西藏藏香中34种元素含量测定及产地判别分析

王 君 唐庆强 李二鹏 杨 方 曹晓钢* 王晓龙

(1.拉萨海关技术中心,拉萨 850002;2.福州海关技术中心,福州 350001)

藏香是一类以柏木泥为主料,以榆树皮等为黏合剂,添加一种或多种纯天然药材及香料制成的燃香,在西藏地区有长达1 300多年的使用历史,素有“有炊烟的地方就能闻到藏香的芬芳”的说法,是西藏地区百姓不可或缺的生活用品[1]。藏香独特的制作工艺,纯天然的原材料,使藏香由“寺庙专贡格局”发展为如今“跨出区外走向世界”的趋势,在中国香港、中国台湾、东南亚、美国、欧洲等地都可以闻到来自雪域高原的氤氲芬芳[2]。据藏香协会统计,近年来藏香产业发展迅速,年均销售额达20多亿元,正成为西藏经济发展新的增长点。随着藏香市场需求的扩大,常有不法商家用其他地区生产的燃香“贴牌”假冒藏香销售。为了保护地方特色产业发展,维护藏香品牌价值,急需开发西藏藏香产地判别的方法。

藏香起源于藏医药,原料来源复杂,种类众多,以西藏地区的特色植物为主,受西藏特殊地理环境的影响,其元素含量与西藏以外地区(区外)燃香存在差异,元素含量分析结合化学计量学已成为不同产品进行产地判别最有效的手段之一[3-5],这为藏香的产地判别提供了研究基础。目前,对燃香中多元素的检测方法研究较少,且都集中在少数重金属元素上。燃香中元素检测方法包括电感耦合等离子体发射光谱法、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法[6-9],未涉及稀土元素的检测,且均未考察基质效应。稀土元素作为地球化学示踪剂,在产地判别上具有很大的应用价值[10-12],对包括稀土在内的多种元素的测定可为产地判别提供有潜力的特征指标。

微波消解耗酸量少,用时短,不易引入外界污染,对复杂基质样品更易消解完全。电感耦合等离子体质谱法灵敏度高、检出限低,可同时检测多种元素,在多样本量多元素的测定中具有较大的优势。本研究建立西藏藏香中34种元素含量测定的微波消解-电感耦合等离子体质谱法,对西藏藏香和区外燃香样品进行检测,并结合方差分析、正交偏最小二乘判别(OPLS-DA)分析、线性判别(LDA)分析和主成分(PCA)分析,确定不同区域样品中元素的含量特征及差异性,筛选出特征指标,建立西藏藏香的产地判别模型。为基于元素含量的藏香产地判别提供检测方法,为西藏藏香产地判别提供基础数据和技术支撑。

1 实验部分

1.1 样品采集与制备

采集西藏藏香36份(拉萨地区22份、山南地区14份),西藏地区以外(区外)燃香样品31份(福建7份、广东10份、江苏11份、印度香3份),将样品粉碎,过60目(0.25 mm)筛子,混匀,待用。

1.2 仪器与试剂

微波消解仪(安东帕 Multiwave 3000),电感耦合等离子体质谱仪(安捷伦 7700e),电子天平(赛多利斯 LE225D,感量为0.000 1 g),超纯水仪(密理博 Milli-Q,电阻率18.2 MΩ·cm)。

硝酸(优级纯,CNW),过氧化氢(优级级,国药集团),16种稀土元素钪(Sc)、钇(Y)、镧(La)、铈(Ce)、镨(Pr)、钕(Nd)、钐(Sm)、铕(Eu)、钆(Gd)、铽(Tb)、镝(Dy)、钬(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镱(Yb)、镥(Lu)混合标准储备溶液(100 μg/mL,钢研纳克),钒(V)、钴(Co)、砷(As)、镍(Ni)、铜(Cu)、铅(Pb)、硒(Se)、镉(Cd)、钼(Mo)、铟(In)、锡(Sn)、锑(Sb)、铊(Tl)、铬(Cr)、锰(Mn)、锌(Zn)、铷(Rb)、钡(Ba)单元素标准储备溶液(100 μg/mL,钢研纳克);锗(Ge)、铑(Rh)、铋(Bi)内标标准储备溶液(100 μg/mL,钢研纳克);锂(Li)、镁(Mg)、钴(Co)、铈(Ce)、铊(Tl)、钇(Y)调谐溶液(1 μg/L,安捷伦科技有限公司)。

