lncRNA MALAT1对人乳头状甲状腺癌细胞增殖、侵袭及迁移的影响

矫健 刘赫迪 赵玉 查江杰 杜鹃 盖欣欣 郭素芬

[摘要] 目的 探究人乳頭状甲状腺癌（papillary thyroid cancer，PTC）细胞TPC-1中长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）肺腺癌转移相关转录本1（metastasis associated in lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）的表达，及沉默MALAT1对TPC-1细胞增殖、侵袭及迁移的影响。方法 体外培养PTC细胞系TPC-1和人正常甲状腺滤泡上皮细胞系Nthy-ori3-1，采用定量反转录PCR（quantitative reverse transcriptase-mediated PCR，qRT-PCR）检测MALAT1在TPC-1和Nthy-ori3-1细胞系中的表达水平；构建干扰小RNA（small interfering RNA，siRNA），取对数生长期的TPC-1细胞，经脂质体瞬时转染技术干扰TPC-1细胞中MALAT1的表达，设置对照组（仅加入培养基）、MALAT1沉默对照组（si-NC组，加入空质粒载体）、MALAT1沉默组（si-MALAT1组，加入MALAT1-siRNA质粒），并采用qRT-PCR检测MALAT1的mRNA表达情况；CCK-8检测TPC-1细胞的增殖情况；Transwell小室实验检测TPC-1细胞侵袭能力；划痕试验检测TPC-1细胞迁移能力。结果 与Nthy-ori3-1细胞相比，TPC-1中MALAT1的表达上调（P<0.01）。与对照组、si-NC组比较，si-MALAT1组MALAT1表达水平明显降低（均P<0.01），TPC-1细胞增殖、侵袭及迁移能力均显著减弱（P<0.001，P<0.01，P<0.05）。结论 沉默MALAT1可抑制人PTC细胞TPC-1的增殖、侵袭及迁移能力。

[关键词] lncRNA MALAT1；乳头状甲状腺癌；增殖；侵袭；迁移

[中图分类号] R736      [文献标识码] A      [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2023.24.003

Effects of lncRNA MALAT1 on proliferation， invasion and migration of human papillary thyroid carcinoma cells

JIAO Jian1，2， LIU Hedi1，2， ZHAO Yu1，2， ZHA Jiangjie3， DU Juan1，2， GAI Xinxin1，2， GUO Sufen1，2

1.Pathology Teaching and Research Office， Mudanjiang Medical University， Mudanjiang 157011， Heilongjiang， China; 2.Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Cancer Disease Prevention and Control， Mudanjiang 157011， Heilongjiang， China; 3.Laboratory Department， Hongqi Hospital affiliated to Mudanjiang Medical University， Mudanjiang 157011， Heilongjiang， China

[Abstract] Objective To investigate the expression of long non-coding RNA （lncRNA） metastasis associated in lung adenocarcinoma transcript 1（MALAT1） in human papillary thyroid cancer （PTC） cells TPC-1， and the effect of silencing MALAT1 on TPC-1 cell proliferation， invasion， and migration. Methods In vitro cultivation of PTC cell line TPC-1 and human normal thyroid follicular epithelial cell line Nthy-ori3-1， quantitative reverse transcriptase-mediated PCR （qRT-PCR） was used to detect the expression level of MALAT1 in TPC-1 and Nthy-ori3-1 cell lines; Construct small interfering RNA （siRNA）， take logarithmic growth stage TPC-1 cells， and use liposome transient transfection technology to interfere with the expression of MALAT1 in TPC-1 cells. Set up a control group （only adding culture medium）， a MALAT1 silencing control group （si-NC group， adding empty plasmid carrier）， and a MALAT1 silencing group （si-MALAT1 group， adding MALAT1-siRNA plasmid）， and use qRT-PCR to detect the mRNA expression of MALAT1; CCK-8 was used to detect the proliferation of TPC-1 cells; Transwell cell assay was used to detect the invasiveness of TPC-1 cells; The ability of TPC-1 Cell migration was tested by scratch test. Results Compared with Nthy-ori3-1 cell， the MALAT1 expression in TPC-1 cell was increased （P<0.01）. Compared with control group and si-NC group， respectively， the expression of MALAT1 was reduced （both P<0.01）， the proliferation ability， invasion and migration ability of TPC-1 cell in the si-MALAT1 group were reduced （P<0.001， P<0.01， P<0.05）. Conclusion Silencing MALAT1 can inhibit the proliferation， invasion and migration of TPC-1 cell.

