GC-MS、DSA结合化学计量学分析稀奶油发酵过程中挥发性风味物质变化

王梦松，魏超昆，范 敏，刘 慧，刘敦华

（宁夏大学食品与葡萄酒学院，宁夏 银川 750000）

奶油是从生牛乳中分离出来的脂肪部分，作为脱脂牛奶的副产物，它可以在甜点、蛋糕、冰淇淋等产品中提供柔和宜人的香气。发酵稀奶油是西方饮食中的常用配料，近年来也逐渐被人们接受并广泛应用。添加乳酸菌发酵不仅能够延长产品保质期，还能产生独特的风味和质地。然而，稀奶油制品在国内市场中还存在品种单一、品质落后等问题，大多商品还只依赖进口。唐诗宇[1]、Kim[2]等已经对稀奶油发酵工艺进行研究，确定最佳发酵菌种、发酵时间及发酵温度等，但对于稀奶油发酵过程中品质和风味差异变化的深入研究还鲜见报道。

风味是影响食品品质和消费者接受度的重要因素，不同时间条件下产品风味也有所不同。刘瑶等[3]采用气相色谱-离子迁移谱技术分析牦牛乳干酪的挥发性风味物质变化，确定了不同成熟时间内的特征风味物质，为牦牛乳干酪产品的研发提供了参考。王丹等[4]研究稀奶油发酵前后的挥发性风味物质差异，发现经发酵后稀奶油的风味组成更为丰富，酯类、醇类等香气物质明显增多。乳酸乳球菌是生产奶酪、发酵稀奶油和发酵乳的重要发酵剂之一，Beltrán-Barrientos等[5]采用固相微萃取-气相色谱-质谱法（solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS）对不同乳酸乳球菌发酵乳的挥发性物质特征进行表征，鉴定出乙酸、己醛、2-庚酮、2-甲基辛酸乙酯等主要风味化合物。Lee等[6]利用电子鼻分析乳酸乳球菌乳酸亚种和乳酸乳球菌乳脂亚种在高达奶酪中的风味成分，验证了二者组合发酵具有更丰富的风味组成，为风味发酵菌的筛选和探究发酵菌的风味机制提供了参考。因此，对发酵稀奶油挥发性物质的研究有助于更好地了解其风味组成及变化，为生产优质稀奶油制品提供理论参考，进一步提升发酵乳制品精深加工技术。

目前针对奶酪、发酵乳的风味研究数据已有大量报道，其中大多数都是利用气相色谱-离子迁移谱仪、气相色谱-质谱联用仪和气相色谱-飞行时间/质谱仪等技术进行测定[7-9]。叶婷婷等[10]对比了奶油加热前后的挥发性香气物质变化，发现奶油香气主要由短链脂肪酸、甲基酮和内酯类物质构成，并且在加热后丁酸、2-庚酮和δ-十二内酯等物质含量成倍增加。Lee[11]研究了山羊奶油黄油冷藏期间的风味物质变化，其中双乙酰、1-辛烯-3-酮、丁酸和δ-癸内酯等物质被认为是风味的主要贡献者，随着贮藏时间的延长，内酯类和脂质衍生化合物强度增加，柠檬烯等萜烯类物质水平下降，己醛、己酸、双乙酰和1-辛烯-3-酮等无明显变化。然而，对于发酵稀奶油此类高脂肪乳制品的风味研究还尚不全面，对其发酵或贮藏过程中挥发性风味物质动态变化的研究报道还相对较少。因此，本研究通过技术检测、感官描述及统计学分析方法对发酵稀奶油风味物质进行综合评价。选择乳酸乳球菌发酵的稀奶油为原料，采用SPMEGC-MS技术分析发酵过程中稀奶油挥发性风味物质的组成及含量，结合描述性感官分析（descriptive sensory analysis，DSA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘回归（partial least squares regression，PLSR）分析，探讨不同发酵时间对稀奶油风味组成的影响并筛选特征风味物质，旨在为进一步阐明其特征风味物质的形成机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

稀奶油 英国Pritchitts公司；发酵剂（乳酸乳球菌乳酸亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种）上海润盈生物工程有限公司；2-辛醇标准品 上海赛可锐生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

