大承气汤对肠源性脓毒症小鼠的保护作用及机制Δ

钟 旋 ，李袁袁 ，林荣锋 #，姚韵婕 ，刘伟琼 ，罗毅平 ，凌家俊 （.广东省妇幼保健院成人重症监护室，广州 544；.广州中医药大学中药学院，广州 50006；3.东莞广州中医药大学研究院，广东 东莞 53808）

脓毒症是全身性炎症反应综合征，可发展为严重的脓毒血症和脓毒症休克[1]。其可引起机体过度的炎症反应，造成多器官损伤，进而引发多器官功能障碍，使患者病死率升高[2]。脓毒症的临床治疗非常棘手，主要采用非特异性治疗（如液体复苏、肺保护性通气、控制感染、改善血流动力学等）和对症治疗（如防治器官功能衰竭和休克等）[3]。由于目前尚无特异性治疗方法，其病死率仍然高达36.6%[4]。中医可采用通腑降下法治疗脓毒症，大承气汤是该治法的代表方剂之一。大承气汤源于张仲景《伤寒论》，由大黄、枳实、厚朴和芒硝组成，是《中国脓毒症早期预防和阻断急诊专家共识》治疗腑气不通型脓毒症的推荐用药[4]。已有文献报道，大承气汤可缩短脓毒症患者的机械通气及住ICU时间，改善急性生理和慢性健康状况Ⅱ（acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ，APACHEⅡ）评分和脓毒症相关序贯器官衰竭（sequential organ failure assessment，SOFA）评分，提高治愈率[5]，且对脓毒症胃肠损伤[6]、脓毒症肺损伤[5]、急性胰腺炎并发肝损伤[7]等疾病均具有较好的治疗效果，但其作用机制尚不清楚，且相关的基础研究较少。采用中药配方颗粒制备的大承气汤在保持传统汤剂成分特点的基础上，不仅成分稳定可控，还具有较明确的药动学数据[8]。基于此，本研究拟采用中药配方颗粒制备大承气汤，并开展其改善脓毒症的药效学研究。

Toll 样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）是最早被人们发现且研究最为广泛的TLR家族成员，其在脓毒症的发病机制中扮演着重要的角色[9]。脓毒症发生时，TLR4可通过识别并结合病原微生物细胞壁上的脂多糖激活其下游髓分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依赖性通路，进而促进白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等炎症因子的释放[10]。因此，TLR4/MyD88信号通路在脓毒症的发病机制中发挥了重要作用。本研究以经典的盲肠穿刺法复制肠源性脓毒症模型小鼠，考察大承气汤对肠源性脓毒症小鼠的保护作用，并从TLR4/MyD88信号通路探讨其可能机制，以期为大承气汤治疗脓毒症的机制研究提供实验参考。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器有ST16 型离心机（美国Thermo Fisher Scientific 公司）、DG5033A 型多功能酶标仪（南京东华电子科技有限公司）、JB-P5 型石蜡组织包埋机（武汉俊杰电子有限公司）、RM2016 型病理切片仪（上海徕卡仪器有限公司）、7500型荧光定量聚合酶链式反应（PCR）仪（美国Applied Biosystems 公司）、SMA4000型微量核酸定量仪（美国Merinton公司）。

1.2 主要药品与试剂

大黄、枳实、厚朴、芒硝的配方颗粒购自四川新绿色药业科技发展有限公司，参考大承气汤处方（大黄12 g、枳实12 g、厚朴24 g、芒硝9 g），按文献[8]方法加入煮沸的蒸馏水适量，配制成质量浓度分别为1、0.5 g/mL的大承气汤药液（以生药量计），备用。注射用乌司他丁（批号032104073，规格100 000 U）购自广东天普生化医药股份有限公司；戊巴比妥钠（批号1905020301）购自美国Sigma公司；TNF-α 酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（批号RX202412M）、IL-6 ELISA试剂盒（批号RX203049M）均购自泉州睿信生物科技有限公司；TRIzol Reagent 试剂盒（批号DP424）购自天根生化科技（北京）有限公司；逆转录试剂盒（批号K1622）购自美国Thermo Fisher Scientific 公司；荧光实时定量PCR 检测试剂盒（批号AOPR-1200）购自广州复能基因有限公司。

