普洱熟茶关键香气物质热释放规律分析

石禾云，杨豆豆，张 娅，王 超，张 军,

（1.天津农学院食品科学与生物工程学院，天津 300392；2.天士力控股集团有限公司研究院，天津 300410；3.湖南农业大学园艺学院，湖南 长沙 410125）

普洱熟茶是一种特殊的微生物后发酵茶，属于黑茶，是云南经济的重要产业。它以其独特的风味特点和突出的保健功效深受消费者的喜爱。普洱茶的香气与滋味一样，是评价普洱茶品质的重要指标之一。顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HSSPME）法是目前较为成熟的萃取技术，与气相色谱类仪器联合使用，已广泛应用于茶叶等食品中挥发性成分的提取检测分析。气相色谱-嗅闻（gas chromatographyolfactometry，GC-O）技术（直接强度、稀释因子和检测频率）和气味活性值（odor activity value，OAV）通常联合应用于研究复杂基质中的挥发性成分[1]。Deng Xiujuan等[2]基于OAV分析了3 种香气类型（即清新香、果菌香和陈香）普洱茶的关键香气化合物。结果表明，β-大马酮对普洱茶香气的贡献最大，其次为1,2,3-三甲氧基苯和(E,E)-2,4-壬二烯醛。马士成等[3]采用相对OAV计算和GC-O-质谱（mass spectrometry，MS）分析从六堡茶中共同确定了关键性香气成分。近年来，香气成分的富集回收方面研究逐渐受到重视，其中采用蒸馏法收集茶香水就是一种较为新颖的方法。夏云敏[4]采用沸水冲泡红茶后95 ℃水浸提2 min过滤冷却，再蒸馏（常压蒸馏和减压旋蒸）以完全蒸发完为终点收集茶香水，结果显示常压蒸馏法提取挥发性物质总量和数量较多，但得到的茶香水有焦熟味；减压旋蒸所得到的茶香水香气与原茶汤较接近，但其茶香水的香气较弱。

目前，有许多文献对普洱茶中关键性香气成分进行研究，但是对于普洱茶冲泡或者煮沸过程中关键性香气成分变化的研究较少。何理琴[5]和王彩楠[6]等分别采用正山小种和武夷岩茶通过沸水浸泡十几次，取每次浸泡的茶汤进行检测分析其香气释放规律，实验结果显示随着浸提次数的增加，正山小种香气成分数量和相对含量呈先增加后减少的趋势，武夷岩茶香气成分总含量则逐渐降低，可见不同种茶香气释放规律不同。此外，基质组分对于香气释放有影响，Esteban-Fernández等[7]研究结果表明，葡萄酒的基质组分对某些香气的口内释放有显著影响，在所有葡萄酒基质组分中，酚类化合物的影响最大。Guo Jing等[8]研究结果证明酚类化合物浓度的增加对大多数香气化合物的释放产生了影响。

本研究采用常压水中蒸馏方式从普洱熟茶中提取较高浓度挥发性化合物的茶香水，并通过GC-O、气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）联用技术、香气提取液稀释（aroma extract dilution analysis，AEDA）法和OAV等感官导向风味分析方法对普洱茶香水中关键香气化合物进行表征。最后，研究连续沸水浸提过程中关键香气化合物的释放规律。本研究将为普洱茶在煮沸过程中释放的关键香气物质及其释放规律分析提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

普洱熟茶（混合样）由云南天士力帝泊洱生物茶集团有限公司提供；NaCl（色谱纯）上海麦克林生化科技有限公司；1,2,3-三甲氧基苯（98.0%）北京百灵威科技有限公司；α-紫罗兰酮（92.0%）、芳樟醇（96.0%）、异佛尔酮（97.0%）、3,4-二甲氧基甲苯（99.0%）日本TCI公司；顺-茉莉酮（98.0%）、4-萜烯醇（98.0%）、橙花醇（98.0%）、香叶醇（99.0%）、苯甲醛（99.5%）、β-紫罗兰酮（97.0%）、1,2,4-三甲氧基苯（97.0%）、α-松油醇（98.0%）、苯乙醛（95.0%）、苯乙醇（99.5%）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二氢猕猴桃内酯（98.0%）、吲哚（99.0%）、香叶基丙酮（99.0%）、β-环柠檬醛（99.0%）、苯甲醇（99.0%）、氯化钠（优级纯）上海麦克林生化科技有限公司；苯乙酮（99.5%）天津市光复精细化工研究所；无水乙醇（色谱级）北京伊诺凯科技有限公司；C6～C30正构烷烃 美国Accu Standard公司。

1.2 仪器与设备

低温冷却循环泵 无锡沃信仪器制造有限公司；DZTW型调温加热套 天津天泰仪器有限公司；BCD-551WPCX型冰箱 合肥美菱股份有限公司；Trace1300-OPD2气相色谱仪、Trace1310 ISQLT GC-MS联用仪、自动进样器、超纯水机 美国Thermo公司；RTX-5MS石英毛细管色谱柱 美国Restek公司；固相微萃取手柄、75 µm CAR/PDMS固相微萃取萃取头 美国Supelco公司；ME204T型电子分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；SGH-300高纯氢发生器、SGK-2L低噪音空气泵 北京中科吉瑞科技有限公司；嗅辨分析仪 德国Gerstel公司；IT-09A5恒温磁力搅拌器 北京信而泰科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