AL204型电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；DF-101S集热式恒温磁力搅拌器 上海予华仪器有限公司；MIX-VR旋涡混合器 上海测博生物科技发展中心；GCMS-TQ8040三重四极杆型GC-MS联用仪日本岛津公司；SPME装置（50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头）美国Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

参考Khademi等[12]的方法并稍作修改。稀奶油在15～18 MPa均质后，95 ℃杀菌10 min。随后冷却至30～40 ℃后，加入0.003%发酵剂在33 ℃开始发酵。结合前期预实验结果，将取样点设置为发酵9、15、21、27 h，样品记为F9、F15、F21、F27，并以0 h代表未发酵样品作为（F0）对照，取同一发酵时间的3 个样品保存在-20 ℃进一步测定。

1.3.2 SPME-GC-MS测定

参考程晶晶等[13]的方法适当修改。将4 g样品加入20 mL顶空萃取瓶中，并以10 μL 1 mg/L 2-辛醇作为内标物，盖好瓶塞后旋涡振荡使其混合均匀。插入老化的SPME萃取头，并推出纤维头。在65 ℃水浴条件下萃取35 min，结束后立即插入GC进样口解吸10 min。

GC条件：DB-WAX色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；氦气（纯度＞99.999%）作为载气，恒定流速为1 mL/min；在起始温度为50 ℃，以4 ℃/min速率升至125 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min速率升至210 ℃，并保持5 min；采用不分流模式，进样口温度为230 ℃。

MS条件：离子源温度为230 ℃，质量扫描范围m/z30～500，溶剂延迟为1 min。

定性定量分析：挥发性物质的定性是根据其质谱数据与NIST14与NIST14S数据库进行匹配得出，仅将相似度大于80%的化合物进行定性[14]。挥发物定量采用内标半定量法进行，含量表示为mg/kg[15]。

1.3.3 关键风味物质确定

通过气味活性值（odor activity values，OAV）确定关键风味物质，利用各挥发性物质含量与阈值的比值计算，其中阈值主要来源于已报道的数据。若OAV≥0.1则对整体风味有修饰作用，OAV≥1则对整体风味贡献较大，挥发物的OAV越大，其对整体风味的影响越大[16]。

1.3.4 感官评价

通过DSA方法对不同发酵时间的稀奶油样品进行评价。参考Liu Ao等[17]的方法，选择5 个描述词进行感官分析，分别是乳香味、甜味、奶油味、发酵味和果香味。根据风味强度划分为0～9的分数区间，其中0代表没有该香气，9则代表该香气浓郁。每个样品随机编码后分配给由10 名男女比例相同的专业感官评价人员进行评判并打分。

1.4 数据统计与分析

实验数据均采用Excel进行数据统计，各实验进行3 次平行，结果以表示。应用Origin 2022b进行PCA，SPSS 23对数据进行方差分析，P＜0.05，差异显著。采用Unscrambler X分析软件中的PLSR进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 挥发性风味物质定性定量结果

采用GC-MS对稀奶油样品在0、9、15、21、27 h 5 个时间点的挥发性化合物进行分析，结果如表1所示。在稀奶油发酵前后共鉴定出32 种化合物，包括酸类14 种、酮类6 种、酯类6 种、烷烃类2 种、烯烃类1 种和醇类3 种。这些挥发性物质的产生与碳水化合物、蛋白质和脂质的代谢密切相关，共同造就了发酵稀奶油的独特风味。其中在0、9、15、21、27 h样品分别鉴定出22、25、29、28、28 种挥发性化合物。随着发酵的时间延长，微生物作用开始增强或减弱，导致各挥发性化合物含量升高或降低。丁酸、苯甲酸、3-羟基-2-丁酮、乳酸乙酯、2,3-丁二醇、2-甲基戊酸甲酯等物质仅在发酵阶段被检测到，说明部分风味前体物质在酶作用下发生了降解，导致更多的小分子挥发物生成。因此，稀奶油在发酵后的风味成分更加丰富，各时期的挥发性化合物差异体现在物质含量不同。

