堆体带有明显土腥味。但是,对照在堆肥堆制第30 d才呈现团粒状松软状态,直至堆肥堆制第53 d仍有刺激性臭味。上述表观特征的变化表明,接种菌剂明显加快了堆肥堆体的腐熟进程。

A:堆肥堆制的现场场景;B:不同时间堆肥物料的形态、颜色变化。图1 菌剂对堆肥堆体颜色及形态的影响Fig.1 Effects of microbial agents on compost color and morphology

2.1.2 菌剂对堆肥堆制过程中温度、含水率和pH值的影响 温度、pH值和含水率与微生物新陈代谢密切相关,经常作为判断堆肥是否腐熟的重要指标[24]。温度监测结果显示,对照、处理组均能在堆肥堆制的0～4 d内快速升温,其中处理组堆体的温度在堆肥堆制第4～15 d维持在70 ℃以上,最高温度达到76 ℃,之后温度开始下降,在堆肥堆制第64 d,堆体温度降至40 ℃左右。对照的温度虽然在堆肥堆制的第4 d升至60 ℃以上,但是在堆肥堆制第4～64 d,其温度长期维持在60 ℃以上,并且其最高温度(72 ℃)明显低于处理组(图2A)。含水率监测结果显示,物料的初始含水率约为50%,在堆肥堆制第53 d,对照、处理组的含水率分别为15.39%、17.06%,但是处理组含水率在堆肥堆制第4～30 d的下降速度明显快于对照(图2B)。pH值监测结果显示,2组堆肥堆体的pH值始终保持在7.5～8.3,在堆肥堆制第53 d,对照、处理组的pH值分别为8.20、7.97,均符合中国农业有机肥的标准,但是2组堆肥pH值的变化趋势有所不同(图2C)。以上结果表明,接种微生物菌剂明显促进了鸡粪-生物炭堆肥堆体的温度、水分和pH值的变化,有利于堆肥堆体的腐熟。

A:温度;B:含水率;C:pH值。图2 菌剂对堆肥堆体温度、含水率及pH值的影响Fig.2 Effects of microbial agents on composting temperature, moisture content and pH

2.1.3 菌剂对堆肥堆制过程中总有机质、全氮、铵态氮、有效磷和速效钾含量的影响 堆肥的腐熟本质上是微生物对物料中的有机质进行降解转化的过程[8]。有机质含量测定结果表明,物料中总有机质的平均初始含量为383.70 g/kg,随着堆肥堆制过程的推进,处理组和对照有机质含量整体均呈下降趋势,在堆肥堆制第53 d,对照和处理组的总有机质含量分别比堆肥初期降低了18.9%(72.60 g/kg)和38.8%(148.90 g/kg)(图3A)。全氮含量测定结果表明,平均初始全氮含量为21.50 g/kg,随着堆肥堆制过程的推进,处理组与对照的全氮含量均呈上升趋势,在堆肥堆制第53 d,对照和处理组全氮含量分别增加了36.05%(7.75 g/kg)和64.05%(13.77 g/kg)(图3B)。铵态氮含量测定结果表明,铵态氮的平均初始含量为186.20 mg/kg,在堆肥堆制过程中,处理组的铵态氮含量始终低于对照,在堆肥堆制第53 d,对照和处理组的铵态氮含量分别比堆肥初期降低了30.5%(56.70 mg/kg)和50.8%(94.53 mg/kg)(图3C)。以上结果表明,菌剂能极大促进有机质分解,增加堆肥堆体的全氮含量,减少堆肥堆体中的铵态氮含量,从而产生明显的保氮效果。

A:总有机质含量;B:全氮含量;C:铵态氮含量。图3 菌剂对堆肥堆体中总有机质、全氮及铵态氮含量的影响Fig.3 Effects of microbial agents on the contents of total organic matter, total nitrogen and ammonium nitrogen in compost

