灯盏花乙素调节cGAS/STING 信号通路对创伤性脑损伤大鼠神经炎症的影响Δ

宋 宇 ，宋明明 ，魏志玄 ，王海均 （.南阳医学高等专科学校第一附属医院神经外科，河南 南阳 47000；.南阳医学高等专科学校第三附属医院神经外科，河南 南阳 47007；.华中科技大学协和医院神经外科，武汉 400）

创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）作为一种由外部机械力引起的获得性脑损伤，可导致神经损伤、行为改变和认知功能下降，严重影响患者生活质量，且由于其高发病率和长期后遗症，给患者家庭和社会带来了沉重的医疗和经济负担[1]。尽管TBI引发的暂时性或永久性损伤的治疗策略已取得了一定进展，但目前TBI 的有效治疗仍面临巨大挑战[2]，仍需探索其发生发展的分子机制，从而开发更有效的治疗方案。研究显示，TBI后会发生急性、强烈的炎症级联反应，其特征是小胶质细胞激活、外周免疫细胞迁移和募集、炎症介质释放等，且这些炎症介质会诱导继发性细胞死亡并阻碍神经功能恢复，故控制TBI后炎症反应被认为是一种很有前途的治疗方法[3—4]。

环鸟苷酸-腺苷酸合成酶（cyclic guanylate-adenylate synthase，cGAS）/干扰素基因刺激蛋白（stimulator of interferon genes，STING）信号通路是先天免疫系统中重要的模式识别及效应通路之一，能够识别存在于细胞质的异常DNA 分子，进而诱导Ⅰ型干扰素（interferon typeⅠ，IFN-Ⅰ）和其他炎症因子表达[5]。据报道，cGAS/STING信号通路作为IFN-Ⅰ反应的关键诱导因素，与多种神经退行性疾病中的神经炎症密切相关，且该通路激活后还会参与TBI后神经细胞死亡和功能障碍[6—7]。

灯盏花乙素（scutellarin，Scu）是一种从黄芩、灯盏花和半枝莲中提取的黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化和神经保护等多种药理作用[8—9]。已有研究表明，Scu通过抑制丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路抑制氧化应激和炎症反应，从而减轻脑缺血/再灌注大鼠的脑损伤[10]。但Scu对TBI后神经炎症的影响及其机制尚不清楚。据此，本研究构建了TBI 大鼠模型，着重观察了Scu 对TBI 大鼠神经炎症的影响以及cGAS/STING信号通路在此过程中的变化，以期为TBI治疗方法及相关机制的阐明提供新思路。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器有：SA-100型大鼠脑立体定位仪（上海玉研科学仪器有限公司）、DM IL LED型荧光显微镜（德国Leica公司）、SpectraMax iD3型多功能酶标仪[美谷分子仪器（上海）有限公司]。

1.2 主要药品与试剂

本研究所用的主要药品与试剂有：Scu 对照品、cGAS抑制剂RU.521（美国MedChemExpress公司，批号分别为HY-N0751、HY-114180，纯度均不低于98.56%）；苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号20196537）；原位末端标记（TdT-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL）细胞凋亡检测试剂盒（上海弗元生物科技有限公司，批号19273185）；β 干扰素（interferon-β，IFN-β）、CXC 趋化因子配体10（CXC chemokine ligand-10，CXCL10）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）酶联免疫吸附检测（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（上海酶研生物科技有限公司，批号分别为21071196、22551682、22670618、21348216）；cGAS兔多克隆抗体（美国Invitrogen 公司，批号PA5-121188）；STING、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）兔单克隆抗体及辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（英国Abcam公司，批号分别为ab227704、ab181602、ab205718）。

1.3 动物

本研究所用动物为SPF级健康雄性SD大鼠，共124只，7～8周龄，体重240～280 g，购自湖北省实验动物研究中心，动物生产许可证号为SCXK（鄂）2020-0018。所有大鼠均在温度23～24 ℃、光照12 h/黑暗12 h、相对湿度50%～60%的环境中适应性饲养1 周后开展后续实验，饲养期间自由进食和饮水。本研究动物实验符合《实验动物护理和使用指南》中相关要求，并通过了南阳医学高等专科学校第一附属医院医学伦理委员会批准（伦理审查批号2022-6-7-2）。