1.3 实验动物

本研究所用动物为C57BL/6J雄性小鼠，共60只，体重为23～25 g，由广州中医药大学动物实验中心提供，动物生产许可证号为SCXK（粤）2019-0202。动物饲养于广州中医药大学中药学院SPF级动物房（温度为24～26 ℃，湿度为45%～55%，自然昼夜节律光照），自由获取食物和水。本实验经过广东省妇幼保健院医学伦理委员会批准，批准号为广东省妇幼保健院医伦第[202001070]号。

2 方法

2.1 实验分组、造模与给药

将60 只C57BL/6J 小鼠按体重随机分为6 组，分别为假手术（Sham）组、假手术+大承气汤高剂量（Sham+DCQD-H）组、模型（CLP）组、大承气汤低剂量（DCQDL）组、大承气汤高剂量（DCQD-H）组、阳性对照（Positive）组，每组10只。CLP组、DCQD-L组、DCQD-H组和Positive组小鼠均以盲肠结扎穿刺法建立肠源性脓毒症模型[11]。DCQD-L组和DCQD-H组在术前3 d和术后7 d每天灌胃给予大承气汤（剂量分别为4、8 g/kg[12]，按生药量计）；Positive 组在术前2 h 腹腔注射乌司他丁1 次，术后7 d 每日腹腔注射乌司他丁1 次，剂量均为50 000 U/kg[13]。Sham 组仅暴露盲肠，不做结扎及穿刺；Sham+DCQD-H组仅暴露盲肠，不做结扎及穿刺，并在术前3 d和术后7 d每天灌胃给予大承气汤8 g/kg（按生药量计）；Sham 组和CLP 组每天均灌胃和腹腔注射生理盐水各0.2 mL，连续10 d。

2.2 小鼠脓毒症评分与7 d生存率评估

采用小鼠脓毒症评分评价各组小鼠脓毒症严重程度[14]。根据小鼠外观、行为表现、意识水平、对刺激的反应、睁眼反应、呼吸频率和呼吸质量等情况进行综合评分，分值越高，表明脓毒症越严重。术后7 d每天对各组小鼠进行脓毒症评分，并观察其存活情况，绘制7 d生存曲线用以评估其7 d生存率。

2.3 标本采集

当小鼠的脓毒症评分超过21 分或小鼠的呼吸频率和呼吸质量得分超过3分时，视为死亡，此时及时进行取材[15]：摘眼球取血，收集血清备用。将小鼠处死，剖取肝、肺、肾、回肠组织，分批剪取适量组织装入冻存管并迅速浸入液氮中，然后放入80 ℃冰箱中保存，备用；另取一部分组织浸入4%多聚甲醛溶液中固定，备用。其余小鼠于末次给药1 h后采用相同方法取材。

2.4 小鼠血清和回肠组织中TNF-α、IL-6水平的测定

取“2.3”项下小鼠血清和回肠组织样品适量（每组选取6只小鼠的样本），采用ELISA法测定其中TNF-α、IL-6水平，具体步骤严格按试剂盒说明书操作。

2.5 小鼠肝、肺、肾、回肠组织的病理学形态观察

采用苏木精-伊红（HE）染色法进行观察。取“2.3”项下固定于4%多聚甲醛溶液中的小鼠肝、肺、肾、回肠组织（每组选取3 只小鼠的样本），经常规石蜡包埋、切片、HE染色后，置于光学显微镜下观察各组织的病理学形态并评分[16]。