有效磷含量测定结果表明,物料中的有效磷初始含量为71.00 mg/kg,在堆肥堆制过程中,处理组的有效磷含量始终高于对照(图4A)。在堆肥堆制第53 d,对照和处理组的有效磷含量分别比堆肥初期增加了16.5%(11.75 mg/kg)和38.6%(27.45 mg/kg)。速效钾含量测定结果表明,物料中的速效钾初始含量为224.10 mg/kg,其在堆肥堆制过程中的变化趋势与有效磷含量相似,在堆肥堆制第53 d,对照和处理组的速效钾含量分别比堆肥初期增加35.1%(78.74 mg/kg)和57.6%(129.14 mg/kg)(图4B)。由此可见,菌剂能够促使物料中的磷元素、钾元素向更易被植物吸收的可利用态转变。

A:有效磷含量;B:速效钾含量。图4 菌剂对堆肥堆体中有效磷、速效钾含量的影响Fig.4 Effects of microbial agents on the content of available phosphorus and available potassium in compost

2.2 菌剂对堆肥堆制过程中细菌、真菌群落多样性的影响

高通量测序结果显示,不同样品产生的细菌高质量序列数为45 189～56 038条,这些序列聚类为377～632个分类操作单元(Operational taxonomic unit,OTU);真菌高质量序列数为55 390～73 234条,这些序列聚类为128～637个OTU。处理组细菌OTU数量和Shannon指数在各个时期均明显高于对照,而真菌的相应数值总体上表现出相反趋势(表1)。上述结果表明,菌剂促进了堆肥堆制过程中微生物群落结构的变化。

表1 高温堆肥堆体样品中细菌、真菌的丰度与多样性

2.2.1 菌剂对堆肥堆制过程中细菌群落组成的影响 如图5所示,在门水平上,对照中厚壁菌门(Firmicutes)细菌的相对丰度维持在80.0%以上,为绝对优势菌门,放线菌门(Actinobacteria)细菌的相对丰度在堆肥堆制后期(第53 d)明显提高,达到16.00%。处理组中,厚壁菌门(Firmicutes)在堆肥堆制前30 d仍为绝对优势菌门,相对丰度>78.00%,但是放线菌门(Actinobacteria)细菌的相对丰度在堆肥堆制后期(第53 d)提高到66.40%,取代厚壁菌门(Firmicutes)细菌成为最丰富的细菌门细菌,变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和绿弯菌门(Chloroflexi)细菌的相对丰度也明显提高,分别达到为4.80%、10.00%和6.00%。

CS代表鸡粪和生物炭的起始混合样品,C表示对照,T表示处理组,14、30、53分别代表堆肥堆制时间为14 d、30 d、53 d。Firmicutes:厚壁菌门;Actinobacteria:放线菌门;Proteobacteria:变形菌门;Bacteroidetes:拟杆菌门;Chloroflexi:绿弯菌门;Others:其他。图5 门水平上细菌群落组成Fig.5 Composition of bacterial community at phylum level

如图6所示,在堆肥堆制第14 d,在属水平上,对照细菌相对丰度大于1%的优势属主要为樱桃样芽孢杆菌(Cerasibacillus)、未分类芽孢杆菌(Unclassified-f-Bacillaceae)、假纤细芽孢杆菌(Pseudogracilibacillus)、芽孢杆菌(Bacillus)和肉杆菌(Atopostipes)等。随着堆肥堆制过程的进行,上述属细菌的相对丰度不断发生变化,如肉杆菌(Atopostipes)的相对丰度明显降低,樱桃样芽孢杆菌、未分类芽孢杆菌的相对丰度先升后降,在堆肥堆制第53 d接近0;布哈加瓦氏菌(Bhargavaea)、假纤细芽孢杆菌的相对丰度先降后升,在堆肥堆制第53 d,相对丰度分别高达33.23%、10.75%。在堆肥堆制第14 d,处理组相对丰度大于1.00%的优势菌属(10个)与对照(8个)有高度的相似性(7个一致),但是相对丰度存在显著差异,如樱桃样芽孢杆菌、假纤细芽孢杆菌在处理组的相对丰度分别为3.20%、22.17%,但在对照中的相对丰度分别为22.12%、11.40%。随着堆肥堆制过程的推进,处理组与对照中相对丰度大于1.00%的共有属的组成成员逐渐减少,在堆肥堆制第53 d,处理组只有5个相对丰度大于1.00%的属与对照相同,并且这些属的相对丰度均低于4.00%。进一步分析发现,处理组中糖霉菌(Glycomyces)、阮继生氏菌(Ruania)、布哈加瓦氏菌(Bhargavaea)的相对丰度较高,分别为8.00%、13.39%、16.46%,而对照中这3个细菌的相对丰度则接近0;布哈加瓦氏菌(Bhargavaea)、假纤细芽孢杆菌、薄壁芽孢杆菌(Gracilibacillus)、海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus)表现出相反的趋势。由此可见,在属水平上,处理组和对照的细菌群落结构在堆肥堆制进程中的变化有明显差异。

