大豆GmNCED1-2的非生物胁迫诱导表达及其转基因烟草鉴定

于海伟, 李铭杨, 张 军, 李珊珊, 张梅娟, 马天意, 赵 艳, 兰红宇, 翟 莹

(1.齐齐哈尔大学生命科学与农林学院,黑龙江 齐齐哈尔 161006; 2.黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院,黑龙江 齐齐哈尔 161005; 3.黑龙江省农业科学院齐齐哈尔分院,黑龙江 齐齐哈尔 161006)

脱落酸(Abscisic acid,ABA)是以异戊二烯为基本单位的半萜烯化合物。作为植物的重要激素,ABA不仅具有促进种子休眠、影响根系结构、调节气孔关闭、促使叶片衰老脱落等多种生理作用[1],还参与逆境条件下植物的适应过程[2]。在ABA合成路径中,9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)是一种关键的限速酶[3],该酶由NCED基因编码。因此,NCED基因的表达量直接影响植物体内ABA的含量。

第1个NCED基因是从玉米中克隆而来[4]。随着研究的不断深入,人们发现NCED基因在植物中常以多基因家族的形式出现。拟南芥NCED基因家族包括9个成员,其中5个成员(AtNCED2、AtNCED3、AtNCED5、AtNCED6、AtNCED9)的编码产物具有NCED酶活性,参与ABA的合成[5]。AtNCED3与拟南芥的抗旱性相关,过表达AtNCED3的转基因植株抗旱性得到提高[6-7]。AtNCED6和AtNCED9与种子萌发过程中的ABA合成相关[5]。此外,AtNCED9还参与高温胁迫下ABA的合成和种子萌发的抑制[8]。AtNCED5与AtNCED3共同参与水分胁迫下的ABA合成,AtNCED5与AtNCED6和AtNCED9则共同调控种子的休眠[9]。NCED基因在植物基因工程中的应用也在逐渐开展。在拟南芥中异位表达甘蓝型油菜BnNCED3促进了拟南芥种子休眠,使开花期提前,植株的抗逆性也得到提高[10]。番茄LeNCED1能够使转基因白三叶植株的ABA含量显著提高,蒸腾速率显著下降,从而使长期水分利用效率提高[11]。水稻OsNCED4在拟南芥中的异源表达改变了转基因植株大小和叶片形状,延缓了种子萌发并导致萌发后的植株生长对糖超敏感,增强了对干旱胁迫的耐受性[12]。过表达野海棠MhNCED3的转基因拟南芥对渗透和镉胁迫的耐受性增强[13]。AtNCED3的过表达则能够提高温室和大田条件下转基因大豆的抗旱性[14]。

作为一种重要的油料作物,人们对大豆的功能基因研究始终热度不减。前人已从大豆中鉴定出一个能够应答非生物胁迫和外源ABA的NCED基因(GmNCED1),其过表达可以提高转基因植株的抗盐性和抗旱性[15-16]。本研究对大豆中的另一个NCED基因GmNCED1-2进行克隆及功能初探,为其后续功能研究及应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用大豆品种北豆9号、烟草品种NC89、菌种大肠杆菌DH5α和根癌农杆菌EHA105由本实验室保存和提供。

1.2 试验方法

1.2.1 大豆幼苗非生物胁迫处理 使用Hoagland营养液,参照李铭杨等的方法水培大豆幼苗[17]。播种14 d后,幼苗的第一片三出复叶已经完全展开,此时进行非生胁迫处理。将幼苗移至含有200 μmol/L ABA的Hoagland营养液中处理培养。干旱、高盐、高温和低温处理均参照李铭杨等的方法[17]。在ABA、干旱、高盐、高温和低温处理不同时间点(0 h、1 h、2 h、5 h、10 h和24 h)取幼苗的三出复叶0.1 g,同时取未经处理的幼苗叶片、根和茎各0.1 g,所有取样均重复3次,于液氮中保存备用。