2 方法

2.1 TBI动物模型构建、分组与给药

造模前大鼠禁食不禁水12 h。随机抽取24 只大鼠作为假手术组，其余100 只均采用改良Feeney 法构建TBI模型[11]：腹腔注射2%戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉大鼠，将其呈俯卧位固定于脑立体定位仪上，以75%乙醇消毒头皮后沿脑正中线左侧切开，暴露左顶骨，于冠状缝后3 mm、矢状缝左3 mm处开一直径约5 mm的骨窗，并注意保持硬脑膜完整性；20 g 重锤从25 cm 高度自由落下，撞击硬脑膜，致大鼠左侧顶叶大脑皮质局灶性损伤，止血后以碘伏清洗，缝合头皮。假手术组大鼠仅开骨窗，不进行撞击，其余操作同造模大鼠。若大鼠出现短暂的呼吸暂停、四肢抽搐且昏迷2 h以上，则视为TBI模型构建成功[12]。选取造模成功的大鼠96只，采用随机数字表法分为TBI 组，Scu 低、高剂量组，cGAS 抑制剂组，每组24只。分组完成后，Scu低、高剂量组大鼠立即分别腹腔注射40、80 mg/kg Scu[以二甲基亚砜（DMSO）溶解后再以生理盐水稀释][10]，并鼻内滴注等量的DMSO和生理盐水；cGAS 抑制剂组大鼠鼻内滴注450 μg/kg RU.521（以DMSO溶解后再以生理盐水稀释）[13]，并腹腔注射等量DMSO和生理盐水；假手术组和TBI组大鼠均分别腹腔注射和鼻内滴注等量DMSO和生理盐水；每隔24 h给药1次，共给药4次（包括造模当天的给药）。

2.2 大鼠神经功能评估

采用改良神经功能缺损评分（modified neurological severity scores，mNSS）法进行评估。在第2、3 次和末次给药2 h 后（即给药1、2、3 d），采用mNSS 法评估所有大鼠的神经功能（包括运动、反射、感觉和平衡功能4个项目），0、1～6、7～12、13～18 分分别表示无、轻度、中度、重度神经功能障碍[14]。

2.3 大鼠脑含水量测定

采用干/湿比重法测定。末次mNSS 评分结束后每组随机抽取6只大鼠，麻醉后断头取脑，使用电子分析天平立即称定脑组织重量（即湿重），随后放入100 ℃烤箱中烘烤72 h，在此期间多次称重，直至恒重（即干重）。计算脑含水量：脑含水量（%）＝（湿重－干重）/湿重×100%。

2.4 大鼠脑组织病理学变化观察

采用HE染色法进行观察。每组另随机抽取6只大鼠，麻醉后断头取脑，将左侧损伤部位脑组织使用4%多聚甲醛固定24 h后脱水、透明、石蜡包埋和常规切片（厚度4 µm）。切片脱蜡至水后依次进行苏木素、伊红染色，脱水、透明、封片后使用光学显微镜观察脑组织病理学变化并拍照。

2.5 大鼠脑组织细胞凋亡观察

采用TUNEL染色法进行观察。取“2.4”项下脑组织石蜡切片，参照TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书，依次采用TUNEL 反应混合液、DAPI 染色，封片后使用荧光显微镜观察并拍照。TUNEL 染色阳性细胞（即凋亡细胞）的核呈绿色荧光。每张切片中随机取6个视野，使用Image J 图像分析软件计数凋亡细胞和总细胞（结果取平均值），并计算脑组织细胞凋亡率：脑组织细胞凋亡率（%）＝凋亡细胞数/总细胞数×100%。

2.6 大鼠脑组织中炎症因子含量测定

每组另随机抽取6 只大鼠，麻醉后断头取脑，采用ELISA法检测大鼠脑组织中炎症因子（IFN-β、CXCL10、TNF-α、IL-6）含量，具体操作参照相应试剂盒说明书进行。检测仪器为酶标仪（波长450 nm）。