A:第14 d相对丰度差异显著的细菌属;B:第30 d相对丰度差异显著的细菌属;C:第53 d相对丰度差异显著的细菌属。CS代表鸡粪和生物炭的起始混合样品,C表示对照,T表示处理组,14、30、53分别代表堆肥堆制时间为14 d、30 d、53 d。Pseudogracilibacillus:假纤细芽孢杆菌;Cerasibacillus:樱桃样芽孢杆菌;Unclassified-f-Bacillaceae:未分类芽孢杆菌; Bacillus:芽孢杆菌;Bhargavaea:布哈加瓦氏菌;Atopostipes:肉杆菌;Oceanobacillus:海洋芽孢杆菌;Thermobifida:高温双歧菌属;Amphibacillus:双芽孢杆菌属;Saccharomonospora:糖单胞菌属;Tepidimicrobium:热微菌属;Planifilum:直丝菌属;Streptomyces:链霉菌属;Corynebacterium_1:棒状杆菌_1;Glycomyces:糖霉菌;Ruania:阮继生氏菌;Gracilibacillus:薄壁芽孢杆菌属;Unlassified-f-Micrococcaceae:未分类的微球菌科成员;Virgibacillus:枝芽孢杆菌属;Salinicoccus:盐水球菌属;Brachybacterium:短状杆菌属;Georgenia:乔治菌属;Brevibacterium:短杆菌属;Norank-f-Bacillaceae:未明确属的芽孢杆菌科成员。 图6 属水平上细菌相对丰度有显著差异的群落Fig.6 Communities with significant differences in relative abundance of bacteria at the genus level

2.2.2 菌剂对堆肥堆制过程中真菌群落组成的影响 如图7所示,在门水平上,子囊菌门(Ascomycota)、被孢霉门(Mortierellomycota)、未分类真菌门(Unclassified-Fungi)和担子菌门(Basidiomycota)为所有样品中的优势菌门,尤其是Ascomycota占有绝对优势地位,其在各样品中的相对丰度为57.73%～98.76%。此外,对照样品中Ascomycota的相对丰度在堆肥堆制第30 d、53 d分别为59.24%、74.14%,明显低于其在处理组第30 d的相对丰度(69.94%)和第53 d的相对丰度(98.76%)。

如图8所示,在属水平上,在堆制第14 d的堆肥样品中,对照、处理组中相对丰度>1.00%的属均包含被孢霉(Mortierlla)、木霉(Trichoderma)、念珠菌(Diutina)、篮状菌(Talaromyces) 和镰刀霉(Fusarium)等,但被孢霉(Mortierlla)、木霉(Trichoderma)在处理组中的相对丰度均高于对照,而篮状菌属(Talaromyces)、德巴利氏酵母(Debaryomyces)则相反。随着堆肥堆制进程的推进,被孢霉(Mortierlla)、念珠菌(Diutina)、篮状菌(Talaromyces)和镰刀霉(Fusarium)的相对丰度在对照中均出现显著下降,在堆肥堆制第53 d均低于5.00%;毛孢子菌(Cutaneotrichosporon)的相对丰度则显著上升,在堆肥堆制第53 d达到6.90%;德巴利氏酵母(Debaryomyces)的相对丰度先下降后上升,在堆肥堆制第53 d达到13.45%。在处理组中,尽管上述菌的相对丰度随着堆肥堆制进程的推进也表现出浮动,但是枝顶孢霉(Acremonium)在处理组中的相对丰度变化最为明显,呈现连续升高的趋势,在堆肥堆制第53 d高达94.9%,成为处理组真菌群落中的绝对主导,其他菌的相对丰度均低于1.00%,而对照中枝顶孢霉(Acremonium)的相对丰度则一直处于较低水平。因此可见,真菌群落成员的相对丰度在处理组和对照中表现出明显差异。