表1 不同发酵时间对奶油挥发性成分的影响Table 1 Effect of different fermentation time on volatile components of cream

酸类物质对发酵乳制品风味的形成有重要影响，它不仅自身可作为一种风味物质而且还是酮、醇、酯等风味成分的前体物质[19]。在稀奶油发酵过程中检测到了丰富的酸类物质，包括乙酸、丁酸、月桂酸、棕榈酸以及苯甲酸等。它们通常来源于脂质分解、蛋白质水解或乳糖发酵途径[20]。在发酵样品中检测到的乙酸、己酸等短链脂肪酸含量显著高于未发酵的样品（P＜0.05）。乙酸通常由乳糖经微生物作用产生，一般具有酸味和刺鼻味[21]，在发酵第15小时含量最高，达到（0.96±0.04）mg/kg。丁酸、己酸、辛酸、壬酸、癸酸的产生与脂质代谢过程相关，这些物质一般在低浓度下表现出愉悦的香气，而在高浓度下会产生令人不悦的风味。例如，己酸在低浓度下有花香、奶香和甜味，而在高浓度下会产生刺鼻、腐臭等异味[22]。月桂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸等长链脂肪酸在发酵前后含量发生了较大变化，其产生是发酵前期乳酸菌分泌脂肪酶，导致乳脂降解为游离脂肪酸，这一过程可能与乳酸菌的残留活性和自溶作用有关[23]。随着反应的进行，脂质自氧化或微生物作用增强，脂肪酸进一步分解或氧化成小分子物质，导致含量逐渐降低。苯甲酸仅在发酵过程中被检测到，并且其含量随着时间的延长不断降低。它的产生可能与苯甲醛被氧化有关。苯甲醛主要来源于脂肪酸的α-氧化或β-氧化过程，具有杏仁或水果的香气[9]。醛类物质被认为是乳制品风味组分中存在时间较短的成分，因为它们产生后会被迅速氧化或还原成相应的酸或醇[24]。因此，在本实验中未检测到醛类物质的存在。

酮类物质也是一类重要的气味成分，它们在整体香气中主要贡献黄油味、奶油味和甜味等香气，主要来源于氨基酸的热降解、脂肪酸的β-氧化和美拉德反应过程[25]。共检测到酮类6 种，分别是2-庚酮、2-壬酮、2-十一酮、2-十三酮、2-十五酮和3-羟基-2-丁酮，这些物质大多具有花香、果香、奶油香气等令人愉悦的气味。2-庚酮可提供水果味和甜味，是奶油、奶酪制品中的特征香气物质，2-壬酮有花香、果香等香气[4]。2-十一酮具有花香味，其含量在发酵第15小时达到最大，之后开始降低。3-羟基-2-丁酮是柠檬酸代谢途径中双乙酰的还原产物，它具有奶油香气[26]。

酯类物质因为阈值较低，在形成乳制品香气的过程中贡献很大，主要贡献花香和果香气味[27]。在稀奶油发酵过程中共检测到6 种酯类，其中包括δ-辛内酯、δ-癸内酯、δ-十二内酯3 种内酯类物质，乳酸乙酯、2-甲基戊酸甲酯和邻苯二甲酸二乙酯。酯类的生成与脂肪酸和醇的酯化作用相关[20]。内酯类化合物是不饱和脂肪酸经β-氧化过程生成的环状化合物，具有强烈的水果香气和奶油香气[28]。酯类物质的形成能够减少由脂肪酸类化合物产生的不良气味和氨基产生的苦味，并且在低水平下就能提供积极的风味[29]。

醇类物质的来源主要有乳糖代谢、氨基酸代谢、甲基酮和醛类的还原以及亚油酸、亚麻酸降解[30]。仅检测到2,3-丁二醇、十八烯醇和3,7,11-三甲基-1-十二烷醇3 种醇类。2,3-丁二醇仅在发酵第9小时以后被检测到，它是乙偶姻的还原形式，可以通过乳酸菌的糖酵解途径或柠檬酸代谢产生，具有黄油的典型香气[23]。在稀奶油发酵过程中检测到十七烷和二十一烷两种烷烃类物质，它们的含量变化在发酵过程中不显著（P＞0.05）。由于阈值较高且无典型香气，所以在乳制品中不是主要的风味物质[4]。