[Key words] Lnc RNA MALAT1; Papillary thyroid cancer; Cell proliferation; Cell invasion; Cell migration

甲状腺癌（thyroid cancer，TC）是内分泌系统最常见的癌症，其发病率和病死率在世界范围内持续增长。TC主要有4种亚型：乳头状甲狀腺癌（papillary thyroid cancer，PTC）、滤泡状甲状腺癌（follicular thyroid carcinoma，FTC）、甲状腺髓样癌（medullary thyroid carcinoma，MTC）和间变性甲状腺癌（anaplastic thyroid carcinoma，ATC）。其中，PTC是最常见的类型，约占TC的85%[1]。通过手术切除、甲状腺激素和辅助放射性碘治疗，大多数PTC患者预后较好。然而，PTC有很强的颈部淋巴结转移趋势，一些患者表现出肿瘤细胞分化差和转移，面临复发和死亡[2]。因此，迫切需要明确PTC潜在恶性转移行为的分子机制，为PTC转移提供干预靶点，并为开发有效的治疗策略提供理论依据。

长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）中的一种，长度大于200bp，约占ncRNA总数的80%。越来越多的研究提示lncRNA与人类癌症的进展有关，如PTC[3]。肺腺癌转移相关转录本1（metastasis associated in lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）是最早被发现的lncRNA之一，其基因位于人染色体11q13，序列长度约8.5kb，MALAT1在人类正常组织中广泛表达，在其他哺乳动物物种中保守表达，提示其在发育和进化中具有潜在的重要功能[4]。MALAT1作为一种重要的lncRNA，近年来得到广泛研究，特别是其在癌症发展、转移、治疗和预后评估等方面的作用[5-9]。已有研究表明，MALAT1通过转录或转录后调控相关基因的表达和细胞活力，如各种上游调控因子可与启动子结合，激活MALAT1的转录，导致MALAT1在不同类型癌症中的表达上调[10]。本研究以MALAT1为研究对象，探讨MALAT1在人乳头状甲状腺癌细胞系TPC-1中的表达情况，及其对TPC-1细胞增殖、侵袭及迁移的影响。

1  材料与方法

1.1  材料

人乳头状甲状腺癌细胞株TPC-1（武汉普诺赛生命科技有限公司）；人正常甲状腺滤泡上皮细胞株Nthy-ori3-1（北京中科质检生物技术有限公司）；RPMI 1640培养基、胎牛血清（美国Gibco公司）；RNA提取试剂盒（E.Z.N.A. TM HP total RNA kit）（美国Omega Bio-Tek公司）；反转录试剂盒（transcriptor first strand cDNA）（美国Thermofisher公司）；聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）预混液（fast SYBR green PCR master mix）（美国Roche公司）；MALAT1干扰小RNA（small interfering RNA，siRNA）干扰序列及转染试剂（广州市锐博生物科技有限公司）；MALAT1、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物（上海生工生物工程有限公司）；CCK-8试剂盒（上海尚宝生物科技有限公司）；Transwell小室、人工基膜（matrigel胶）（美国 Corning公司）。

1.2  细胞培养、转染及分组

将TPC-1细胞培养在含10%胎牛血清、1%双抗的RPMI 1640完全培养基中，在37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养，0.25%胰蛋白酶消化，1∶2～1∶3的比例传代。

取对数期的TPC-1细胞随机分为3组，即对照组、MALAT1沉默对照组（si-NC组），MALAT1沉默组（si-MALAT1组）。在转染前1d，将TPC-1细胞进行传代，且更换为无双抗完全培养基，进行细胞计数后均匀接种于6孔板中培养，待细胞汇合度约70%时，再行细胞转染。对照组细胞仅加入等量的无双抗完全培养基，其余两组按照转染说明书进行转染。将转染后的6孔板置于37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中，24h后收集细胞进行后续实验。