1.3 标准溶液的制备

标准工作溶液:通过对藏香元素测定的预实验,将34种元素分为两组,元素含量较低的29种元素Sc、Y、La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、V、Co、As、Ni、Cu、Pb、Se、Cd、Mo、In、Sn、Sb、Tl为A组,标准工作溶液浓度为0、2、5、10、20、50、100 μg/L;元素含量较高5种元素Cr、Mn、Zn、Rb、Ba为B组,标准工作溶液浓度范围为0、20、50、100、200、500、1 000 μg/L。

内标标准工作溶液:准确量取Ge、Rh、Bi内标标准储备溶液(100 μg/mL)各1.0 mL于100 mL容量瓶中,加入2.0 mL硝酸,用超纯水定容至刻度,得到1.0 mg/L内标标准工作溶液,供34种元素测定时在线使用。

1.4 样品前处理

取0.3 g(精确到0.000 1 g)藏香样品于微波消解罐内,加入4 mL硝酸和2 mL H2O2,冷消解过夜后用微波消解仪进行消解。消解程序:1)10 min,功率升至500 W,保持10 min;2)15 min,功率升至800 W,保持20 min;3)20 min,功率升至1 200 W,保持30 min;4)30 min,功率降至0 W。消解完成冷却至室温后,取出消解内罐超声5 min,用超纯水润洗转移至50 mL容量瓶中,定容至刻度,混匀,所得样品消解溶液用ICP-MS测定。同时做样品空白实验。

1.5 仪器工作条件

采用浓度为1.0 μg/L的调谐溶液,优化ICP-MS 7700e仪器工作参数,优化后的条件见表1。

表1 ICP-MS仪器工作条件

1.6 数据处理

利用SPSS 26.0软件进行方差分析和线性判别分析(LDA),利用Sicma 14.0软件进行正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA),利用MetaboAnalyst 5.0进行主成分分析(PCA)与热图聚类分析。由于藏香样品各元素含量数量级差异较大,在分析之前对实验数据进行标准化预处理。

2 结果与讨论

2.1 样品取样量

藏香的原材料为各类木料、香辛料及中药材,配方复杂,不易消解。样品取样量过少,会对一些含量较低的元素检测造成较大的实验结果偏差;样品取样量过多,容易造成消解不彻底,还会增加含量较高元素污染仪器设备的风险。本方法采取微波消解体系,根据消解方式和仪器设备的特点,比较了0.1、0.3和0.5 g取样量时的情况,结果见图1。结果表明,对不同取样量的同一藏香样品平行测定6次,取样量为0.3 g时各元素的精密度(RSD)最小,为1.7%～4.5%,且消解后样品澄清。取样量为0.1 g时RSD值为2.0%～10.2%,取样量为0.5 g时RSD值为1.8%～7.4%,且消解后的样液呈浅棕色,并有沉淀物,因此,实验选择消解效果最好的0.3 g作为方法的取样量。

图1 不同取样量下藏香各元素含量RSD值(n=6)

2.2 微波消解酸体系

微波消解通常采用HNO3或HNO3与其他酸混合来消解样品。因为氯化物、硫酸盐的引入,会带入35Cl16O+、37Cl14N+、34S16O1H+、35Cl16O1H+、32S16O2+、32S2+、37Cl37Cl+、40Ar35Cl+、38Ar37Cl+等分子离子,进而对51V、52Cr、64Zn,74Se、75As等元素产生严重干扰,因此首先排除了HCl和H2SO4作为消解溶液[13]。在湿法消解中常用的HClO4因强氧化性对有机物有很好的消解作用,但HClO4膨胀系数大,加热后在密闭环境中容易爆炸,不宜在微波消解中采用[14]。HF对样品中的Si有很好的消解作用,但消解过程中生成了难溶性氟化稀土物,会导致部分稀土元素结果偏低[15]。中药材、香辛料等基质多采用HNO3、HNO3+H2O2进行微波消解[16-18],重点考察这两种消解方式。分别考察6 mL HNO3、4 mL HNO3+2 mL H2O2时的消解效果。结果表明,采用6 mL HNO3消解时会有较多的沉淀,而使用4 mL HNO3+2 mL H2O2的消解液澄清,这说明HNO3和H2O2配合使用具有更强的氧化性,适合藏香等复杂基质的样品。