综上可知，乙酸、己酸、辛酸、癸酸、δ-癸内酯等物质是发酵第15小时的特征物质，这些物质大多与风味直接相关，所以该时期的风味表现可能更为丰富。由此可见发酵时间对稀奶油风味有一定影响，过长的时间不一定会有良好的风味表现。因此，在后续稀奶油风味品质研究中应考虑菌种发酵活力和控制发酵时间。

2.2 挥发性风味物质PCA

PCA是一种无监督的多元统计分析方法，可用于概述挥发性成分的差异并评估样品之间的规律性和差异性[31]。在PCA中具有相似香气特征的样品间会相互靠近甚至重叠，若香气特征不同样品间就会分离[32]。如图1所示，PC1（52.3%）和PC2（37.6%）的累计方差贡献率为89.9%，说明此PCA分离模型有效。通常当累计贡献率达到60%时，PCA模型被认为可以用作分离模型[33]。根据样品间的分布特征，可以了解到不同发酵时间与风味物质间的关系。未发酵样品与发酵样品间的分布较分散，说明稀奶油在发酵前后风味差异较大。发酵第9、15小时的样品分布距离其他组较远，表明这2 个时期的挥发性物质组成有较大差异，这是因为棕榈酸、乙酸、己酸、δ-癸内酯等特征物质将这2 组样品很好地区分开。未发酵样品与发酵第21、27小时样品间的分布相对靠近，说明它们的风味较为相似，各挥发物的含量均较低。总体来看，各样品的组内散点分布相互聚集，显示出组内重复性比较好，样本数据相似。所以，采用GC-MS测定稀奶油的挥发性风味物质能够很好地表征不同发酵时间的风味差异。载荷系数可以反映不同挥发性成分对各主成分的影响，因子载荷系数越大，说明其与主成分相关性越强[34]。从图1可以看出，δ-癸内酯、癸酸、辛酸与PC1呈高度正相关，载荷系数最大。PC2则主要与油酸、顺式-十八碳烯酸和棕榈酸呈高度正相关，与δ-癸内酯、癸酸和3-羟基-2-丁酮呈高度负相关。其中，几乎所有挥发物都与发酵9 h和15 h样品有关。发酵9 h样品的香气成分主要与酸类、烷烃类等阈值较高的物质有关，对整体香气无重要贡献作用。而发酵15 h样品的香气主要与酮类、酯类和醇类等物质相关。2-十一酮、3-羟基-2-丁酮、δ-癸内酯和δ-辛内酯通常具有令人愉悦香气，由于阈值较低，对整体香气有重要贡献作用，该结果进一步证明了发酵15 h样品的风味更佳。

图1 不同发酵时间挥发性风味物质PCA评分图和载荷图Fig.1 PCA score and loading plots of volatile flavor substances at different fermentation times

2.3 不同发酵时期稀奶油样品关键风味成分的确定及感官评价

挥发性化合物含量并不能够完全反映该物质对香气的贡献度，为判断其对整体香气的影响程度，进一步建立风味物质与感官属性之间的联系，本研究通过OAV确定对风味影响较大的关键物质。OAV通常用于评价挥发性化合物对整体风味的贡献程度，通过查询挥发性组分在水中的阈值，与挥发物浓度经过计算得出OAV，从而确定关键风味化合物。各组分OAV的大小与其香气贡献程度成正相关。由表2可知，在0.1≤OAV＜1和OAV≥1的区间内，共检测到15 种对风味有一定影响的挥发物，其中包括8 种酸、4 种酮和3 种酯。在未发酵样品中有5 种物质的OAV大于1，分别是癸酸、2-壬酮、2-十一酮、δ-癸内酯和δ-十二内酯，它们是组成稀奶油风味的关键风味物质，这与李良[35]的研究一致。在发酵后增加了苯甲酸和3-羟基-2-丁酮两种OAV大于1的关键风味成分。丁酸、己酸、月桂酸、2-十三酮、δ-辛内酯等物质（0.1≤OAV＜1）能够和其他风味成分形成协同作用，因此对整体风味有重要的修饰作用[35]。δ-癸内酯是所有组分中OAV最大的物质，在发酵第15小时其OAV为213.95，对整体风味的形成有重要贡献。内酯类物质通常具有较低的阈值，具有桃味、杏味、椰子味等强烈的水果香气，同时它还有助于产品呈现黄油状丝滑的感觉[36]。

