基于功效关联的苍术质量标准研究

余国鑫，李子璐，陈 君

中国药科大学 中药学院生药学系，南京 210009

中药的质量是其发挥临床疗效的根本，客观评价和有效控制中药质量对于其临床应用具有重要意义[1]。中药的传统功效是药材中与功效相关的活性成分在体内发挥复杂生物作用的整体体现[2]。为建立符合中药作用特点的质量标准，应根据中药的传统功效对其关联成分进行辨识和质量控制，从而合理保证中药的临床疗效。

中药苍术为菊科苍术属植物茅苍术Atractylodes lancea（Thunb.）DC.或北苍术Atractylodes chinensis（DC.）Koidz.的干燥根茎[3]，为常用大宗药材，其主要成分为挥发油、萜类和糖苷类等[4]。苍术主要传统功效为“燥湿健脾”[5]，主要治疗脾虚所致的“湿阻中焦”[6]，平胃散就是以苍术为君药的燥湿和胃经典方。“湿阻中焦”在临床上主要表现为水液代谢障碍，湿即水也，“治湿不利小便，非其治也”[7]，因此，苍术“燥湿健脾”的功效与其利尿作用密切相关。

2020 年版《中国药典》苍术的含量测定项下仅规定苍术素的含量作为单一评价指标[3]，与临床疗效相关性不强，还存在道地药材茅苍术中苍术素含量较低难以达到药典要求，导致其使用受限问题[8]。基于此，本文针对苍术的利尿作用进行研究，筛选其利尿作用的有效部位，建立了与功效相关指标性成分的含量测定方法，以期为苍术的质量标准提升提供参考。

1 仪器与药品、试剂

1.1 仪器

LC-20A 高效液相色谱仪（日本岛津公司）；多功能酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）；万分之一电子天平、十万分之一电子天平（德国赛多利斯公司）等。

1.2 药品与试剂

β-桉叶醇对照品、苍术素对照品和苍术酮对照品均购自成都曼斯特生物科技有限公司，纯度均大于98%；购自不同产地的11 批茅苍术（M1～M11）及11 批北苍术（B1～B11），均经本文通讯作者鉴定。

氢氯噻嗪（山西云鹏医药集团有限公司）；Na+、K+、Cl-检测试剂盒（南京建成生物工程研究所有限公司）；0.9% NaCl 注射液（安徽双鹤药业有限公司）；羧甲基纤维素钠（CMC-Na，上海国药集团化学试剂有限公司。乙腈和甲醇均为色谱纯（美国天地有限公司）；水为超纯水。

1.3 实验动物

SPF 级雄性SD 大鼠（体重200～220 g）购自浙江维通利华实验动物技术有限公司，合格证编号：20211231Aazz0619000256，于中国药科大学动物实验中心进行实验，所有操作遵循《江苏省实验动物管理条例》 的相关规定以及伦理保护协会章程，伦理号：2021-12-024。

2 方法与结果

2.1 苍术的利尿作用研究

2.1.1 苍术各部位的制备 苍术挥发油部位的制备：苍术药材干燥、粉碎，过三号筛后混合均匀，称取100 g 药材粉末，以1∶12 的料液比，采用《中国药典》2020 版四部挥发油测定法（2204）甲法提取挥发油，收集并记录体积，于4℃储存备用。按照（挥发油体积/药材质量）×100%计算挥发油提取率为1.33%。

苍术剩余部位制备：过滤提取完挥发油的剩余苍术药液，收集滤液待用。药渣采用10 倍量的80%乙醇加热回流提取90 min，稍冷后过滤。合并两次滤液，减压浓缩、冷冻干燥后即得苍术剩余部位，称重，保存于阴凉干燥处，备用。按照（剩余部位质量/药材质量）×100%计算剩余部位提取率为42.43%。