1.2.2 实时荧光定量PCR(qPCR) 使用TaKaRa公司RNAiso Plus试剂提取大豆叶片mRNA并反转录成第一链cDNA(cDNA反转录试剂盒购自Innovagene公司)。以第一链cDNA为模板,通过qPCR检测GmNCED1-2的表达量。20.0 μl qPCR反应体系包括cDNA 2.0 μl、上下游引物各0.8 μl、2×TaqSYBR Green qPCR Premix(购自Innovagene公司)10.0 μl,ddH2O补至20.0 μl。根据NCBI数据库中GmNCED1-2的mRNA序列设计qPCR引物,上游引物5′-ACGTCGTCCAGAAGCCTTAC-3′,下游引物5′-ATCGTGCATCATGGTGGGTT-3′。内参基因为Gmβ-Tubulin,上游引物5′-GGAAGGCTTTCTTGCATTGGTA-3′,下游引物5′-AGTGGCATCCTGGTACTGC-3′[18]。在BIO-RAD CFX96 Real-Time PCR仪上设置参数如下:95 ℃预变性30 s;95 ℃ 5 s,58 ℃ 30 s,共循环40次。所有样品重复3次计算基因表达量。使用SPSS软件对数据进行差异显著性分析。

1.2.3 基因克隆及生物信息学分析 根据GmNCED1-2的开放阅读框(Open reading frame,ORF)序列设计PCR扩增引物,上游引物5′-GGAATTCCATATGATGGCATCATCAGCAGCAGC-3′,下划线代表NdeI酶切位点;下游引物5′-GGAATTCTCAAGCTTGTTTCCTCAAATCATT-3′,下划线代表EcoRⅠ酶切位点。以大豆cDNA为模板,PCR扩增GmNCED1-2完整ORF序列,PCR退火温度设为60 ℃。PCR扩增产物回收后与pMD18-T克隆载体(购自TaKaRa公司)连接,转化DH5α感受态细胞,提取质粒通过双酶切验证。菌液寄送生工生物工程有限公司进行测序。GmNCED1-2蛋白相对分子质量及等电点的预测使用在线网址https://web.expasy.org/compute_pi/。GmNCED1-2蛋白的保守结构域预测使用在线网址http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1。GmNCED1-2蛋白亚细胞定位预测分析使用在线网址https://www.genscript.com/wolf-psort.html?src=leftbar。使用MEGA软件构建NCED蛋白的系统进化树。GmNCED1-2启动子序列的获取使用在线数据库http://www.plantgdb.org/GmGDB/。启动子顺式作用元件的预测分析使用在线网址http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/。

1.2.4 植物表达载体构建及烟草遗传转化 使用DNA Ligation Kit(购自TaKaRa公司)将GmNCED1-2与植物表达载体pRI101(购自TaKaRa公司)连接,所用限制性内切酶为NdeⅠ和EcoRⅠ。重组载体质粒经双酶切验证后,热激转化根癌农杆菌EHA105感受态细胞。烟草的遗传转化采用农杆菌侵染烟草叶盘法[19]。在MS培养基中添加50 mg/L卡那霉素筛选T0代和T1代转基因烟草。使用基因组DNA提取试剂盒(购自TaKaRa公司)提取烟草叶片基因组DNA,通过PCR检测GmNCED1-2是否整合进入烟草基因组中。通过qPCR检测GmNCED1-2在T0代转基因烟草中的表达量,检测方法参照方法1.2.2,退火温度改为56 ℃,内参基因换为烟草Ntα-Tubulin基因,上游引物5′-ATGAGAGAGTGCATATCGAT-3′,下游引物5′-TTCACTGAAGAAGGTGTTGAA-3′[18]。通过SPSS软件分析数据差异显著性。

1.2.5 转基因烟草根长及生物量测定 对MS培养基上生长18 d的野生型(Wild type,WT)烟草和T1代转基因烟草的根长和生物量进行测量。通过SPSS软件分析数据差异显著性。

2 结果与分析

2.1 GmNCED1-2的克隆及序列分析

从NCBI数据库中获取一个大豆NCED基因GmNCED1,GenBank登录号XM014768319,其功能尚未被鉴定。通过PCR从大豆叶片cDNA中克隆获得基因的完整ORF序列,测序结果显示所获得的序列与GenBank中公布的序列相符。由于大豆中已经鉴定出1个GmNCED1基因[15-16],故将本研究中克隆的基因命名为GmNCED1-2。GmNCED1-2位于大豆基因组15号染色体上。GmNCED1-2的核苷酸序列及其编码的蛋白质氨基酸序列如图1所示,GmNCED1-2基因ORF全长1 818 bp,编码605个氨基酸,预测蛋白质相对分子质量6.693×104,理论等电点8.00。GmNCED1-2蛋白含有1个RPE65超家族结构域(氨基酸序列第134位至597位),还含有2个保守序列MIAHPKxDP和HDFAITE及4个保守的组氨酸残基,这些均属于NCED蛋白家族特征。GmNCED1-2蛋白的亚细胞定位预测结果显示其位于叶绿体中。

