直接稀释-KED碰撞模式-电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法测定人体全血、尿液中38种元素

孙 琦 丁 亮 张卓娜 朱 英 张 淼

(中国疾病预防控制中心 环境与健康相关产品安全所,中国疾病预防控制中心环境与人群健康重点实验室,北京 100021)

人体所代谢的多种元素通常和环境、饮食以及职业暴露息息相关。其中部分元素具有毒性风险,在低剂量暴露情况下将会导致慢性疾病的发生,高剂量的暴露情况下则会引起中毒或死亡[1-2]。如砷、镉、铅等元素作为世界卫生组织公认的有毒金属,高浓度暴露下会导致急性中毒从而带来死亡风险,同时已有许多研究指出在低浓度暴露水平以上元素均会引起同程度的氧化应激效应,诱发高血压、糖尿病等慢性疾病的发生[3-6]。然而有些元素则是有利于人体健康不可缺少的微量元素,如硒、锌等元素与儿童智力发展以及老年健康息息相关[7],同时由于科技的发展以及电子产品的高市场需求,暴露在稀土元素的人群也逐渐增多,参与电子产品加工的群体也在逐渐扩大,对于稀土元素在人体的暴露情况以及毒性也值得我们关注[8]。因此探究人体暴露水平以及特征对于监测人群健康至关重要。由外暴露而进入到人体的部分元素主要通过全血循环参与人体代谢,易蓄积在全血中,部分元素通过尿液代谢排出体外。因此通过测定全血、尿液样本中多元素的浓度水平可以从一定程度上反映元素的暴露特征,对于探究环境污染、食品安全、人群健康等问题至关重要。

全血和尿液作为人体中反映暴露情况的首选测定对象被广泛应用于多种暴露物的测定中。电感耦合等离子体质谱法在20世纪80年代因为其超高的灵敏度、较宽泛测定范围、以及对同位素的捕捉[9],逐渐成为无机元素分析的主要方法,但其对上机测定的样本要求较为严格,上机测定的样本需消解充分同时要满足样本的最大溶解浓度,高酸高盐类样本会带来进样管路的污染以及采样锥、截取锥的损害,降低仪器使用寿命。许多学者对于全血尿液样本的测定建立了多种前处理方法,如火婷等[10]使用微波消解-电感耦合等离子体质谱法对血液中30种元素进行测定,刘柳等[11]采用直接稀释的方式使用动态反应池模式下的ICP-MS法对尿样中21种无机元素进行测定。欧阳珮珮等[12]采用湿式消解或压力罐消解处理后使用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法对血液、尿液及头发中16种稀土元素同时测定。样本的直接稀释法具有操作简单、经济效益高、安全风险低、样本无损耗等优点,作为大样本量测定首选前处理手段[13]。但由于全血本属于高碳样本、尿液属于高盐样本,两种样本如果想实现简单的直接稀释需避免因基质复杂带来的干扰,目前越来越多的研究者更倾向于使用直接稀释法对全血尿液样本中多元素进行测定,然而基质效应、稀释剂以及线性范围的确定等问题为建立方法的难点,同时国内也少有研究者将测定元素扩展至稀土元素。

本研究意在建立一种简单便捷的前处理方式,消除全血、尿样复杂基质干扰问题的同时提升测定效率,因涉及到的元素较多,质量数分布较广,容易引入多种干扰,影响测定结果[14],本方法采用动态反应池模式,避免了同位素、质谱等多种干扰,建立人体样本中钪、钒、铬、锰、铯、钴、镍、锌、铜、砷、硒、锶、钇、钼、银、镉、锡、锑、钡、镧、铈、镨、钕、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥、汞、铊、铅、钍、铀等38种元素的测定方法,对方法进行方法学评估,拓展方法的实用性可适用于普通人群或职业暴露人群,同时将方法应用于实际样本的测定,探究方法实际操作的可行性,探讨人群中38种元素的暴露水平和特征。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

iCAP RQ电感耦合等离子体质谱仪(美国赛默飞科技有限公司),TOLEDO ME-T分析天平(瑞士METTLER有限公司),MX-T6-Pro滚轴混匀仪(大龙兴创实验仪器北京股份公司),Milli-Q IX7003纯水机(德国默克有限公司),HY-5A数显回旋式振荡器(国旺仪器制造有限公司),IKA磁力搅拌器(德国IKA仪器公司)。