苍术总提物制备：取同等生药量下的苍术挥发油和剩余部位混合，即得。

2.1.2 水钠潴留大鼠模型的建立、分组及给药剂量设置 雄性SD 大鼠适应性饲养一周后禁食不禁水18 h，轻压大鼠下腹排尽膀胱内尿液后，以25 mL·kg-1的剂量灌胃给予去离子水，随后立即置于代谢笼中，记录2 h 内的尿液体积，选取2 h 排尿量超过灌胃量40%的大鼠作为后续实验动物。将选出的大鼠随机分为5 组，包括模型组、氢氯噻嗪组、苍术总提物组、挥发油组和剩余部位组，每组8 只。按10 mL·kg-1的剂量灌胃给药，连续给药6 天。参考《中国药典》中苍术的成人每日最大用药剂量9 g[3]和前期预实验结果，选择临床最大使用剂量的4 倍给药，根据体表面积折算大鼠与人的等效剂量6.3∶1，按挥发油和剩余部位的提取率计算，苍术挥发油组和剩余部位组的给药剂量分别为43 μL·kg-1和1.4 μg·kg-1，苍术总提物组按上述剂量同时给予挥发油和剩余部位两部分样品。氢氯噻嗪组按10 mg·kg-1的剂量给药，模型组给予等量0.5% CMC-Na。第6 天实验前禁食不禁水18 h，以50 mL·kg-1的剂量对大鼠灌胃0.9% NaCl 溶液建立水钠潴留大鼠模型，间隔30 min 后灌胃给药。

2.1.3 尿液收集及试剂盒检测 末次给药后，轻压下腹排尽膀胱内尿液，随后置于代谢笼中，每隔1 h收集一次尿液并记录单小时尿量，共5 次，最后一次收集前轻压大鼠下腹排尽膀胱内尿液，计算给药后各组大鼠5 h 内的总尿量。采用离子检测试剂盒处理后用酶标仪测定尿液中Na+、K+和Cl-水平。

2.1.4 各组大鼠尿量比较 实验结果见表1 和图1。从单小时尿量来看，与模型组相比，苍术总提物组和挥发油组大鼠尿量在给药后第2 h 和第3 h 显著增加（P ＜0.001），而剩余部位组的各时段尿量均无显著差异（P ＞0.05）。从5 h 内总尿量结果来看，苍术总提物组和挥发油组的总尿量较模型组显著增加（P ＜0.001），且总提物组和挥发油组的总尿量增加程度相当，而剩余部位组较模型组无明显差别。以上结果表明，苍术总提物和挥发油具有利尿作用，且挥发油的利尿作用与总提物相当，表明挥发油为苍术发挥利尿作用的活性部位。

图1 各组大鼠0～5 h 各时间段尿量及5 h 内总尿量柱状图（n=6）

表1 各组大鼠0～5 h 各时间段尿量及5 h 内总尿量（n=6，mL，±s）

表1 各组大鼠0～5 h 各时间段尿量及5 h 内总尿量（n=6，mL，±s）

注：与模型组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001

2.1.5 尿液电解质离子浓度比较 各组大鼠尿液中的电解质离子浓度见表2。与模型组相比，苍术总提物组和挥发油组大鼠尿液中Na+和Cl-的含量显著增加（P ＜0.05），尿液中的K+浓度无明显变化，而剩余部位组大鼠尿液的Na+、K+和Cl-含量较模型组均无显著变化（P ＞0.05）。结合大鼠尿量比较结果，推测苍术挥发油部位增加大鼠尿量的作用可能与促进Na+和Cl-的排泄有关。

表2 各组大鼠尿液电解质离子浓度（n=6，mmol·L-1，±s）

表2 各组大鼠尿液电解质离子浓度（n=6，mmol·L-1，±s）

注：与模型组比较，*P ＜0.05，***P ＜0.001

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件 Kromasil 100-5-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；纯水为流动相A，乙腈-甲醇（5∶1）为流动相B，线性梯度洗脱（A∶B）：0 min（35∶65）→37 min（35∶65）→42 min（20∶80）→57 min（20∶80）→60 min（8∶92）；流速1.0 mL·min-1；柱温20℃；进样体积5 μL；检测波长215 nm。

2.2.2 溶液的配制 对照品溶液：分别称取β-桉叶醇、苍术素和苍术酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL 含β-桉叶醇4.88mg、苍术素0.32mg 和苍术酮1.91mg 的混合对照品溶液，于4℃下保存备用。

供试品溶液：称取药材粉末约1.0 g（过三号筛），精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入25 mL 甲醇，加密封塞后称重，超声30 min（250 W，30 kHz，35℃），取出，放冷，用甲醇补足失重，摇匀，以13 000 r·min-1离心10 min，取上清液，0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液。

空白溶液：以100%甲醇作为空白溶液。

2.2.3 样品含量测定 取样品粉末，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，记录各成分的峰面积并代入标准曲线方程中得到浓度后，根据公式（供试品溶液浓度×稀释倍数/称样量）×100%计算含量。