下划线表示保守的4个组氨酸残基;阴影部分表示保守序列MIAHPKxDP和HDFAITE;*表示终止密码子。图1 GmNCED1-2的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and amino acid sequences of GmNCED1-2

2.2 NCED蛋白系统进化分析

将功能已经得到鉴定的13个植物NCED蛋白与GmNCED1-2蛋白构建系统进化树。进化分析结果(图2)表明,GmNCED1-2蛋白与柑橘CrNCED1蛋白和野海棠MhNCED3蛋白的亲缘关系较近,与大豆中的另一个GmNCED1蛋白亲缘关系较远。

括号里列出的是蛋白质GenBank登录号。图2 植物NCED蛋白系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of plant NCED proteins

2.3 GmNCED1-2表达模式分析

通过qPCR对GmNCED1-2在根、茎、叶中的表达量进行检测。如图3所示,GmNCED1-2在叶中的表达量最高,是根中表达量的28.5倍;在茎中的表达量约是根中表达量的4.4倍。通过qPCR对GmNCED1-2在ABA、干旱、高盐、高温和低温处理24 h内叶片中的表达动态进行检测。如图3所示,胁迫处理后,GmNCED1-2的表达量均存在升高趋势。ABA处理后,GmNCED1-2的表达量在1 h和24 h出现2次峰值;干旱处理后GmNCED1-2的表达量升高最明显,在24 h的表达量是未处理对照(0 h)的455.8倍;高盐、高温和低温处理后,GmNCED1-2表达量峰值分别出现在10 h、5 h和24 h。

图柱上不同小写字母表示不同组织间或不同处理时间间差异显著(P<0.05)。图3 GmNCED1-2的表达分析Fig.3 Expression analysis of GmNCED1-2

2.4 GmNCED1-2启动子顺式作用元件预测分析

对GmNCED1-2基因起始密码子上游2 000 bp的启动子区域进行预测分析,发现其含有4种逆境及激素响应相关顺式作用元件(表1),包括2个脱落酸响应元件(ABRE),3个厌氧诱导元件(ARE),1个防御和胁迫响应元件(TC-rich repeats)和1个茉莉酸甲酯响应元件(TGACG-motif)。这些顺式作用元件的存在,与GmNCED1-2能够应答ABA和非生物胁迫的结果相符合。

表1 GmNCED1-2启动子顺式作用元件预测

2.5 GmNCED1-2转基因烟草遗传转化及鉴定

烟草叶片基因组DNA PCR检测结果(图4A)显示,共获得3棵GmNCED1-2转基因烟草植株,分别命名为OE1、OE2和OE3。GmNCED1-2在转基因烟草植株中的表达量为OE1>OE3>OE2(图4B)。

A:烟草基因组DNA PCR 检测;B:GmNCED1-2在转基因烟草植株中的表达量;M:Marker(基因大小标记);WT:野生型烟草植株;+:pRI101-GmNCED1-2阳性质粒;OE1～OE3:T0代转基因烟草植株。图柱上不同小写字母表示不同烟草植株间GmNCED1-2相对表达量差异显著(P<0.05)。图4 GmNCED1-2转基因烟草鉴定Fig.4 Identification of GmNCED1-2 transgenic tobacco

2.6 T1代GmNCED1-2转基因烟草根长和生物量分析

对生长18 d的野生型(WT)烟草和GmNCED1-2转基因烟草的根长和生物量进行测定。根长测定结果(图5)显示,WT烟草的根长显著长于转基因烟草。生物量测定结果(图5)显示,WT烟草的生物量显著高于转基因烟草。以上结果表明GmNCED1-2的过表达抑制了转基因烟草根的伸长及植株的生长。

WT:野生型烟草;OE1～OE3:T1代转基因烟草植株。图柱上不同小写字母表示不同烟草植株间差异显著(P<0.05)。图5 WT烟草和GmNCED1-2转基因烟草根长和生物量Fig.5 Root length and biomass of WT tobacco and GmNCED1-2 transgenic tobacco