2.3 质谱条件的优化

质谱干扰主要有同量异位素干扰、丰度较大的同位素对相邻元素的干扰、多原子离子干扰、物理干扰和基体抑制等[13,19-20]。通过选择丰度和灵敏度高、干扰相对少的同位素及调整分辨率来提高分析的准确度,通过适当稀释(定容至50 mL)及采用涵盖高、中、低质量数元素的内标(Ge、Rh、Bi)优化仪器参数,减少物理干扰和基质效应。氦气碰撞反应池技术(KED)可以有效消除氩气系统及高基体背景下形成的干扰,提高准确度。此外,55Mn易受本底分子离子40Ar14N1H+、40Ar15N+、36Ar18O1H+、38Ar16O1H+、37Cl17O1H+的干扰,63Cu则受36Ar12C14N1H+、14N12C37Cl+、16O12C35Cl+、46Ca16O1H+等的严重干扰,75As会被40Ar35Cl+、36Ar38Ar1H+、38Ar37Cl+、43Ca16O16O+、23Na12C40Ar+、40Ca35Cl+等干扰,从而导致这些元素的结果偏高。为了进一步减少干扰,考察不同碰撞气流量对检测结果的影响,测试3.0、4.0、5.0 mL/min时的碰撞气效果,结果见图2。

图2 不同碰撞气流量对Mn(a)、Cu(b)、As(c)回收率的影响

结果表明,碰撞气流量为5.0 mL/min时,虽然55Mn、63Cu、75As回收率都较为合理,但34种元素中一些低含量元素的回收率较低,一些低质量端元素的标准曲线相关系数较差。碰撞气流量为4.0 mL/min时,虽然55Mn的高浓度回收率121%略微偏高,但其余各元素的回收率和标准曲线相关系数都较好,因此实验选择4.0 mL/min的碰撞气流量。

2.4 基质效应的影响

藏香配方多样,原料复杂,由此带来的基质效应很有可能影响结果的准确性。参考GONZALEZ 等[21]的方法,以2%硝酸配制的溶剂标准曲线斜率为SlopeS,用藏香消解液为溶剂配制的相同标准曲线斜率为SlopeM,按基质效应:ME=(S-M)/S×100%的公式计算藏香样品的基质效应,结果见图3。

图3 藏香样品中基质效应情况

2.5 方法学评价

2.5.1 线性关系、检出限和定量下限

将配制好的标准工作溶液按仪器工作条件测定,采用内标法定量,以各元素质量浓度为横坐标(x),各元素与内标测量值的比值为纵坐标(y),绘制标准溶液工作曲线。按照实验方法对11个空白溶液进行测定,计算测定值的标准偏差(s),将3倍的标准偏差(3s)作为方法检出限,10倍的标准偏差(10s)作为定量下限。34种元素的线性回归方程、线性范围、相关系数及方法检出限,定量下限见表2。

表2 34种元素的线性、相关系数、检出限和定量限

从图3中可以看出,藏香34种元素ME值在-10%～16.6%。根据基质效应的判断方法,当|ME|<20%时为弱基质效应,20%<|ME|<50%时为中等强度基质效应,|ME|>50%时为强基质效应,由此可以得出,本方法处理藏香的基质效应多处在弱基质效应范围里,表明方法的前处理效果良好,不需要进一步进行基质补偿,可以满足检测方法的要求。

2.5.2 方法的精密度和加标回收实验

取同一藏香样品,在低、中、高3个添加水平进行加标回收实验,对本底值较低的A组元素分别添加2、10、20 μg/L三个水平,对本底值较高的B组元素则添加20、100和200 μg/L三个浓度水平,分别平行测定6次,计算测定值的精密度(RSD)和加标回收率,结果见表3。

表3 元素回收率和精密度实验数据(n=6)

由表3可知,采用本实验仪器工作条件和实验方法,加标回收率在88.7%～121%,RSD值在1.5%～5.6%,满足检测方法的要求。

2.6 产地判别分析

2.6.1 元素含量特征分析

应用本方法分析67份样品,测定结果及显著性差异见表4。从表4可知,西藏藏香样品中V、Cr、As、Se、In、Sc、Y、Ce、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu等19种元素含量与区外燃香样品差异显著(p<0.05),由此可见,西藏藏香和区外燃香的元素含量有较明显的地域差异。测定的16种稀土元素中,其中有14种在西藏藏香中平均含量较区外燃香高,这提示在西藏特有的地理环境条件下,植物可能更容易富集稀土元素。