1.3  反转录和实时荧光定量PCR

应用RNA提取试剂盒提取TPC-1细胞系、Nthy-ori3-1细胞系及各实验组总RNA并测定其浓度及纯度，反转录制备cDNA（–20℃保存）。使用Fast SYBR green PCR master mix通过引物序列进行扩增。每组设置3个复孔，使用GAPDH作为内部对照。采用2–ΔΔCt法确定转染效率，并分析每个样品的基因相对表达差异。PCR扩增引物见表1。qPCR热循环条件：总反应体系20μl，95℃预变性10min，95℃变性15s，60℃退火1min，72℃延伸10min，进行40个循环。使用7500实时荧光定量PCR系统进行定量PCR检测。

1.4  CCK-8法检测细胞增殖

根据试剂说明书，将TPC-1细胞接种于96孔板（细胞密度为5×105/孔），24h后进行细胞转染并分组即对照组、si-NC组、si-MALAT1组，置于37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养，分别于24h、48h、72h后每孔加入10μl CCK-8溶液，在培养箱孵育2h后使用酶标仪（美国Bio-Rad公司）测定每孔450nm波长下的吸光度（optical density，OD）值，每组设置3个复孔，最終整理数据并进行统计分析。

1.5  Transwell实验检测细胞侵袭

用无血清的RPMI 1640重悬细胞并接种于涂有Matrigel基质凝胶的24孔板小室上室，下室添加含10%血清的RPMI 1640培养基，将装有Transwell小室的24孔板置于37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中，24h后24孔板小室下室用多聚甲醛固定20min，结晶紫染色15min，磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤3次后用棉签擦去滤膜表面的细胞，在光学显微镜下随机选择5个高倍视野（×100）观察，并计数迁移细胞平均数，每组设置3个复孔。

1.6  划痕试验检测细胞迁移

将对数生长期的TPC-1细胞悬液接种于6孔板（细胞密度为5×106/孔），将细胞分为3组即对照组、si-NC组、si-MALAT1组，待细胞长满后用100μl移液器枪头对每孔垂直划痕，PBS洗涤3次，将6孔板置于37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中，于0h、12h、24h分别在倒置光学显微镜下对各孔细胞拍照，随机观察5个高倍视野（×100），计算细胞运动面积，每组设置3个复孔。使用Image J软件进行数据分析。

1.7  统计学分析

实验所得数据用GraphPad Prism 8.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（）表示，两组间数据比较采用t检验，3组间数据分析采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  MALAT1在TPC-1细胞中的表达情况

定量反转录PCR（quantitative reverse transcriptase- mediated PCR，qRT-PCR）结果显示：与Nthy-ori3-1细胞相比，TPC-1细胞中MALAT1相对表达水平显著升高[（1.008±0.406）vs.（0.500±0.200）]，差异有统计学意义（t=6.56，P<0.01），见图1。

2.2  沉默MALAT1质粒转染效率检测

qRT-PCR结果显示：对照组、si-NC组、si-MALAT1组MALAT1表达含量分别为1.03±0.09、1.00±0.01、0.48±0.03，3组细胞的MALAT1表达含量比较，差异有统计学意义（F=122.50，P<0.01）。与对照组和si-NC组相比，si-MALAT1组MALAT1表达含量明显降低，差异具有统计学意义（均P<0.01），对照组与si-NC组比较差异无统计学意义（P>0.05）。提示MALAT1沉默效果显著，质粒转染成功，见图2。

2.3  沉默MALAT1对TPC-1细胞增殖的影响

通过CCK-8法检测沉默MALAT对TPC-1细胞增殖能力的影响，结果显示，与对照组和si-NC组相比，si-MALAT1组的细胞增殖能力在24h、48h、72h均明显降低，且差异均有统计学意义（均P<0.001），见表2、图3。

