壳聚糖基碳点纸芯片检测槐米中芦丁含量

乐 薇，蒙利秀，王 源，覃永薇

（武汉工商学院环境与生物工程学院，湖北 武汉 430065）

芦丁是一种天然黄酮类化合物，广泛存在植物中，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、清除自由基、降血糖、促进血管舒张等多种药理作用，同时也可用作食品抗氧化剂和色素等，在药物和食品中的应用越来越广泛[1-3]。槐米是豆科植物槐树（Sophora japonicaL.）的干燥花蕾，有凉血止血、清肝泻火等功效，是一种药食同源的药材[4]。槐米是提取芦丁的主要原料，槐米中芦丁含量的高低成为决定槐米品质的重要指标[5-6]。由于芦丁含量受品种、产地、栽培过程和槐米加工技术等多种因素影响[7-9]，因此开发一种简便快捷、低廉、现场化的芦丁检测方法很有必要。

芦丁含量的测定方法主要有高效液相色谱法[10-11]、荧光法[12-13]和电化学法[14-15]等。随着新技术的发展，碳点因其具有出色的荧光特性、光稳定性、制备原料来源广泛、制备过程简单多样等优点[16]，在荧光法高效快速测定芦丁含量中的应用已引起不少学者关注，如Li Huiyu等[17]使用多壁碳纳米管作为载体，吗啉乙磺酸为前体，通过固态热裂解法合成了碳点，以此碳点的荧光响应检测了芦丁片剂、人尿和人血清样品中的芦丁；Sinduja等[18]利用非必需氨基酸天冬酰胺合成碳点，计算了该碳点与芦丁的猝灭常数和结合常数，并应用于芦丁片中芦丁含量测定；丁志杰[19]和王靖原[20]等分别以生物质银杏叶、红枣为碳源采用水热法制备了能用于芦丁荧光检测的碳点；此外Xie Xiaoqian等[6]以反蛋白石光子晶体为骨架，以碳点为荧光响应材料，制备了一种对芦丁有特定识别能力的碳点包埋的分子印迹光子晶体水凝胶，并应用于槐花中芦丁含量的测定。

纸芯片具有成本低、便携、操作简便等优点，与智能手机联用的微流控纸芯片分析传感方法被广泛认为是快速检测发展的主流方向[21-22]。目前已有将碳点和纸芯片结合制备碳点纸芯片的报道，如Rossini等[23]采用蜡印并加热熔化蜡的方法在滤纸上形成疏水屏障，荧光碳点溶液滴加在亲水区，制备出检测血清和尿液的葡萄糖碳点纸芯片；Liu Cui等[24]用碳点溶液做油墨，通过喷墨打印制备碳点纸芯片；Yen-Linh[25]和Du Xiaoyan[26]等则将剪切法获得的圆形滤纸片直接滴加或浸泡于碳点溶液制备碳点纸芯片。上述蜡印法和喷墨法需要特殊的仪器，剪切法得到的纸芯片每片仅能测试一个样品，且蜡印法和剪切法中碳点溶液直接滴加于纸基材料上，碳点与纸基材料的作用力不强，有可能有碳点不耐受样品液的冲洗出现显色不均的情况。基于此，本研究开发一种壳聚糖基碳点纸芯片，选择对芦丁有高选择性的荧光碳点，利用壳聚糖的成膜性，于滤纸表面形成碳点壳聚糖薄膜，使碳点均匀的固定于纸芯片中，点样后样品斑点由于壳聚糖膜适宜的疏水作用可限制在一定区域内均匀显色，可同步实现芦丁标准溶液和多个样品的检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

槐米 广齐生物科技有限公司；D-天冬酰胺（纯度98%）、壳聚糖（脱乙酰度≥95%）上海麦克林生化科技有限公司；芦丁、槲皮素、山柰酚（纯度≥99%）天津一方科技有限公司；异鼠李素、绿原酸（纯度≥99%）金测分析（天津）有限公司；甲醇（色谱纯）天津市凯通化学试剂有限公司；其他试剂均为国产分析纯；实验用水为超纯水。