表4 样品分析结果

2.6.2 正交偏最小二乘判别(OPLS-DA)分析

以34种元素含量作为因变量,不同产地作为自变量,进行OPLS-DA分析,自变量拟合指数(R2x)为0.809,因变量拟合指数(R2y)为0.716,模型预测指数(Q2)为0.576,R2和Q2超过0.5表示模型拟合结果可接受[22],西藏藏香主要处于第三、四象限,区外燃香主要处于第二象限,地域差别显著(图4a),有5份区外燃香处于置信区间以外,这可能是因为区外燃香样品产地较多,且燃香配方多变造成的。进行200次置换检验(Permutation test),如图4b所示,置换检验的R2=0.138,Q2=-0.333,表明该模型没有过拟合现象(R2<0.5,Q2<0),模型验证有效,该模型可用于西藏藏香的产地判别分析。34种元素VIP值见表4,VIP值越大,对判别的影响越显著。VIP>1表明其对样品判别结果权重影响率>50%,对判别结果影响具有统计学意义[23]。以VIP>1、p<0.05为标准,筛选得到Sc、V、Cr、As、Y、In、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu共17种具有显著差异的元素。

图4 不同地区燃香OPLS-DA分析样品得分图(a)和模型置换检验结果(b)

2.6.3 线性判别(LDA)分析

采用LDA法进一步考察17种元素含量对藏香产地的判别情况,以这17种元素含量作为判别分析的自变量,建立产地判别模型。通过逐步判别分析,对藏香产地判别存在显著差异的Sc、Cr、In、Gd、Tb、Tm元素被引入到判别模型中,构建的典型判别函数为:F=0.931Sc-0.840Cr+0.4In-9.066Gd+11.358Tb-2.164Tm。利用回代检验和留一交叉验证两种方法对LDA判别模型进行验证,结果见表5,西藏藏香和区外燃香2个区域样品回代检验判别正确率为97.0%,留一法交叉检验的判别正确率为95.5%,说明6种特征元素构建的判别模型可以有效地判别藏香产地。Fisher线性判别函数如下:

表5 不同产地藏香样品判别分析分类结果

Y(西藏)=1.460Sc-1.317Cr+0.627In-14.213Gd+17.808Tb-3.393Tm-1.850

Y(区外)=-1.696Sc+1.530Cr-0.728In+16.506Gd-20.680Tb+3.940Tm-2.428

2.6.4 主成分(PCA)分析及热图聚类

为了进一步验证6种特征元素对西藏藏香产地判别的准确性,以6种特征元素含量进行PCA分析,见图5,前3个主成分PC1、PC2、PC3方差贡献率分别为68.5%、18.1%、11.2%,累计方差贡献率达97.8%,因此选取前3个主成分分析样本具有较强的可靠性。2个不同区域的样品虽出现个别重叠的情况,但具有较为明显的分类趋势,且不同产地样品的分布相对集中。6种特征元素含量热图分析,见图6,可以看出2个不同区域的样品有显著差异,具有较好的分类效果。西藏藏香样品中Sc、Gd、Tb、Tm、In 5种元素含量较突出,区外燃香中Cr含量较突出。因此,6种特征元素的PCA分析对西藏藏香的产地判别具有较高的准确性和可行性。

图5 基于PCA分析不同地区燃香3D图

图6 不同产地燃香的特征元素聚类热图

3 结论

建立了微波消解-电感耦合等离子体质谱法测定藏香中34种元素含量的方法,样品用微波消解,利用在线内标和氦气碰撞反应池技术减少基质效应和离子干扰,内标法定量。应用本方法测定区内、区外样品67份,发现西藏藏香中19种元素含量与区外燃香存在地域差异。通过OPLS-DA、LDA分析,建立了有效的产地判别模型,经逐步筛选,将因变量34种元素降维到6种元素。以6种元素进行PCA分析及热图聚类分析也可以准确有效地对西藏藏香进行产地判别。本研究能为藏香中多元素的测定提供快速准确的检测方法,为利用元素特征对藏香的产地判别提供方法支持。