2.6 小鼠回肠组织中TLR4、MyD88 mRNA 表达水平的检测

取“2.3”项下小鼠回肠组织样品适量（每组选取6只小鼠的样品），使用TRIzol 试剂按照说明书要求提取小鼠回肠组织总RNA，使用逆转录试剂盒合成cDNA，再按照荧光实时定量PCR检测试剂盒制备反应体系，反应条件为：95℃ 10 min；95℃ 10 s，55℃ 20 s，72℃ 35 s；循环40个周期。绘制熔解曲线，采用2－ΔΔCt法，以actb为内参，计算TLR4、MyD88 mRNA 的表达水平。引物序列由广州四和生物科技股份有限公司合成，具体见表1。

表1 引物序列及扩增产物长度

2.7 统计学方法

采用SPSS 26.0 软件、GraphPad Prism 9 医学绘图软件进行分析，数据以±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。

3 结果

3.1 小鼠脓毒症评分和7 d生存率测定结果

脓毒症评分结果见图1A。Sham 组和Sham+DCQD-H组小鼠的行为正常，精神佳，反应灵敏，呼吸正常，毛发光滑且发亮，眼睛完全睁开。与Sham 组比较，CLP 组小鼠脓毒症评分显著升高（P＜0.01），毛发竖立，行动缓慢，精神萎靡，对外界刺激（如声音、触摸）反应迟钝或行动伴随着震颤，眼睛半闭或紧闭，偶有白色分泌物，呼吸频率和质量较差。与CLP组比较，DCQD-L组、DCQD-H 组和Positive 组小鼠脓毒症评分均显著降低（P＜0.01），且上述症状均有所改善或缓解。

图1 各组小鼠的脓毒症评分和7 d 生存率测定结果（±s，n＝10）

小鼠7 d 生存率测定结果见图1B。Sham 组和Sham+DCQD-H组均无小鼠死亡。与Sham组比较，CLP组小鼠7 d生存率显著降低（P＜0.01），仅为40%；与CLP组比较，DCQD-L 组、DCQD-H 组、Positive 组小鼠7 d 生存率均有不同程度的升高，分别为70%、80%、70%，其中DCQD-H组小鼠7 d生存率显著升高（P＜0.05）。

3.2 小鼠血清和回肠组织中TNF-α、IL-6 水平的检测结果

与Sham 组比较，CLP 组小鼠血清和回肠组织中TNF-α、IL-6 水平均显著升高（P＜0.01）。与CLP 组比较，DCQD-L 组、DCQD-H 组和Positive 组小鼠血清和回肠组织中TNF-α、IL-6水平（DCQD-L组回肠组织中IL-6除外）均显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。结果见图2。

图2 各组小鼠血清和回肠组织中TNF-α、IL-6 水平的检测结果（±s，n＝6）

3.3 小鼠肝、肺、肾、回肠组织的病理学变化结果

肝组织HE染色结果显示，Sham组和Sham+DCQDH组小鼠肝细胞围绕中央静脉呈放射状排列，未见明显的形态结构改变；CLP组小鼠肝细胞排列疏松且杂乱不齐，细胞多肿胀，伴有出血，可见大面积的炎症浸润和细胞凋亡；DCQD-L 组、DCQD-H 组和Positive 组小鼠肝细胞损伤明显改善，炎症浸润和凋亡减少，中央静脉微扩张、排列相对整齐，结果见图3A。