表2 奶油发酵过程中的关键风味物质Table 2 Key flavor substances during cream fermentation

根据奶油味、乳香味、甜味、发酵味、果味5 个基本属性对不同时期稀奶油样品进行描述性感官分析，结果如图2所示。在F0样品中乳香味和奶油味的得分较高，由于稀奶油脂肪含量较高，所以在未发酵样品中有强烈的脂肪香气。随着发酵的进行，发酵酸味越来越强烈，在15、21 h和27 h均具有较高得分，而奶油香味和乳脂香气随着发酵味的增强逐渐被掩盖，得分越来越低。果味和甜味在整体评价中不易被感知，所以得分相对较低。

图2 不同时期样品描述性感官分析结果Fig.2 DSA results of samples from different fermentation periods

2.4 关键风味成分与感官评价间相关性分析

将OAV大于1的9 种风味物质作为关键风味成分，分别是癸酸、辛酸、苯甲酸、棕榈酸、δ-癸内酯、δ-十二内酯、2-十一酮、2-壬酮和3-羟基-2-丁酮。采用PLSR对这几种物质的GC-MS数据和DSA结果进行处理，建立分析模型，研究关键风味成分与感官评价之间的相关性。如图3所示，X轴表示化合物含量，Y轴为DSA结果。该模型内外两椭圆分别表示所解释方差的50%和100%[37]。除乳香味外其他感官属性与关键风味物质均分布在两椭圆之间，说明该模型可以解释这些变量。根据中间的轴线可将模型分为4 个象限，位于同一象限内的2 个变量间的相关性较强，且变量间距离越近，相关性越强。发酵味和奶油味与癸酸、辛酸、δ-癸内酯、2-十一酮、2-壬酮和3-羟基-2-丁酮相关性较强。δ-十二内酯则与果味和甜味有关。3-羟基-2-丁酮是发酵乳制品中的典型香气，已被证明与奶油香气有关[27]。

图3 关键风味成分与感官评价间PLSR分析Fig.3 PLSR analysis between key flavor components and sensory evaluation

3 结论

采用SPME-GC-MS技术分析了稀奶油发酵过程中5 个不同时间点的挥发性物质变化规律，结合DSA和化学计量学方法进行进一步讨论。在稀奶油样品和发酵样品中共检测到32 种化合物，包括酸类14 种、酮类6 种、酯类6 种、烷烃类2 种、烯烃类1 种和醇类3 种。通过PCA评估了不同样品间的差异和各时期风味组成的主要贡献化合物，结果表明不同发酵时期稀奶油样品的挥发性风味物质组成可以被区分，特别是在发酵15 h，有大量香气物质存在并且与酮类、酯类和醇类等物质有较强的相关性。综上，在由乳酸乳球菌发酵的稀奶油中，发酵15 h可能是风味最佳的时期，为后续工业化生产提供了理论参考。同时，通过OAV确定关键风味物质，利用PLSR分析讨论关键风味物质与感官评价间的相关性，发现发酵风味可能与酸类物质相关，酮类物质与奶油香气间有较强相关性，内酯类物质则与果味和甜味相关，因此在生产过程中应加强控制此类物质的形成，以保证稀奶油制品的特征香气。在对稀奶油发酵过程中挥发性风味物质变化的探讨中发现，部分小分子风味物质的产生可能与脂质代谢过程相关，比如酸、醇、酮、酯等物质。有关发酵稀奶油脂质对风味形成的影响还需要进一步研究，以深入了解脂质代谢对特征风味的形成机制，从而实现对发酵稀奶油风味的改良与调控，以满足消费者对产品的期望与需求。