2.7 大鼠脑组织中cGAS、STING蛋白表达测定

采用Western blot 法进行检测。将每组剩余的6 只大鼠麻醉后断头取脑，将左侧损伤部位脑组织使用RIPA裂解液裂解，提取组织中总蛋白，测定蛋白浓度后进行变性，然后通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，接着将分离的蛋白转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，以5%脱脂奶粉室温封闭1 h；加入cGAS、STING、GAPDH（内参）一抗（稀释比例分别为1∶1 000、1∶400、1∶10 000），4 ℃孵育过夜；次日洗涤后加入HRP 标记的山羊抗兔IgG 二抗（稀释比例为1∶20 000），室温孵育1.5 h；化学发光试剂（ECL）显色。扫描图像后用Image J1.8.0 软件分析蛋白条带灰度，以目的蛋白条带灰度值与内参（GAPDH）蛋白条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达水平。

2.8 统计学方法

实验数据应用SPSS 25.0软件进行统计分析。符合正态分布的数据以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验。检验水准α＝0.05。

3 结果

3.1 大鼠神经功能评估结果

给药1、2、3 d 时，与假手术组比较，TBI 组大鼠mNSS 显著升高（P＜0.05）；与TBI 组比较，Scu 低、高剂量组和cGAS 抑制剂组大鼠mNSS 均显著降低（P＜0.05）；与Scu 低剂量组比较，Scu 高剂量组和cGAS 抑制剂组大鼠mNSS 均显著降低（P＜0.05）；Scu 高剂量组和cGAS 抑制剂组大鼠mNSS 比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表1。

表1 给药不同时间后各组大鼠的mNSS 结果（±s，n＝24，分）

表1 给药不同时间后各组大鼠的mNSS 结果（±s，n＝24，分）

a：与假手术组比较，P＜0.05；b：与TBI组比较，P＜0.05；c：与Scu低剂量组比较，P＜0.05。

给药3 d 0 10.92±0.75a 8.50±0.54b 5.33±0.40bc 5.63±0.35bc 1 768.784＜0.001组别假手术组TBI组Scu低剂量组Scu高剂量组cGAS抑制剂组F P给药1 d 0 12.75±0.84a 10.29±0.76b 7.08±0.58bc 7.54±0.62bc 1 373.795＜0.001给药2 d 0 11.83±0.84a 9.38±0.68b 6.25±0.58bc 6.58±0.54bc 1 312.047＜0.001

3.2 大鼠脑含水量测定结果

与假手术组比较，TBI 组大鼠脑含水量显著升高（P＜0.05）；与TBI组比较，Scu低、高剂量组和cGAS抑制剂组大鼠脑含水量显著降低（P＜0.05）；与Scu低剂量组比较，Scu 高剂量组和cGAS 抑制剂组大鼠脑含水量显著降低（P＜0.05）；Scu高剂量组和cGAS抑制剂组大鼠脑含水量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见表2。

表2 各组大鼠脑含水量和脑组织细胞凋亡率测定结果（±s，n＝6，%）

表2 各组大鼠脑含水量和脑组织细胞凋亡率测定结果（±s，n＝6，%）

a：与假手术组比较，P＜0.05；b：与TBI组比较，P＜0.05；c：与Scu低剂量组比较，P＜0.05。

脑组织细胞凋亡率7.64±0.52 22.48±1.35a 18.57±0.94b 12.96±0.87bc 13.45±0.95bc 209.388＜0.001组别假手术组TBI组Scu低剂量组Scu高剂量组cGAS抑制剂组F P脑含水量73.85±0.84 81.94±1.06a 79.32±0.92b 75.16±0.95bc 75.73±0.97bc 73.866＜0.001

3.3 大鼠脑组织病理学变化观察结果

假手术组大鼠脑组织无明显异常。与假手术组比较，TBI组大鼠脑组织存在病理学损伤，具体表现为：大量炎症细胞（包括淋巴细胞、嗜中性粒细胞等）浸润，间质水肿，明显出血，细胞排列不规则、结构模糊且出现核固缩和核裂解。与TBI 组比较，Scu 低、高剂量组和cGAS抑制剂组大鼠上述组织病理学损伤均有不同程度改善，且以Scu 高剂量组和cGAS 抑制剂组大鼠改善更明显。结果见图1。

图1 各组大鼠脑组织病理学变化的HE染色图

3.4 大鼠脑组织细胞凋亡情况测定结果

与假手术组比较，TBI 组大鼠脑组织细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）；与TBI 组比较，Scu 低、高剂量组和cGAS抑制剂组大鼠脑组织细胞凋亡率均显著降低（P＜0.05）；与Scu 低剂量组比较，Scu 高剂量组和cGAS 抑制剂组大鼠脑组织细胞凋亡率均显著降低（P＜0.05）；Scu高剂量组和cGAS 抑制剂组大鼠脑组织细胞凋亡率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见图2、表2。