A:堆肥堆制第14 d相对丰度差异显著的真菌属;B:堆肥堆制第30 d相对丰度差异显著的真菌属;C.堆肥堆制第53 d相对丰度差异显著的真菌属。CS代表鸡粪和生物炭的起始混合样品,C表示对照,T表示处理组,14、30、53分别代表堆肥堆制的第14 d、30 d、53 d。 Mortierella:被孢霉;Diutina:念珠菌;Debaryomyces:德巴利氏酵母;Talaromyces:篮状菌; Trichoderma:木霉;Fusarium:镰刀霉;Aspergillus:曲霉;Cutaneotrichosporon:毛孢子菌;Wallemia:节担菌属;Guehomyces:耐冷酵母属;Plectosphaerella:小不整球壳属;Metarhizium:绿僵菌属;Penicillium:青霉属;Acremonium:枝顶孢霉;Dichotomopilus:二分枝毛壳属;Dipodascus:双足囊菌属;Saitozyma:沙蜥属;Acaulium:无茎真菌属;Acrostalagmus:笋顶孢属;Melanocarpus:黑果球粉衣属。图8 属水平的真菌相对丰度存在显著差异的物种Fig.8 Species with significant differences in relative abundance of fungi at genus level

2.3 菌剂处理的堆肥促进上海青种子萌发和根生长的效果

在菌剂处理的堆肥浸提液培养下,上海青种子的萌发结果如图9所示,可以看出,处理组种子培养48 h的萌发率(91.60%)高于对照(83.30%),其平均根长(1.59 cm)是对照(1.25 cm)的1.27倍。因此可见,菌剂处理的堆肥有效刺激了种子萌发和根生长,对植物生长有潜在促进作用。

A:不同时间点的根长;B:培养第48 h的发芽率;C:培养第48 h的根长。图9 菌剂处理的堆肥对上海青种子萌发率和根长的影响Fig.9 Effects of the compost treated with microbial agents on seed germination rate and root length of Brassica rapa var. chinensis (Linnaeus) Kitamura

3 讨 论

高温堆制是实现禽畜粪便资源化、无害化的重要手段,但是传统的高温堆制往往存在周期长、营养流失多等问题[2]。接种微生物菌剂能够直接影响堆体中的微生物组成,从而有效促进堆肥腐熟,克服传统高温堆制的缺点。因此,开发高效腐熟菌剂,深入探讨其微生物学机制就显得尤为重要。

相关研究结果表明,堆肥是否腐熟不能用单一指标进行评价[24]。因此,本研究首先综合评价菌剂对鸡粪-生物炭堆肥堆制过程中多个腐熟指标的影响。结果显示,菌剂显著促进鸡粪-生物炭堆肥堆制过程中温度、含水率、pH值的变化和臭味的去除,并缩短腐熟时间,而且菌剂处理的堆肥最终全氮、有效磷和速效钾含量均高于对照。本研究结果也得到了其他研究结果的间接支持。例如,Xu等[25]研究发现,由部分高温和中温微生物组成的菌剂可使牛粪-秸秆堆肥中的氨气释放量减少29.98%～46.94%;Li等[26]研究发现,由枯草芽孢杆菌等菌种组成的菌剂延长了猪粪-玉米芯堆肥的高温时间,使堆肥中的硝态氮含量比对照高21 g/kg。尽管本研究中所用菌剂能高效促进鸡粪-生物炭堆肥堆体腐熟,但是在中国,猪、牛、禽、羊的粪污产生量分别占畜禽粪污总产量的33.9%、48.3%、4.7%、13.1%[27]。因此,本研究中所用菌剂能否在其他禽畜粪便堆肥中广泛应用值得进一步探讨。