钒、铬、锰、钴、镍、铜、砷、硒、锶、钼、银、镉、锡、锑、钡、铊、铅等多元素混合标准溶液(100 μg/mL,美国Accustandard公司),锌标准溶液(1 000 μg/mL,美国Accustandard公司),铯标准溶液(100 μg/mL,美国Accustandard公司),汞标准溶液(10 μg/mL,美国Accustandard公司),钪、钇、镧、铈、镨、钕、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥、钍、铀等18种稀土及放射元素混合标准(100 μg/mL,美国Accustandard公司),锗、铷、铋内标溶液(100 μg/mL,美国Accustandard公司),45%硝酸(MOS级,日本多摩公司),L-半胱氨酸(优级纯,德国sigma公司),Seronorm Trace Elements whole blood、urine L1、L2全血/尿液证参考物质(挪威SERO公司)。

1.2 仪器工作参数

iCAP RQ电感耦合等离子体质谱仪经过调谐后的工作参数见表1。

表1 ICP-MS仪器工作参数

1.3 标准溶液及内标溶液的配制

1)多元素混合标准系列:用1%的硝酸溶液将多元素混合、锌、铯的标准溶液稀释为中间储备液,其中锌浓度为2 000 μg/L,其他19种元素浓度为100 μg/L。使用上述中间储备液配制混合标准系列,其中锌元素浓度为0、2.0、10、20、60、100、200、400、1 000、2 000 μg/L,其余19种元素浓度为0、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100 μg/L。

2)汞元素标准曲线:用含有1%L-半胱氨酸和1%硝酸的溶液作为汞元素的稀释液。将10 μg/mL汞元素标准溶液稀释为10 μg/L的中间储备液,采用逐级稀释法配制汞元素浓度为0、0.100、0.500、1.00、2.00 μg/L的标准系列。

3)18种稀土及放射元素标准系列:用1%的硝酸溶液将18种稀土元素标准稀释为中间储备液,浓度为10 μg/L。使用上述中间储备液配制混合标准系列,18种元素浓度为0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0 μg/L。

4)内标溶液:移取浓度为100 μg/mL的内标溶液适量,用1%硝酸溶液逐级稀释为浓度为6 μg/L的内标使用溶液。

1.4 样本前处理

全血:全血样本在室温下解冻,将完全解冻的全血样本在涡旋振荡器上进行混匀,放置于椭圆滚轴仪上混匀消除全血泡沫30 min后取0.5 mL全血样本于15 mL离心管中,使用0.1%硝酸溶液+0.01%曲拉通溶液定容至10 mL,放入离心机在3 600 r/min的转速下离心后上机定测上清液。

尿样:尿液样本在室温下解冻,将完全解冻的尿液样本在涡旋振荡器上混匀,避开尿液泡沫取1 mL尿液品于15 mL离心管中,使用1%硝酸溶液定容至10 mL,放入离心机在4 000 r/min的转速下离心后上机定测。

2 结果与讨论

2.1 干扰的来源及消除

ICP-MS测定中的干扰主要包括质谱干扰、基体干扰和同位素干扰等[15]。质谱干扰是测定大量元素的一个主要的限制性因素,由于全血、尿液样本基体较为复杂,其中蕴含了大量干扰元素如Ca、Mg、Na、K、P,此类元素在样本中浓度均为μg/mL级别,质荷比(m/z)大多在40～50,极其容易对本研究所涉及到相近质荷比且浓度在μg/L级别的元素如V、Ni、Co等产生干扰。这些元素常会与氩气一起在离子化过程中形成复杂的干扰物如36Ar23Na+、40Ar31P+等,从而影响待测元素的准确性。同时因为不同元素在自然环境中的丰度差异也会造成相应的同位素干扰,从而影响测定结果。因此本研究采用添加了氦气为辅助气的动能歧视模式(KED)作为减少此类干扰的有效方法,如51V、59Co、60Ni、78Se、111Cd等元素在KED模式下可以有效地消除大部分质谱以及同位素干扰。本研究对有证全血、尿液样品SERO L1进行中浓度加标回收实验,使用标准模式(STD)和KED模式分别进行测定,计算不同模式下38种待测元素的加标回收率,结果见图1、2。由图1、2可知,在STD模式下全血和尿液样本中大部分元素如51V、59Co、60Ni、78Se、121Sb均因易受质谱、同位素等多重因素的干扰,回收率较高,结果不理想。在KED模式下以上元素均有大幅度改善,回收率在80.0%～120%可接受范围内,因此本研究采用KED-ICP-MS模式对样本进行测定。