2.2.4 方法学考察

2.2.4.1 系统适应性与专属性考察 取“2.2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液及空白溶液各5 μL，按“2.2.1”项下色谱条件测定，结果见图2。供试品溶液中的β-桉叶醇、苍术素和苍术酮与各对照品峰均得到指认，分离度均大于1.5，各成分理论塔板数均大于10 000，表明该方法系统适应性和专属性良好。

图2 空白溶液（A）、对照品溶液（B）及供试品溶液（C）HPLC 色谱图

2.2.4.2 线性与范围 取“2.2.2”项下混合对照品储备液，分别稀释1、2、4、8、16、32、128 倍，得到系列不同浓度的对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，以对照品浓度（X）为横坐标，以峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，计算回归方程以及相关性系数（表3）。结果表明，β-桉叶醇、苍术素和苍术酮在各自线性范围内线性关系良好。

表3 三个成分的标准曲线、线性范围、定量限（LOQ）及检测限（LOD）

2.2.4.3 精密度试验 日内精密度：取“2.2.2”项下混合对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件在同一天内连续进样6 次，记录β-桉叶醇、苍术素和苍术酮的峰面积。结果β-桉叶醇、苍术素和苍术酮的峰面积RSD 分别为0.25%、0.27%和0.26%，表明仪器的日内精密度良好。

日间精密度：取“2.2.2”项下混合对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件每天进样3 次，连续进样3 天，记录β-桉叶醇、苍术素和苍术酮的峰面积。结果β-桉叶醇、苍术素和苍术酮峰面积的RSD 分别为0.37%、0.28%和0.21%，表明仪器的日间精密度良好。

2.2.4.4 稳定性试验 称取M7 样品约1.0 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于样品制备后0、2、4、8、16、24 h 进样测定，记录β-桉叶醇、苍术素和苍术酮的峰面积。结果β-桉叶醇、苍术素和苍术酮峰面积的RSD 分别为0.53%、0.31%和1.87%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.2.4.5 重复性试验 称取6 份M7 样品每份约1.0 g，精密称定，按“2.3”项下样品含量测定方法进样测定，计算含量及其RSD 值。结果显示，β-桉叶醇、苍术素和苍术酮含量的RSD 分别为1.83%、1.64%和2.14%，表明该方法重复性良好。

2.2.4.6 加样回收率考察 称取6 份已知含量的药材粉末（M7），每份约0.5 g，精密称定后加入一定量的混合对照品，按“2.3”项下方法进样分析并计算测得量，测得量和各待测物含有量之差与加入对照品量的比值即为加样回收率。结果显示，β-桉叶醇、苍术素和苍术酮的平均加样回收率分别为101.92%、99.43%和99.84%，RSD 在1.36%～2.86%之间，表明该分析方法的准确性良好。

2.2.5 统计学分析 采用GraphPad Prism 9 软件对动物实验数据进行One-Way ANOVA 分析，对含量测定数据进行t 检验，SPSS 23.0 软件进行层次聚类分析。

2.2.6 含量测定与统计学分析结果 11 批茅苍术和11 批北苍术的含量测定结果见表4 及图3。结果显示，茅苍术与北苍术中β-桉叶醇的含量具有显著性差异（P ＜0.001），表明β-桉叶醇为二者的主要差异性成分，可用于区分茅苍术与北苍术；茅苍术与北苍术中苍术素与苍术酮的含量无明显差别，但三种成分的总量有显著性差异（P ＜0.001），茅苍术三种成分的总量明显高于北苍术。采用SPSS 23.0 软件，以三种成分的含量为变量，采用Between-groups linkage 方法，选择Squared Euclidean distance 为距离测度，进行层次聚类分析（图4），结果显示22 批苍术样品呈明显的分类趋势，当欧氏距离为15 时，茅苍术和北苍术各自聚为一类，表明此含量测定方法可用于区分茅苍术与北苍术。

图3 茅苍术与北苍术中β-桉叶醇含量（A）及总量（B）比较

图4 层次聚类分析结果

表4 苍术中3 种成分的含量测定结果（n=3）

3 讨论

3.1 苍术利尿作用活性评价与含量测定指标选择

目前《中国药典》中苍术的含量测定指标单一，且与苍术的传统功效关联度不高，因此，本文从苍术的传统功效出发，对其功效相关活性部位进行研究并从中筛选含量测定指标性成分，以建立苍术功效相关的质量标准。