图2 各组大鼠脑组织细胞凋亡的TUNEL染色图

3.5 大鼠脑组织中炎症因子含量测定结果

与假手术组比较，TBI 组大鼠脑组织中IFN-β、CXCL10、TNF-α、IL-6 含量均显著升高（P＜0.05）；与TBI 组比较，Scu 低、高剂量组和cGAS 抑制剂组大鼠脑组织中上述指标含量均显著降低（P＜0.05）；与Scu低剂量组比较，Scu 高剂量组和cGAS 抑制剂组大鼠脑组织中上述指标含量均显著降低（P＜0.05）；Scu高剂量组和cGAS 抑制剂组大鼠上述指标含量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。结果见表3。

表3 各组大鼠脑组织中炎症因子含量测定结果（±s，n＝6，pg/mg）

表3 各组大鼠脑组织中炎症因子含量测定结果（±s，n＝6，pg/mg）

a：与假手术组比较，P＜0.05；b：与TBI组比较，P＜0.05；c：与Scu低剂量组比较，P＜0.05。

IL-6 3.85±0.46 17.69±0.92a 12.45±1.48b 5.73±0.76bc 6.58±0.83bc 216.205＜0.001组别假手术组TBI组Scu低剂量组Scu高剂量组cGAS抑制剂组F P IFN-β 0.34±0.06 2.96±0.21a 2.01±0.18b 0.87±0.09bc 0.96±0.12bc 321.629＜0.001 CXCL10 5.21±0.68 38.49±3.32a 26.17±2.85b 13.64±1.46bc 15.05±1.87bc 197.110＜0.001 TNF-α 2.96±0.31 13.14±1.20a 9.73±1.05b 4.28±0.59bc 4.85±0.64bc 162.297＜0.001

3.6 大鼠脑组织中cGAS、STING蛋白表达测定结果

与假手术组比较，TBI 组大鼠脑组织中cGAS、STING蛋白的相对表达水平显著升高（P＜0.05）；与TBI组比较，Scu低、高剂量组和cGAS抑制剂组大鼠脑组织中上述蛋白的相对表达水平均显著降低（P＜0.05）；与Scu低剂量组比较，Scu高剂量组和cGAS抑制剂组大鼠脑组织中上述蛋白的相对表达水平均显著降低（P＜0.05）；Scu 高剂量组和cGAS 抑制剂组大鼠上述蛋白的相对表达水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。结果见图3、表4。

图3 各组大鼠脑组织中cGAS、STING 蛋白的免疫印迹图

表4 各组大鼠脑组织中cGAS、STING 蛋白相对表达水平测定结果（±s，n＝6）

表4 各组大鼠脑组织中cGAS、STING 蛋白相对表达水平测定结果（±s，n＝6）

a：与假手术组比较，P＜0.05；b：与TBI组比较，P＜0.05；c：与Scu低剂量组比较，P＜0.05。

STING/GAPDH 0.28±0.04 0.87±0.06a 0.68±0.06b 0.41±0.05bc 0.39±0.05bc 127.457＜0.001组别假手术组TBI组Scu低剂量组Scu高剂量组cGAS抑制剂组F P cGAS/GAPDH 0.23±0.05 0.79±0.07a 0.62±0.06b 0.38±0.05bc 0.34±0.06bc 91.000＜0.001

4 讨论

目前，TBI 仍是全世界残疾和死亡的最常见原因之一，TBI继发性损伤在预后中的影响越来越受到关注，尤其是继发性损伤中的神经炎症反应[15]。鉴于神经炎症反应在TBI发生和病情进展中的重要作用，神经炎症相关分子靶点也一直是药物等治疗方式的主要研究方向[16]。本研究通过改良Feeney 法构建TBI 大鼠模型，结果显示，相比于假手术组大鼠，TBI 组大鼠的mNSS、脑含水量以及脑组织细胞凋亡率均升高，且脑组织存在大量炎症细胞浸润、间质水肿、明显出血等病理学损伤，表明TBI 大鼠出现神经功能缺损、脑水肿和脑组织损伤，这符合TBI临床症状，提示TBI大鼠模型制备成功，可用于药物治疗及相关机制研究。