图1 KED和STD模式下全血中38种元素的加标回收率

图2 KED和STD模式下尿液中38种元素的加标回收率

2.2 回归方程、线性范围和检出限

参考诸多对于职业以及非职业暴露人群中元素监测研究结果[16],确定所涉及到的全血、尿液样本中所测定元素的标准曲线线性范围,以连续测定样本空白11次,以3倍和10倍标准差对应的浓度值计算方法检出限和定量限。38种元素的标准曲线范围、方法检出限和方法定量限以及内标元素的选择见表2。

表2 全血、尿液中38种元素的回归方程、线性范围和检出限

2.3 方法准确度实验

使用涡旋振荡器将收集到的全血、尿液样本震荡混合,滤除全血样本中的血块以及过滤尿液样本中的杂质。将过滤后的全血样本放置于震荡器缓慢摇混匀1 h,尿液样本中放置于磁力搅拌器上混匀4 h后迅速将两种样本分装。各测定3批,每批平行测定4次,分别加入高浓度(Zn元素1 000 μg/L,Hg元素1.25 μg/L,18种稀土及放射元素1 μg/L,其他元素15 μg/L)、中浓度(Zn元素500 μg/L,Hg元素0.75 μg/L,18种稀土及放射元素0.25 μg/L,其他元素5 μg/L)、低浓度(Zn元素25.0 μg/L,Hg元素0.125 μg/L,18种稀土及放射元素0.075 μg/L,其他元素0.5 μg/L)的标准溶液,作为加标实验的加标浓度值,全血、尿液中所有元素的加标回收率均在80.3%～125%,详见表3、4。

表3 全血中38种元素加标回收率

表4 尿液中38种元素加标回收率

2.4 方法精密度实验

表5 ICP-MS测定全血、尿液中21种元素精密度结果

2.5 质量控制

本研究所使用的试剂耗材均通过空白筛查确保实验过程无其他污染元素引入,为了验证该方法适用于不同暴露特征的人群,同时为保证内部质量,本研究使用了Seronorm公司生产的全血、尿液中多元素有证质控L1和L2级。因L1级更接近普通人群,L2浓度接近职业暴露人群体内浓度,本研究的实际样本均来自非职业暴露人群,故在测定中以L1级别作为质控样本,为了扩展方法适用性同时也对L2级别样品进行测定,探讨方法是否适用于职业暴露人群。在测定之前根据制造商的建议对质控材料进行复溶,并与实际样本相同的前处理方式进行稀释和消解。除Sc元素因质控物质没有给定范围或参考值外,全血、尿液的L1、L2的所有元素测定结果均在参考值或证书给定测定值范围内,具体结果见表6。

表6 不同浓度级别的全血、尿液有证标准物质样本中38种元素的测定结果

2.6 实际样本的测定

采用本研究方法对189份实际人群样本进行测定,其中全血中常规的元素检出率较高,其中Cr、Mn、Cs、Co、Ni、Zn、Cu、As、Se、Sr、Mo、Cd、Sb、Ba、Hg、Pb检出率均高于80%,而稀土元素以及Th、U、Ag、TI等较低,其中大部分未检出,小部分检出率低于15%,尿液在检出率情况和全血基本一致。根据对实际样本的测定发现了有部分元素在全血中浓度较高,如Mn、Zn、Cu、Se、Cd、Sb、Ba、Pb,有部分元素在尿液中浓度较高如Ni、As、Sr、Mo、TI,因为所选择的样本来自国家人体生物监测项目,所采集到的人群为普通非职业暴露人群,因此人群样本的稀土元素检出率较低,结果详见表7。

表7 全血、尿液样本中37种元素的暴露水平

3 结论

综上所述,本研究建立了以直接稀释为前处理方式的KED-ICP-MS法测定人体全血、尿液中38种元素的方法,其中涵盖了人体中多种有毒元素、必需微量元素以及稀土元素及放射性元素。样本的前处理方法相较于常规的微波消解法、石墨消解法、水浴消解法更安全、简洁,避免了部分元素的挥发,同时提高了工作效率和经济效益,适合大样本量人群样本的测定。方法灵敏度高,方法学指标良好,干扰较少,适用于所有暴露特征人群的元素测定。使用本研究的方法对189份实际样本进行测定,探究了189份样本的暴露水平,暴露特征以及评估了尿液以及血液样本中较高检出率的元素,本方法适用于于临床检验、法医检验、环境监测、营养调查等领域,所评估的人群暴露特征对于人体多元素监测具有参考意义。