1.2 仪器与设备

JYO2S型紫外分析仪 北京君意东方电泳设备有限公司；721型分光光光度计 上海光谱仪器有限公司；F97Pro荧光分光光度计 上海棱光技术有限公司；小米12智能手机 北京小米科技有限责任公司；定性滤纸（中速）杭州通用电气生物有限公司；LC-201A高效液相色谱仪 美国英特矽尔公司。

1.3 方法

1.3.1 碳点溶液的制备

根据文献[18]，稍作修改。称取天冬酰胺0.5 g，加热至200 ℃保温10 min，冷却后得到棕色固体粉末，加适量水溶解后10000 r/min离心，取上清液用0.22 μm滤膜过滤，干燥后用0.1 mol/L NaOH溶液溶解配制成一定浓度的碳点溶液，4 ℃保存备用。

1.3.2 碳点-芦丁二元荧光光谱及碳点-壳聚糖-芦丁三元荧光光谱

准确移取5 mg/mL的碳点溶液0.2 mL，一定浓度的壳聚糖溶液（1% HAc溶液为溶剂）0.1 mL和一定浓度的芦丁溶液（50%乙醇溶液为溶剂）1.0 mL，加水稀释至10 mL，10 min后于激发波长365 nm处扫描各体系的荧光发射光谱。

1.3.3 壳聚糖基碳点纸芯片的制备

量取16 mL一定质量浓度的壳聚糖溶液（1% HAc溶液为溶剂）和4 mL不同质量浓度的碳点溶液，磁力搅拌30 min，得含一定浓度的壳聚糖和碳点的铸膜液。将裁剪好的滤纸条浸入铸膜液1 min，取出，均匀地刮去滤纸条两面多余的铸膜液，平铺于已洗净并干燥的玻璃板上，晾干即得壳聚糖基碳点纸芯片。

1.3.4 壳聚糖基碳点纸芯片法的可行性分析

芦丁标准溶液的制备：准确称取20 mg芦丁，加30%乙醇溶液溶解并定容50 mL，得0.4 mg/mL芦丁溶液。准确移取0.4 mg/mL芦丁溶液0、0.5、1 mL，加30%乙醇溶液补充体积至1 mL，再加水定容至10 mL，得到0、20、40 μg/mL芦丁溶液。

按1.3.3节制备壳聚糖基碳点纸芯，其中壳聚糖质量浓度25 mg/mL、碳点质量浓度10 mg/mL。另将滤纸浸入2 mg/mL碳点溶液中后取出，晾干，即得不含壳聚糖的碳点纸芯片。在不含壳聚糖的碳点纸芯片和壳聚糖基碳点纸芯片上各点样0、20、40 μg/mL芦丁标准溶液4 μL，30 min后在波长365 nm处紫外灯照射下观察显色斑点情况。

1.3.5 单因素试验优化

为提高碳点纸芯片测定芦丁的灵敏度，以配制芦丁溶液的溶剂（即芦丁质量浓度为0 μg/mL）为空白，考察芦丁点样后显色斑点的红（R）、绿（G）、蓝（B）值的差值（ΔR、ΔB、ΔG），以其为评价指标进行单因素优化试验。

1.3.5.1 壳聚糖浓度的优化

按1.3.3节制备壳聚糖基碳点纸芯片，壳聚糖终质量浓度分别为5、10、15、20 mg/mL，碳点的终质量浓度为5 mg/mL。在纸芯片上加入4 μL 20 μg/mL芦丁溶液（配制方法同1.3.4节），显色30 min后拍摄365 nm波长处的荧光图片。

