HPLC法同时测定儿童化妆品中达克罗宁与新康唑的含量*

吴 旭，金 鹏，刘 洋，苏 晶

淮安市食品药品检验所，淮安 223300

随着社会的发展和生活水平的提高，儿童化妆品的普及率越来越高,其安全性亦备受消费者关注。在某次江苏省化妆品省级监督抽检中，某公司生产的儿童用护肤品中检出了新康唑和达克罗宁两种未列入化妆品原料的物质。

新康唑为酮康唑（Ⅱ）的衍生物，主体结构与酮康唑完全相同,是一种咪唑类新型广谱抗生素，可抑制真菌麦角甾醇生物合成，并改变细胞膜其它脂类化合物的组成[1]。酮康唑不能用于个人护理品中[2]，而新康唑主要用以去屑、杀菌和调节皮肤油脂[3]。达克罗宁多以盐酸盐形式存在，是一种新型处方类局部麻醉药[4]，作用于皮肤及粘膜表面，具有镇痛、止痒及杀菌作用[5]。新康唑和达克罗宁在我国主要用于医学领域，在化妆品中属于禁用成分，不应在化妆品特别是儿童化妆品中使用。

本研究建立了化妆品中新康唑和达克罗宁的检验方法，弥补了现行化妆品安全检测方法的不足，为行政监管打击个别企业非法添加违禁成分的行为提供了技术支撑。

1 仪器与药品、试剂

1.1 仪器与试剂

Waters2695/2998 高效液相色谱仪（美国沃特世公司）；岛津LC-2030 高效液相色谱仪（日本岛津公司）；METTLER XS205 电子天平（瑞士梅特勒-托利多科技有限公司），KH7200 型超声波清洗仪（昆山禾创超声仪器有限公司），Thermo MULTIFUGE X1R高速离心机（美国赛默飞世尔科技公司），XW-80A涡旋混合仪(上海驰唐电子有限公司)，SevenCompact S220pH 计（瑞士梅特勒-托利多科技有限公司）；Milli-QR 型超纯水机（美国密理博公司）。

甲醇、乙腈为色谱纯；甲酸、磷酸（85%，w/v），优级纯；磷酸二氢钠、氢氧化钠分析纯；水为GB/T 6682 规定的一级水。

1.2 材料

盐酸达克罗宁对照品（中国食品药品检定研究院，批号100423-201102，105℃干燥3 小时后使用，按C18H27NO2·HCl 计，含量为99.8%）；新康唑对照品（Cato Research Chemicals Inc，批 号1028-RC-0061，含量99.8%）。

儿童化妆品共17 批次，均来自江苏省化妆品监督抽检。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性实验

色谱柱：Diamonsil C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）或等效色谱柱；流动相A 为0.02 moL·L-1磷酸二氢钠水溶液（H3PO4调pH 值至3.0），流动相B为甲醇，梯度洗脱（A∶B）：0 min（40∶60）→9 min（40∶60）→13 min（30∶70）→30 min（30∶70）→30.1 min（40∶60）→34 min（40∶60）；流速1.0 mL·min-1；检测波长280、202 nm；柱温30℃；进样量10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合标准储备溶液 取达克罗宁对照品和新康唑对照品各适量，精密称定，加乙腈溶解并定量稀释制成每1 mL 中含达克罗宁1 mg 和新康唑1 mg的溶液。

2.2.2 供试品溶液 称取样品0.5 g（精确到0.1 mg）于25 mL 具塞比色管中，加入乙腈2 mL，涡旋分散均匀后，加入乙腈20 mL，涡旋30 s，冰浴超声提取30 min，加入乙腈定容至刻度，置冰箱冷藏3 h，以5000 r·min-1离心5 min，取上清液经0.22 μm 滤膜过滤，滤液作为供试品溶液。

2.2.3 空白基质溶液 称取空白样品0.5 g，按照“2.2.2”项下方法处理，得空白基质溶液。

2.2.4 空白基质加标溶液 称取空白样品0.5 g，加入混合标准储备溶液，按照“2.2.2”项下方法处理，得空白基质加标溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 提取效果 样品前处理的方法主要参考了《化妆品安全技术规范》2015 版中 “2.1 氟康唑等9种组分”的前处理方法，比较了乙腈和甲醇两种提取溶液的提取效率。达克罗宁和新康唑在乙腈中都有很好的溶解性，最终确定以乙腈作为提取剂，并加用超声波振荡。

称取11 号阳性样品0.5 g 于25 mL 具塞比色管中，加入乙腈2 mL，涡旋分散均匀后，定容至刻度，涡旋30 s，考察冰浴、室温、60℃三个条件下，超声0、10、20、30、40 min 条件下乙腈的提取效果。结果达克罗宁在冰浴30 min 时提取效果最好，新康唑在60℃30 min 时提取效果最好，考虑到达克罗宁易降解，且含量较新康唑少，所以选择冰浴30 min 为提取条件。

2.3.2 特异性 选择溶剂（乙腈）、空白基质溶液（“2.2.3”）、空白基质加标溶液（“2.2.4”）按照“2.1”色谱条件进行分析，记录色谱图（图1）。结果表明达克罗宁和新康唑与相邻峰之间分离度均＞1.5，溶剂和基质中存在的因子对被测目标因子均不存在干扰。

图1 达克罗宁（A）与新康唑（B）HPLC 图

2.3.3 耐用性 为保证实验方法的适用性，结合本实验室的实际情况，分别考察了流动相的比例（35∶65、40∶60、45∶55）、流动相pH 值（2.5、3.0、3.5）、检测波长（275、193 nm，280、202 nm，285、207 nm）、流速（0.9、1.0、1.1 mL·min-1）、柱温（25、30、35℃）、不同品牌色谱柱（Diamonsil C18、Waters Bridge C18、Capcell Pak C18）对实验的影响。结果实验条件在适当范围内变化时，新康唑和达克罗宁与相邻峰的分离度依旧＞1.5，且含量没有变化，说明耐用性良好。