“燥湿”为苍术的重要功效，而“湿阻中焦”是其所对标的症候。中医理论认为“湿阻中焦”即湿邪阻于脾胃，是由于脾脏功能失调、水液运化障碍引起的，现代研究表明湿阻中焦会导致抗利尿激素上升、小便量减少、对NaCl 的重吸收增加，从而引起水钠潴留[7，9]，而尿液是人体排出多余水分的主要形式，因此利尿是苍术“燥湿”功效的主要表现。通过构建大鼠水钠潴留模型，对苍术中总提物、挥发油和剩余部位的利尿作用进行评价，结果显示苍术总提物和挥发油均可显著增加水钠潴留大鼠的尿量，且二者利尿作用相当，而剩余部位无此作用，推测挥发油为其发挥利尿作用的有效部位，其作用可能与抑制Na+和Cl-的重吸收有关。有研究表明β-桉叶醇、苍术酮和苍术素是苍术挥发油部位中含量较高的成分[10]，β-桉叶醇、苍术酮和苍术素均报导有利尿作用，其中β-桉叶醇和苍术酮为Na+-K+-ATP酶抑制剂，可抑制肾脏中水和Na+的重吸收产生较强的利尿作用[11，12]。因此，本研究选择了苍术挥发油中的β-桉叶醇、苍术素和苍术酮三种成分作为“燥湿”功效相关的活性成分建立含量测定方法。

3.2 含量测定方法的优化

3.2.1 提取条件的优化 以β-桉叶醇、苍术素和苍术酮的含量为考察指标，考察了不同提取溶剂（50%、75%、100%甲醇，50%、75%、100%乙醇）、不同提取方法（超声提取、加热回流）、不同提取时间（15、30、60 min）和不同料液比（1∶25、1∶50、1∶100）对样品的处理效果，结果确定了以1∶25 的料液比，100%甲醇超声处理30 min 为最佳提取条件。

3.2.2 色谱条件的优化 以β-桉叶醇、苍术素和苍术酮的分离度和峰形为考察指标，考察了不同有机相[甲醇、乙腈、乙腈∶甲醇（5∶1）]、柱温（20、25、30℃）、进样量（5、10、15 μL）、流速（0.8、1.0、1.2 mL·min-1）和检测波长（205、210、215、220 nm），结果显示，在流动相纯水-乙腈∶甲醇（5∶1）、柱温20℃、流速1.0 mL·min-1、进样量5 μL、波长215 nm 检测条件下，各成分的分离度和峰形较好，基线更为平稳。

3.3 含量测定结果讨论

传统认为茅苍术为苍术的道地药材。11 批茅苍术和11 批北苍术中苍术素的含量测定结果显示，北苍术中苍术素的含量普遍高于茅苍术，如以《中国药典》规定的苍术素含量指标（≥0.30%）评价，北苍术的合格率为81.82%，而茅苍术的仅为18.18%，这也与文献报道因茅苍术中苍术素含量较低而难以达到药典要求的问题一致[13]，显示出现行质量标准在执行中存在与市售药材实际不相适应的矛盾。统计学分析结果表明，茅苍术与北苍术中β-桉叶醇的含量和三种成分总量具有显著性差异，通过聚类分析可将二者完全区分开来，且茅苍术三种成分的总量明显高于北苍术。以这三种成分的总量为苍术含量测定的指标更能全面反映苍术质量，测定结果也与茅苍术为道地药材的传统观点一致。

目前茅苍术的资源较北苍术少[14]，价格更高。茅苍术在性状上与北苍术的重要区别之一为茅苍术断面能析出白色细针状结晶[3]，俗称“起霜”，课题组前期对茅苍术白霜的化学成分进行了分析，发现其主要成分为β-桉叶醇。传统经验认为茅苍术的质量要优于北苍术，课题组前期研究也发现茅苍术的挥发油含量显著高于北苍术，有报道称二者的挥发油组成亦有不同[15]，且药效学实验表明茅苍术对大鼠湿阻中焦模型的干预作用要强于北苍术[16]，表明二者的药效可能存在一定的区别，有必要在质量控制中对茅苍术和北苍术进行区分，本文研究结果表明以β-桉叶醇、苍术素和苍术酮三种成分总量为指标的含量测定结果可反映出苍术的两个不同基原在传统鉴别上的区别，对苍术的基原鉴定和临床应用有一定的实际应用价值。