1.3.5.2 碳点质量浓度的优化

按1.3.3节制备壳聚糖基碳点纸芯片，壳聚糖终质量浓度为20 mg/mL，碳点终质量浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL。在纸芯片上各加入4 μL 10、20 μg/mL芦丁溶液（配制方法同1.3.4节），显色30 min后拍摄365 nm波长处的荧光图片，并分析显色斑点的ΔR、ΔG、ΔB值。

1.3.5.3 溶剂优化

按1.3.3节制备壳聚糖基碳点纸芯片，壳聚糖终质量浓度为20 mg/mL，碳点终质量浓度为1.0 mg/mL。在纸芯片上各加入4 μL 10、20 μg/mL芦丁溶液，芦丁的溶剂分别为0%、30%、50%、70%乙醇溶液，显色30 min后拍摄365 nm波长处的荧光图片，并分析显色斑点的ΔR、ΔG、ΔB值。

1.3.5.4 点样体积优化

按1.3.3节制备壳聚糖基碳点纸芯片，壳聚糖终质量浓度为20 mg/mL，碳点终质量浓度为1.0 mg/mL。在纸芯片上滴加不同体积（2、3、4、5、6、7 μL）20 μg/mL芦丁溶液（溶剂为50%乙醇溶液），显色30 min后拍摄365 nm波长处的荧光图片，并分析显色斑点的ΔR、ΔG、ΔB值。

1.3.5.5 显色时间优化

按1.3.3节制备壳聚糖基碳点纸芯片，壳聚糖终质量浓度为20 mg/mL，碳点终质量浓度为1.0 mg/mL。在纸芯片上滴加4 μL 20 μg/mL芦丁溶液（溶剂为50%乙醇），在不同显色时间（10、15、20、25、30、40、60 min）下拍摄365 nm波长处的荧光图片，并分析显色斑点的ΔR、ΔG、ΔB值。

1.3.6 壳聚糖基碳点纸芯片测定槐米中芦丁的含量

1.3.6.1 芦丁待测液制备

采取超声波法[27]制备芦丁待测液，略有修改。槐花粉碎后准确称取0.1 g，加60%乙醇溶液10 mL，提取温度45 ℃，超声时间60 min，提取后，自然冷却至室温，过滤后取上清液0.5 mL，加50%乙醇溶液定容至25 mL。

1.3.6.2 芦丁含量测定

在壳聚糖基纸芯片上，依次滴加4 μL 0、4、10、20、40、60、80、100 μg/mL的芦丁标准溶液（50%乙醇溶液为溶剂）和供试液，20 min后，将待测纸芯片水平置于紫外分析仪的暗箱中，于365 nm波长处将智能手机镜头置于紫外分析仪的相机拍照口，每次拍摄均采用2 倍焦距拍照模式。用Adobe Photoshop CS5.1软件处理得到整个显色区域的R、G、B平均值，然后再将计算得到的对应差值，代入最优浓度的拟合方程中，得到供试液中芦丁质量浓度，按下式计算槐米样品中芦丁含量：

式中：V为槐米待测液体积/mL；n为稀释倍数；m为槐米样品质量/mg；C为槐米待测液中芦丁质量浓度/（mg/mL）。

1.3.7 高效液相色谱法测定槐米中芦丁的含量

1.3.7.1 芦丁标准溶液及槐米待测液配制

芦丁标准溶液：精密称取芦丁对照品10 mg，加甲醇定容至100 mL，配制成0.1 mg/mL的芦丁溶液。再分别取2、4、6、8 mL上述溶液，加甲醇稀释至10mL，得0.02、0.04、0.06、0.08 mg/mL的芦丁溶液。

槐米待测液：将槐米研碎，用100 目筛子过筛，称取50 mg，加甲醇50 mL，超声60 min，冷却，用甲醇定容至100 mL，摇匀。经0.45 μm滤膜过滤即得槐米待测液。

1.3.7.2 高效液相色谱条件[28]