微生物群落是影响堆肥腐熟的核心因素[28-31],本研究结果表明,外加菌剂能高效促进堆肥堆制过程中微生物群落的变化。与对照相比,菌剂处理堆肥中的一些门如放线菌门(Actinobacteria)、子囊菌门(Ascomycota)的相对丰度显著升高,可能由于菌剂处理的堆肥提前进入腐熟期,为这些微生物生长提供了良好的环境条件[32]。属水平的分析结果表明,菌剂可能从2个方面促进鸡粪-生物炭堆肥中微生物群落的演替。一方面,接种菌剂提高了与有机质降解、同化相关微生物[如假纤细芽孢杆菌(Pseudogracilibacillus)、直丝菌(Planifilum)[33-34])]的相对丰度,同时降低了与碳氮损失相关微生物[如樱桃样芽孢杆菌(Cerasibacillus)、肉杆菌(Atopostipes)[35-36]]的相对丰度。上述结果与菌剂促进鸡粪-生物炭堆肥中总有机质含量减少和全氮含量增加的结果相呼应。另一方面,菌剂促进了生防真菌的生长。例如,枝顶孢霉(Acremonium)中的成员如Acremoniumsp. Ld-03能够抑制病原真菌镰刀霉(Fusarium)的生长,可能通过产生多种肽类和环肽类抗生素实现[37-38]。在本研究中,枝顶孢霉(Acremonium)在处理组堆肥堆制进程中相对丰度持续升高,最终高达94.9%。此外,菌剂处理能够明显降低一些潜在病原菌如毛孢子菌(Cutaneotrichosporon)[39]、镰刀霉(Fusarium)的相对丰度。此外,在堆肥堆制第14 d、30 d,处理组堆肥中布哈加瓦氏菌(Bhargavaea)、假纤细芽孢杆菌(Pseudogracilibacillus)、薄壁芽孢杆菌(Gracilibacillus)的相对丰度均显著高于对照,然而在堆肥堆制第53 d,上述细菌在对照中的相对丰度却显著高于处理组。由此可见,布哈加瓦氏菌(Bhargavaea)、假纤细芽孢杆菌(Pseudogracilibacillus)、薄壁芽孢杆菌(Gracilibacillus)这3个菌在常规的鸡粪-生物炭堆肥堆制过程中也会随着堆肥堆制进程的推进而使相对丰度发生改变,但是接种菌剂则会加速这一过程。

综上,接种微生物菌剂可能通过影响堆肥堆制过程中物质转化相关微生物的相对丰度、抑制病原微生物生长、加速高温堆肥堆制过程中微生物的演替等促进堆肥理化性质的变化,从而提高堆肥的腐熟速度和质量。本研究结果为阐明微生物菌剂在高温堆肥堆制过程中的微生物学机制及其应用提供了参考,在下一步研究中,将对菌剂接入量、菌剂中各菌种比例对堆肥堆制进程的影响及菌剂使用范围进行探究,以期开发出更为高效的堆肥腐熟菌剂。

4 结 论

微生物菌剂能够高效促进鸡粪-生物炭堆肥过程中温度、水分、pH值的变化和臭味的去除,增加堆肥中的总氮、有效磷钾含量,减少堆肥中铵态氮含量,因此微生物菌剂能有效加快鸡粪-生物炭堆肥的腐熟进程,提高堆肥质量。微生物菌剂能够高效促进鸡粪-生物炭堆肥堆制过程中微生物群落的演替。在门水平上,菌剂能够促使堆肥堆体中绝对优势真菌子囊菌门(Ascomycota)真菌的相对丰度明显提高,而绝对优势细菌由厚壁菌门(Firmicutes)细菌变为放线菌门(Actinobacteria)细菌;在属水平上,菌剂能够刺激堆肥堆体中具有强有机质降解能力的假纤细芽孢杆菌(Pseudogracilibacillus)、布哈加瓦氏菌(Bhargavaea)等和具有生防潜力的链霉菌(Streptomyces)、枝顶孢霉(Acremonium)等相对丰度提高,降低一些致病性真菌属[如毛孢子菌(Cutaneotrichosporon)和镰刀霉(Fusarium)]真菌的相对丰度。处理组堆肥有效刺激了上海青种子萌发和根生长,种子培养48 h后的萌发率、根长分别达到91.60%、1.59 cm,均高于对照。