2.3.4 标准工作曲线 称取空白样品0.5 g（精确到0.1 mg）6 份，分别加入“2.2.1”项下混合标准储备溶液适量，按“2.2.2”项下方法处理，得基质标准工作溶液系列，浓度分别为1、2、5、10、50、100 μg·mL-1。量取乙腈2 mL 6 份，同法操作，得标准工作溶液系列。按“2.1”项下色谱条件检测，以浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标进行线性相关性分析（表1）。结果表明空白基质加标曲线相关系数更好，故本方法选择空白基质加标制作标准工作曲线。

2.3.5 准确度 向空白基质中加入混合标准储备液，按 “2.2.2” 项下方法处理，制成方法定量限（LOQ）、两倍方法定量限（2 LOQ）和十倍方法定量限（10 LOQ）三种浓度的溶液，进行加标回收率实验，结果见表2，不同添加水平均符合回收率试验的要求。

表2 回收率考察测定结果记录表（n=6）

2.3.6 精密度 选择5 种典型的空白化妆品作为验证基质进行重复性试验，分别编号为空白样品A（爽肤水）、B（凝胶）、C（润肤霜®）、D（精华油）、E（润肤乳®），被测组分添加水平同准确度中回收率试验要求，结果均符合要求，见表3。将不同实验室的数据进行统计分析，再现性的RSD 指标同样符合要求。

表3 各空白样品中2 种待测物质的精密度（n=6）

2.3.7 检出限和定量限 以信噪比3∶1 为检出限，信噪比10∶1 为定量限，本方法对2 种物质的检出限情况及定量限见表4。

表4 定量限与检出限

2.3.8 样品含量测定 对市售的14 种样品共计20批次化妆品进行检验，检测结果见表5。结果有4 种化妆品违规添加达克罗宁和新康唑。

表5 样品信息及测定结果

3 讨论

3.1 检测波长的选择

扫描新康唑和达克罗宁在190～400 nm 处的紫外吸收情况，新康唑在202nm 有最大吸收，达克罗宁在280nm 有最大吸收。因新康唑在280 nm 没有紫外吸收，且达克罗宁在202 nm 吸收较小，所以选择双波长进行检测。经实际样品检测验证，可消除基质干扰，灵敏度满足方法检测需要。

3.2 色谱条件的选择

3.2.1 流动相的选择 参考相关文献，在色谱柱相同，柱温30℃，流速1.0 mL·min-1的条件下，本实验分别选择乙腈-水（50∶50）、甲醇-水（74∶26）、水（0.02 mol·L-1NaH2PO4，H3PO4调pH 值至3.0）-乙腈（40∶60）、水（0.02 mol·L-1NaH2PO4，H3PO4调pH值至3.0）-甲醇（40∶60），进行液相分离，实验结果表明，选择乙腈-水（50∶50）时,由于乙腈洗脱能力太强，达克罗宁在2.2 min 出峰，新康唑19.1 min 出峰，与杂质峰分离度不符合要求，且峰形较差。甲醇-水（74∶26）时，达克罗宁在7.3 min 出峰，新康唑31.1 min 出峰，其中达克罗宁响应低且峰形较差。以水（0.02 mol·L-1NaH2PO4，H3PO4调pH 值至3.0）为水相时，峰形较好。以乙腈为有机相时，峰形存在拖尾，且与相邻杂质峰分离度不符合要求，以甲醇为有机相时，峰形较好，不存在拖尾现象，所以本方法选用甲醇作为有机相，以水（0.02 mol·L-1NaH2PO4，H3PO4调pH 值至3.0）为水相。

3.2.2 流动相pH 的选择 考虑色谱柱的耐受性，结合实验的实际情况，在相同液相色谱条件下，分别选择pH 值为3.0、4.8、7.0 三个点作为考察对象，当pH=3.0 时的分离效果和峰形最好，故选用水相pH 值为3.0。

3.2.3 洗脱方式的选择 本实验考察了等度条件和梯度条件对实验结果的影响。等度条件下水（0.02 mol·L-1NaH2PO4，H3PO4调pH 值至3.0）∶甲醇为30∶70 时，达克罗宁在4.0 min 出峰，新康唑在13.4 min 出峰，出峰时间较快，但与杂质峰分离度不符合要求；水（0.02 mol·L-1NaH2PO4，H3PO4调pH 值至3.0）∶甲醇为40∶60 时，达克罗宁在6.9 min 出峰，新康唑在40.6 min 出峰，虽然与杂质峰分离度符合要求，但是出峰时间较长。在分离度符合要求的基础上，选择梯度条件来缩短分析时间。

3.3 稳定性考察

选择空白基质加标溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12 h 时进样，于0 h 比较峰面积变化＜2%，说明新康唑和达克罗宁在12 h 内稳定；分别在0、1、2、3 d时进样，于0 h 比较峰面积变化，发现新康唑3 d 时峰面积变化＜2%，而达克罗宁在1 d 时峰面积变化＞2%，说明达克罗宁易降解。将空白基质加标溶液进行冷藏（2～10℃），分别在10、20、30 d 时进样，于0 h比较峰面积变化均＜2%，说明新康唑和达克罗宁在冷藏条件下可保存30 d。含有达克罗宁的样品建议在12 h 内完成进样，或者选择样品盘可以控温的高效液相色谱仪进行检测。