Inertsil ODS-SP色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-1%冰醋酸（32∶68，V/V）；检测波长257 nm；室温；流速1 mL/min；进样体积10 μL。

1.4 数据处理

每组实验至少重复3 次，用Excel 2019软件进行数据的统计分析，结果表示为，采用Origin Pro 2015软件进行谱图绘制。

2 结果与分析

2.1 可行性分析

2.1.1 碳点-芦丁二元荧光光谱及碳点-壳聚糖-芦丁三元荧光光谱

纸芯片点样后在365 nm紫外灯照射下观察荧光显色斑点，考察存在或不存在壳聚糖时，芦丁对碳点的荧光猝灭情况。由图1A可知，芦丁对碳点有明显的荧光猝灭现象，质量浓度远高于芦丁的壳聚糖也表现出较弱的猝灭作用，芦丁和壳聚糖的加入均不改变碳点的发射峰位置。当向碳点-芦丁体系加入壳聚糖时，发现碳点的荧光强度继续下降，而进一步增加壳聚糖浓度时，碳点荧光强度下降程度减弱。当壳聚糖质量浓度不小于0.1 mg/mL时，体系的荧光强度不再随壳聚糖质量浓度的变化而变化，且和无壳聚糖体系的荧光强度相差不大，说明在较高壳聚糖质量浓度下，碳点-芦丁体系的荧光强度几乎不受壳聚糖质量浓度影响。推测壳聚糖上的氨基和羟基可能与碳点表面的羟基、氨基发生作用，但壳聚糖空间构型庞大、其自身的氨基和羟基会形成分子内及分子间氢键作用，造成其与碳点发生作用的位点数量少，从而对碳点有猝灭作用但不明显；进一步增加壳聚糖质量浓度时，由于壳聚糖的自聚合作用，其表面自由的氨基和羟基进一步减少、空间构型更大，与碳点发生作用的位点极少，因而对碳点-芦丁体系的影响可忽略。

图1 各体系下的荧光光谱（A、B、C）和标准曲线（D）Fig.1 Fluorescence spectra (A,B,C) and standard curves (D) of each system

比较不同芦丁质量浓度下的碳点-芦丁荧光发射光谱（图1B）和碳点-壳聚糖-芦丁荧光发射光谱（图1C），两体系的最大发射波长一致，曲线形状相似。进一步测定各体系在最大发射波长450 nm处的荧光强度，以芦丁质量浓度为0的体系为对照，计算荧光强度改变值ΔF，以ΔF为纵坐标、芦丁质量浓度C为横坐标绘制标准曲线（图1D），发现壳聚糖存在时，标准曲线线性仍较好，仅斜率略微下降（即检测灵敏度略下降）。综上可知，壳聚糖（≥0.1 mg/mL）存在对芦丁猝灭碳点荧光的影响较小，可将壳聚糖作为载体固定碳点进行纸芯片的制备。

2.1.2 壳聚糖基纸芯片测定芦丁含量的可行性

如图2所示，发现当壳聚糖与碳点混合制成铸膜液并干燥后，在滤纸上形成了含有碳点的壳聚糖薄膜，碳点可均匀固定在壳聚糖薄膜中，能有效承受冲洗。相比碳点纸芯片，壳聚糖基碳点纸芯片背景更明亮，斑点扩散不明显，呈现出很好的显色均匀性，且斑点颜色随着芦丁质量浓度的增加呈现梯度变化。

图2 芦丁在碳点纸芯片（A）和壳聚糖基纸芯片（B）上的显色情况Fig.2 Chromogenic reaction of rutin on CD paper chip (A) and nonimprinted paper chip (B)

2.2 检测机理探讨

天冬酰胺含有氨基和羧基，以它为单一原料经热裂解后可形成表面富含氨基和羧基的碳点[18]。当加入芦丁时，芦丁上的羟基能与碳点的氨基和羧基产生氢键，由于芦丁的紫外吸收光谱和碳点的荧光发射光谱（λEx=365 nm）有重合（图3），推测芦丁与碳点发生了内源性荧光猝灭。