2.4  沉默MALAT1对TPC-1细胞侵袭的影响

通过Transwell实验检测TPC-1细胞的侵袭能力，实验结果显示，对照组、si-NC组和si-MALAT1组TPC-1细胞侵袭数量分别为（140.33±6.35）个、（140.00±2.65）个、（97.67±5.69）个。3组TPC-1细胞侵袭数量比较，差异有统计学意义（F=68.02，P<0.01）。与对照组、si-NC组比较，si-MALAT1组TPC-1细胞侵袭数量明显降低，差异均有统计学意义（均P<0.01），对照组与si-NC组比较差异无统计学意义（P>0.05），见图4。

2.5  沉默MALAT1对TPC-1细胞迁移的影响

利用细胞划痕试验检测TPC-1细胞的迁移能力，划痕12h后，对照组、si-NC组和si-MALAT1组的迁移率分别为（36.73±1.32）%、（37.17±3.46）%和（28.05±4.32）%，3组细胞迁移率比较，差异有统计学意义（F=7.65，P<0.05）。si-MALAT1组的细胞迁移能力低于对照组和si-NC组，差异均有统计学意义（均P<0.05），对照组与si-NC组比较差异无统计学意义（P>0.05）；同样划痕24h后，对照组、si-NC组和si-MALAT1组的迁移率分别为（62.16±0.79）%、（62.26±0.80）%、（51.40±6.68）%，3组细胞迁移率比较，差异有统计学意义（F=7.65，P<0.05）。si-MALAT1组的细胞迁移能力仍低于对照组和si-NC组，差异均有统计学意义（均P<0.05），对照组与si-NC组比较差异无统计学意义（P>0.05），见图5。

3  讨论

尽管PTC生存率较高，但随着病情进展，肿瘤难以完全切除、高风险和对放化疗不敏感使晚期PTC患者预后不良[13]。因此，研究TC的发病机制有助于提高TC的早期诊断和开发新疗法，改善患者的生活质量和预后，降低TC患者的病死率。

MALAT1最初被确定为非小细胞肺癌的预后标志物[14]。相关研究表明，MALAT1在其他癌症的发生发展中也起重要作用。在各种癌症中，MALAT1的表达通常是上调的。上调MALAT1可增加细胞增殖、抑制细胞凋亡，下调MALAT1可减少细胞增殖、促进细胞凋亡[15]。在食管鳞状细胞癌中，MALAT1的过表达促进肿瘤的增殖和转移，且MALAT1已被确定为食管癌进展和预后的生物标志物[16-17]。在胃癌中MALAT1的高水平表达促进癌症的发展和腹膜转移[18]。在胰腺癌的临床研究中，MALAT1的异常表达被确定为其临床进展和预后的不利预测因素[19]。MALAT1在骨肉瘤中显著上调，可通过激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3- kinase-protein kinase B，PI3K/PKB）信号通路促进骨肉瘤细胞转移[20]。高表达的MALAT1与宫颈癌患者不良预后显著相关[21]。下调MALAT1通过调节SOX9基因抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移[22]。因此，MALAT1对PTC细胞TPC-1的增殖、侵袭及迁移能力的影响是本研究的重点。

本研究中，笔者采用qRT-PCR技术检测MALATI在TPC-1細胞中的表达情况及在沉默MALAT1后TPC-1细胞增殖、侵袭及迁移能力的变化。结果提示：TPC-1细胞中MALAT1高表达；沉默MALAT1后，TPC-1细胞的增殖、侵袭及迁移能力均显著降低。由此可见，MALAT1在人PTC细胞中高表达并对癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力起促进作用。

本研究尚存在一定的局限性，首先，笔者仅在人PTC一个细胞系（TPC-1）进行MALAT1的表达分析，未选取其他细胞系进行检测；其次，未进行MALAT1对PTC细胞其他生物学行为的影响，如上皮间充质转化等；此外，本研究只进行体外研究，MALAT1对PTC细胞生物学功能影响的机制还需要通过体内研究进一步验证。

综上所述，通过沉默MALAT1可抑制TPC-1细胞的增殖、侵袭及迁移能力，本研究为PTC的治疗提供新的分子基础和理论依据，有望成为PTC治疗的潜在临床靶点。

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