图3 各组小鼠肝、肺、肾、回肠组织的病理学形态观察结果

肺组织HE染色结果显示，Sham组和Sham+DCQDH组小鼠肺泡壁间隙薄，肺泡大、形态正常，无明显的损伤；CLP 组小鼠肺泡壁增厚，肺泡缩小且多见水肿、出血，可见明显的炎症浸润；DCQD-L 组、DCQD-H 组和Positive 组小鼠肺组织损伤有所缓解，肺泡萎缩、出血、水肿均有不同程度的改善，结果见图3B。肾组织HE染色结果显示，Sham 组和Sham+DCQD-H 组小鼠肾组织形态正常，未见明显的损伤及炎症浸润，可见完好的肾小球和肾小管；CLP 组小鼠可见肾小管管腔扩张，肾小管上皮细胞呈空泡样变性，肾间质多见水肿、出血，有明显的炎症损伤；DCQD-L 组、DCQD-H 组和Positive 组小鼠肾组织损伤得到改善，肾小管管腔扩张减弱、空泡样变性减少，结果见图3C。回肠组织HE 染色结果显示，Sham 组和Sham+DCQD-H 组小鼠回肠组织形态正常，完整的肠绒毛数量多，未见明显损伤；CLP 组小鼠回肠组织可见较多尖锐或破损的肠绒毛，表现出明显的炎症损伤；DCQD-L 组、DCQD-H 组和Positive 组小鼠回肠组织损伤及水肿均有明显改善，结果见图3D。另外，与Sham 组比较，Sham+DCQD-H 组小鼠肝、肺、肾、回肠组织损伤评分差异无统计学意义（P＞0.05），CLP 组小鼠肝、肺、肾、回肠组织损伤评分均显著升高（P＜0.01）；与CLP 组比较，DCQD-L 组、DCQD-H 组和Positive 组小鼠肝、肺、肾、回肠组织损伤评分均显著降低（P＜0.01），结果见图4。

图4 各组小鼠组织损伤评分结果（±s，n＝3）

3.4 小鼠回肠组织中TLR4、MyD88 mRNA 表达水平的检测结果

与Sham 组比较，CLP 组小鼠回肠组织中TLR4、MyD88 mRNA表达水平均显著升高（P＜0.01）。与CLP组比较，DCQD-L 组、DCQD-H 组和Positive 组小鼠回肠组织中TLR4、MyD88 mRNA表达水平均显著降低（P＜0.01）。结果见图5。

图5 各组小鼠回肠组织中TLR4、MyD88 mRNA 表达水平的检测结果（±s，n＝6）

4 讨论

TNF-α、IL-6均为重要的炎症因子，常被视为衡量脓毒症严重程度的指标[10]。本研究结果显示，大承气汤可抑制脓毒症引发的血清炎症因子TNF-α、IL-6 的升高，改善脓毒症所致的肝、肺、肾、回肠组织的炎症浸润，提示其对全身性炎症反应具有显著的抑制作用。本研究结果与相关文献对大承气汤治疗急性或重症胰腺炎、炎性肠梗阻、肺炎的报道相符[7，17]。

脓毒症常引起包括肝、肺、肾、回肠组织在内的多器官衰竭，其治疗关键在于降低多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）的发生率[18]，因此本研究考察了大承气汤对肝、肺、肾、回肠组织损伤的影响，结果显示，其对肝、肺、肾、回肠组织均具有保护作用，尤其是对肠道的保护作用较好。胃肠道不仅是促进脓毒症病情进展的关键器官，更是脓毒症最常受累的靶器官[11]，肠功能损伤的防治是截断脓毒症迅速进展为MODS的核心[19]。大承气汤已被证实对肠梗阻、胃肠动力不足、肠缺血再灌注损伤等多种肠道疾病具有治疗作用[20]，且其成分可能对肠存在靶向性[21]。本研究亦证实，大承气汤可改善肠源性脓毒症所致的肠道炎症损伤、浸润、水肿、出血，较好地保护小肠绒毛的完整。

TLR4信号通路在先天的免疫反应和急性或慢性炎症性疾病中发挥着重要的作用[22]。当脓毒症发生时，往往会激活TLR4/MyD88 信号通路，引起动物模型中TLR4、MyD88 mRNA水平的显著升高，进而促进炎症因子大量释放[23]。本研究结果显示，大承气汤可显著下调脓毒症模型小鼠回肠组织中TLR4、MyD88 mRNA 表达水平，提示其作用机制可能与抑制TLR4/MyD88信号通路有关。

综上所述，大承气汤对肠源性脓毒症模型小鼠具有保护作用，其作用机制可能与抑制全身炎症、减轻多器官损伤以及下调TLR4/MyD88信号通路有关。