图3 芦丁的紫外吸收光谱（a）和碳点的荧光发射光谱（b）Fig.3 UV absorption spectrum of rutin (a) and fluorescence emission spectrum of CDs (b)

在纸芯片法中，当将壳聚糖和碳点混合后，基于壳聚糖自身的氢键作用和其大分子的空间位阻作用，高质量浓度的壳聚糖可在碳点分子周围产生分子间的堆砌，成膜后即使碳点被固定于壳聚糖膜的缝隙间，碳点表面的氨基和羧基仅有少量与壳聚糖发生作用，其他大量的氨基和羧基仍裸露于碳点表面，可与芦丁发生荧光猝灭。

2.3 壳聚糖基碳点纸芯片的制备优化

2.3.1 壳聚糖质量浓度的影响

壳聚糖可改变纸芯片的亲水程度，考察铸膜液中壳聚糖质量浓度对芦丁显色的影响（图4），发现随着壳聚糖质量浓度的增加，斑点扩散程度减缓。壳聚糖质量浓度在5、10 mg/mL时显色斑点扩散明显，质量浓度15 mg/mL时斑点有部分扩散且显色图形不规则，在20 mg/mL时斑点小且显色均匀。这是因为壳聚糖低质量浓度时黏度低，能进入滤纸间隙无法成膜，高质量浓度时黏度高，部分壳聚糖未能进入滤纸间隙[29]，可在滤纸表面成膜，壳聚糖分子中丰富的羟基和氨基使壳聚糖分子内和分子间的氢键作用较强，分子间堆砌紧密，使膜具有一定的疏水性，从而表现出纸芯片的亲水性变弱，由于样品溶剂为醇-水体系，亲水性强，因此样品溶液点样后显色斑点限定在一定的区域。因此后续实验选择壳聚糖质量浓度为20 mg/mL。

2.3.2 铸膜液中碳点质量浓度的影响

如图5所示，随着碳点质量浓度的增加，ΔR值略有增加而后趋于稳定，ΔG值和ΔB值呈现先增加后下降的趋势，在碳点质量浓度为1.0 mg/mL时出现最大值。这是因为碳点质量浓度较大时，背景荧光强度大，造成芦丁点样后荧光强度变化不明显，而添加量较小时，背景荧光强度减弱，且与芦丁作用的碳点位点变少而造成变化不明显。故预聚液中碳点的最优质量浓度为1.0 mg/mL。

2.4 纸芯片显色条件的优化

如图6A所示，发现随着乙醇体积分数的增加，由于乙醇的蒸发作用显色斑点干燥时间明显变短，同时溶液的极性减弱、疏水性增强，也造成显色斑点的面积增大、ΔR、ΔG、ΔB下降，亦即灵敏度减小。综合考虑干燥时间和灵敏度，选择乙醇体积分数为50%。

如图6B所示，发现随着点样体积的增加，显色斑点面积略有增加，但干燥所需时间增加明显。点样体积过小或过大也造成平行实验结果的标准偏差变大，重复性下降。综合考虑干燥时间、灵敏度及重复性，选择点样体积为4 μL。

斑点在点样10 min内由于溶剂的蒸发作用逐步干燥，可见光下其斑点面积无变化，干燥后立即在365 nm紫外灯下观察并分析ΔR、ΔG、ΔB值。由图6C可知，ΔR、ΔG、ΔB值在显色时间15 min以内时出现波动，20 min达到稳定。实验也发现显色时间90、120 min时ΔR、ΔG、ΔB值仍较稳定，可以推断该体系荧光能够较长时间稳定存在，长时间放置结果变化较小。选择显色时间为20 min。