Scu作为一种天然黄酮类活性成分，其抗炎、神经保护等特性已在多篇文献中报道。例如，Scu 可通过调节肠道菌群和抑制小胶质细胞中环磷酸腺苷/蛋白激酶A/环磷酸腺苷反应元件结合蛋白/组蛋白去乙酰化酶3 信号通路激活并逆转阿尔茨海默病β 淀粉样蛋白前体-早老蛋白-1小鼠的神经炎症和认知障碍[17]；可通过抑制磷酸化氨基末端蛋白激酶和磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶下调小胶质细胞/脑巨噬细胞中促炎介质的表达，发挥抗炎和神经保护作用[18]；可靶向作用于醛糖还原酶-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶轴发挥抗氧化作用，改善脑缺血/再灌注损伤小鼠的神经功能缺损和神经元损伤，缩小脑梗死面积[19]。但是，Scu 对TBI 的治疗作用及机制尚有待阐明。本研究中，40、80 mg/kg的Scu给药后均可降低TBI 大鼠mNSS、脑含水量以及脑组织细胞凋亡率，同时改善其脑组织病理学损伤。该结果表明，Scu可减轻TBI大鼠损伤脑组织的细胞凋亡和脑水肿，促进神经功能恢复。此外，本研究结果显示，TBI大鼠脑组织中促炎因子TNF-α、IL-6含量与行假手术的大鼠相比明显升高，这与脑组织病理结果中炎症细胞浸润情况相一致；而Scu治疗后可降低TBI大鼠脑组织中TNF-α、IL-6含量，减少其炎症细胞浸润。这表明Scu 可能通过抑制神经炎症缓解TBI。Lu 等[20]研究亦表明，Scu 可改善脂多糖诱导的TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子升高，抑制海马神经炎症并减轻小鼠抑郁样行为，与本研究结果类似。

cGAS/STING信号通路作为一条与免疫炎症密切相关的信号转导途径，可介导IFN-Ⅰ反应，诱导IFN-β、CXCL10、TNF-α等细胞因子产生，近年该通路与神经炎症和脑损伤的关系备受关注[21—22]。研究显示，激活cGAS/STING 信号通路可诱导小胶质细胞活化，促进脑部炎症[23]，而抑制该通路激活可减弱缺血/再灌注诱导的神经炎症和脑损伤[24]。本研究中，TBI 大鼠脑组织中IFN-β、CXCL10 含量及cGAS、STING 蛋白相对表达水平与行假手术的大鼠相比均显著升高，这提示TBI发生后cGAS/STING信号通路被激活，可能进而引发神经炎症。而经Scu 治疗后，TBI 大鼠脑组织中IFN-β、CXCL10 含量及cGAS、STING 蛋白相对表达水平均显著降低，表明Scu 减轻TBI 大鼠神经炎症的分子机制可能与抑制cGAS/STING 信号通路激活有关。为了更充分地验证cGAS/STING信号通路在TBI后神经炎症中的作用，本研究采用cGAS 选择性抑制剂RU.521 治疗TBI大鼠，结果显示，RU.521 除抑制cGAS/STING 信号通路激活外，同样可减轻TBI 大鼠神经炎症、损伤脑组织细胞凋亡和脑水肿，促进神经功能恢复，且作用效果与80 mg/kg Scu 几乎相当。这进一步证实了Scu 可能通过抑制cGAS/STING信号通路激活来减轻神经炎症，进而对TBI 大鼠发挥神经保护作用。Ding 等[25]研究亦表明，RU.521 可减轻脑静脉窦血栓形成小鼠的炎症和氧化应激反应，减少小胶质细胞和嗜中性粒细胞数量，同时改善神经细胞凋亡和变性以及神经功能缺损。

综上所述，Scu 可能通过抑制cGAS/STING 信号通路激活来减轻TBI大鼠神经炎症，减少其脑组织损伤及细胞凋亡，促进其神经功能恢复。但后续仍有待通过体外实验观察小胶质细胞介导的炎症反应在Scu缓解TBI中的作用及机制等，从而为Scu 应用于TBI 治疗增加说服力。