3 讨 论

ABA在植物生长发育及应对逆境胁迫过程中的生物合成受NCED基因表达水平的调控,这一点已经得到了广泛的证实。因此,对NCED基因进行遗传操作可以提高植物体内ABA水平,调控植物生长发育并增强其胁迫耐受性[20-21]。尽管从大豆中已经鉴定出一个具有非生物胁迫抗性的GmNCED1[15-16],但由于NCED基因为多基因家族基因,且各基因之间存在一定的分工[5-9],因此有必要对大豆中其他NCED基因的功能进行探索。本研究克隆的GmNCED1-2所编码的蛋白质含有一个类胡萝素裂解酶均有的RPE65结构域,还含有4个保守的组氨酸残基,这些残基负责与铁辅因子相结合[22-24]。以往研究结果表明,NCED蛋白大多定位于叶绿体中[25-26],因为它们的作用底物位于质体中[23]。本试验也预测GmNCED1-2蛋白定位在叶绿体中。GmNCED1-2蛋白与CrNCED1蛋白和MhNCED3蛋白的亲缘关系较近,它们可能在功能上存在相似性。MhNCED3可以被干旱、低温、盐和镉胁迫诱导表达,其过表达提高了转基因植株对渗透和镉胁迫的耐受性[13]。CrNCED1可以被干旱、低温胁迫和ABA诱导表达[27],这些也为后续GmNCED1-2的功能鉴定提供了参考。

GmNCED1-2在叶中的表达量最高,在根中的表达量最低,这一结果与CrNCED1的组织定量结果一致,意味它们具有组织特异性表达的特点[27]。以往研究结果也表明,NCED基因可以在不同组织中表达并调节ABA的生物合成,包括根、茎和叶,但在根部的表达量往往最低[28]。因此后续选择大豆幼苗叶片作为试验材料,分析GmNCED1-2对非生物胁迫的应答情况。GmNCED1-2在不同的胁迫处理下表现出不同的表达模式,这表明存在不同的转录调控机制控制着GmNCED1-2的转录。GmNCED1-2对干旱胁迫的应答最为明显,其次是高盐胁迫,但在高温或低温胁迫下其表达量的变化不超过10倍。不同NCED基因对不同非生物胁迫的应答也不尽相同,例如VuNCED1的表达能够被干旱和高盐胁迫诱导,但对ABA和高温或低温胁迫无响应[29];TaNCED3能够被ABA诱导表达,但对高盐和低温胁迫无响应[30];而FvNCED3的表达则被ABA、干旱和高盐胁迫诱导,但在高温和低温胁迫下表达量却下降[31]。

ABRE是响应ABA的主要顺式作用元件,常位于胁迫诱导基因的启动子中[26]。GmNCED2-1启动子中含有2个ABRE,qPCR结果也证实ABA可以诱导GmNCED2-1的表达。而TGACG-motif则是响应茉莉酸的顺式作用元件,茉莉酸信号也参与植物的抗逆机制调控[32]。此外,GmNCED2-1启动子中还含有3个厌氧诱导元件和1个防御和胁迫响应元件,这些元件的存在表明GmNCED1-2可能受复杂调控机制的调控,是其能够响应多种逆境胁迫的重要原因。

研究结果表明,用ABA处理拟南芥幼苗,可以抑制主根伸长,浓度过高时会导致幼苗子叶无法张开,不能长出真叶[33]。NCED基因通过控制ABA的合成可以调控种子萌发和根系生长等植物生长发育过程。GmNCED1-2在烟草中的过表达抑制了转基因烟草根的伸长和植株的生长,这应该与GmNCED1-2过表达后导致烟草中ABA含量升高相关。在其他NCED过表达的转基因植物中也存在类似现象。例如,BnNCED3转化拟南芥后促进了拟南芥种子休眠,抑制侧根生长,并使转基因拟南芥提前开花[10]。CrNCED1转基因烟草的根生长速度慢于野生型,但在含ABA的培养基上,转基因烟草的根生长速度则快于野生型,表明ABA对转基因烟草根的生长抑制作用较小[27]。另有文献报道,干扰NtNCED3-2的表达会抑制烟草初生根的发育,出现发育迟缓和叶片腺毛数量减少的现象[34]。综上,大豆GmNCED1-2作为NCED基因家族成员能够响应非生物胁迫,其过表达抑制了转基因烟草根的伸长和植株的生长。