2.5 标准曲线的绘制

在最佳的纸芯片制备条件和显色条件下，滴加不同质量浓度芦丁标准溶液进行拍照（图7），并读取显色斑点的ΔR、ΔG、ΔB值，代入不同的数学模型中进行线性拟合，通过决定系数R2的判断，本实验建立的标准曲线方程为ΔG=-0.869C+27.274（R2=0.9944）。继续呈梯度增加芦丁标准溶液质量浓度，发现当芦丁质量浓度为4～120 μg/mL时，荧光斑点的ΔG值与芦丁质量浓度依旧呈线性关系。对空白溶液进行11 次重复实验，按照检出限=空白测定值标准差3 倍/标准曲线斜率，得到检出限为2.8 μg/mL。

图7 芦丁标准溶液的荧光显色图片Fig.7 Fluorescent color photos of rutin standard solution

2.6 方法的选择性

为评价方法的选择性，在芦丁质量浓度为20 μg/mL下，测定了常见离子、葡萄糖、蛋白质、氨基酸和酚酸类及槐米中存在的黄酮类化合物对芦丁荧光显色斑点的影响。以标准曲线纵坐标ΔG值的变化量为考察目标，结果如表1所示。

表1 共存物质的显色斑点ΔG值Table 1 ΔG value of colored spots of coexisting substances

以ΔG值的变化量在5%以内为指标，可见常见离子（Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cl-、F-、SO42-）、蛋白质（牛血清白蛋白）、氨基酸（酪氨酸、甘氨酸）、糖（蔗糖、葡萄糖）等大量存在时对测定无影响；与芦丁能产生配位作用的金属离子Zn2+、与芦丁结构相似的酚酸类物质（绿原酸）在该测定体系中也能允许较大量存在；黄酮类物质（槲皮素、异鼠李素、山柰酚），其浓度为芦丁浓度数倍以内时，对测定的影响可忽略，由于槐米芦丁含量很高，槲皮素、异鼠李素、山柰酚等的含量远低于芦丁浓度[30]，上述共存物质的影响可忽略。因此该纸芯片测定体系有较强的选择性，能适用于槐米等复杂体系中芦丁含量的测定。

2.7 实际样品测定

按1.3.6节，对3 批次的槐米样品平行测定3 次，计算测定值的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），结果如表2所示，测出槐米中芦丁的相对含量平均值为23.85%、22.83%、20.30%，RSD分别为6.1%、5.6%、6.7%，其测定结果与高效液相色谱法测定结果相近。对其中一批次样品进行的加标回收分析如表3所示，可知碳点纸芯片法的样品回收率在91.27%～107.5%之间，RSD为6.7%。

表2 碳点纸芯片法和高效液相色谱法测定槐米中芦丁含量Table 2 Results of detection of rutin in flower buds of S.japonica by CD paper chip and HPLC

表3 碳点纸芯片法测定芦丁的加标回收实验结果Table 3 Spiked recoveries of CD paper chip

3 结论

制备了一种壳聚糖基碳点纸芯片并将其成功用于槐米中芦丁含量的测定，芦丁质量浓度在4～120 μg/mL时与其荧光显色斑点的ΔG值呈良好的线性关系，R2=0.9944，测定结果与高效液相色谱法相近。由于碳点的荧光稳定性，实验发现制备好的碳点纸芯片在干燥条件下保存3 个月后仍可获得良好的测定结果。纸芯片制备无繁琐步骤，仅需将碳点与壳聚糖混合，于滤纸上铸膜即可得到，纸芯片大小可根据待分析样品个数自由裁剪，成本低廉，可快速批量制备；样品液点样后在紫外灯下即可检测，可直接通过标准溶液和样品溶液显色斑点的颜色深浅进行半定量分析，也可以采用photoshop软件或手机颜色识别器应用软件读取斑点颜色G值进行定量分析。该法简便快捷，能满足复杂体系中芦丁含量的现场快速测定，后续可进一步开发对芦丁有高选择性、自然光下即可显色的传感器。