将300 g普洱茶和2.5 L纯净水加入到5 L圆底烧瓶，采用调温加热套给圆底烧瓶加热，电加热温度为100 ℃。采用常压蒸馏方式，在圆底烧瓶的出口连接球形冷凝管，采用低温冷却循环泵连续给球形冷凝管循环充入0～2 ℃水。从圆底烧瓶中释放出的水蒸气及挥发性化合物混合物被球形冷凝管冷却后流入球形冷凝管末端的接收瓶中。一次性回收500 mL用于关键香气物质的鉴定实验。为了进一步研究普洱熟茶关键香气物质的热释放规律，在普洱茶的水煮提取过程中，以每次30 mL的体积连续回收水中蒸馏茶香水，直到感觉香气很淡，停止回收。所有回收的样品立即密封保存，保存在4 ℃冰箱，用于GC-O、GC-MS检测分析。

1.3.2 标准品溶液制备

香气化合物的定性和定量研究是衡量普洱茶风味不可或缺的重要手段。本实验采用外标法对重要香气活性成分（log4香气稀释因子（flavor dilution，FD）≥2）进行了定量分析。MS仪采用选择离子监测模式进行定量检测。以乙醇为溶剂溶解重要香气活性成分标准品，将标准品制备成7 种不同浓度梯度的混合标准品溶液。顶空瓶中加入混合标准品100 μL、去离子水0.9 mL、NaCl 0.4 g。采用HS-SPME的方法提取其中的挥发性化合物，经过GC-MS分析后建立标准曲线。配制C6～C30正构烷烃混标，溶于氯仿[9]，待测。

1.3.3 GC-MS条件

样品前处理：取1 mL茶香水样品、0.4 g NaCl加入20 mL顶空瓶中，HS-SPME程序使用Thermo自动进样器进行，样品在孵化炉中平衡10 min后，同萃取温度、萃取时间分别设置为61 ℃、60 min，使用75 µm CAR/PDMS[10]萃取头在孵化炉中经过萃取后，立即进GC-MS进样口解吸附5 min进行分析。

GC 条件：RT X-5 M S 石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样口温度250 ℃，载气为氦气（纯度≥99.999%），流速1.0 mL/min，升温程序参考徐咏全等[11]的研究。分流模式：分流比为30∶1。

MS条件：电子电离源；电离能量70 eV；离子源温度250 ℃；传输线温度250 ℃；质量扫描范围m/z35～450，溶剂延迟时间3 min。

1.3.4 GC-O条件

样品前处理：GC-O采用手动进样模式，取1 mL茶香水样品和0.4 g NaCl放入20mL顶空瓶，加入转子，立即密封顶空瓶，提前将磁力搅拌器上烧杯中的二级纯水加热至61 ℃，将装有样品的顶空瓶放入其中61 ℃水浴、转速400 r/min条件下平衡10 min，将手动SPME装置插入样品瓶中并推出萃取头（萃取头在使用之前在GC 250 ℃进样口处进行老化处理30 min），吸附60 min，然后将手动SPME装置插入GC进样口，250 ℃解吸附5 min，同时按下启动键开始检测。

色谱条件：色谱柱、进样口温度与GC-MS检测条件一致，氢火焰离子检测器温度250 ℃，载气（氮气，纯度≥99.99%）流速1.0 mL/min，氢气流速40 mL/min，空气流速400 mL/min；升温程序与GC-MS一致，不分流模式。

嗅闻仪条件：传输线温度230 ℃，色谱柱流出成分在毛细管末端以1∶1的分流模式分别进入检测器和嗅闻仪。

1.3.5 嗅闻分析

采用香气提取物稀释法分析普洱茶香水的气味和强度，将茶香水用二级纯水以4n倍稀释，采用HS-SPME方式萃取后，手动进样方式进GC-O进样口，由3 名经过闻香训练的普洱茶感官审评经验人员进行嗅闻，并做好记录（保留时间、香气强度和香气特征），对所闻到的香气成分进行描述（香型和香气强度），其中香气强度分为4 个级别，1～4 级香气强度逐渐升高。有2 名及以上嗅闻人员在相同保留时间处闻到相同类型的香气，且香气强度大于1，则将该保留时间的香气物质定为有效实验结果。每个稀释度每人重复3 次。

采用GC-O进行重要香气活性成分的筛选。根据测定FD值，选择log4FD≥2香气物质进行GC-MS定量分析[12]，计算OAV，将OAV＞1的成分确定为普洱茶香水中的关键性香气成分。OAV按式（1）计算：

式中：C i为待测样品中的香气物质的质量浓度/（mg/L）；OTi为该香气物质的气味阈值/（mg/L）。

1.4 数据处理

GC-MS分析所得的色谱图经过NIST谱库检索定性，用Excel 2016进行数据处理分析，采用Xcalibur软件进行谱图查看，并筛选出重要香气活性成分的定性定量离子（4 个），通过建立标准曲线进行定量分析，如果化合物没有标准品，则使用相似碳原子数、相同官能团的化合物标准品建立的标准曲线进行估算[13]。本研究无1,2,3,4-四甲氧基苯香气化合物标准品，故1,2,3,4-四甲氧基苯采用1,2,4-三甲氧基苯的标准曲线进行定量分析，用Excel 2016进行数据分析。Origin 2021作图，用TBtools软件进行热图分析[14]。每组实验重复3 次。

保留指数（retention index，RI）：C6～C30正构烷烃混标经GC-MS检测后，记录每个烷烃出峰的保留时间，按式（2）计算：

式中：n+1和n分别代表未知化合物流出前后正构烷烃碳原子数；tx为未知化合物的保留时间/min；tn和tn+1为相应正构烷烃的保留时间/min；tn＜tx＜tn+1。

2 结果与分析

2.1 普洱茶关键香气物质的筛选

大量研究证明普洱茶香气成分主要包括醛类、醇类、酮类、甲氧基苯类、烃类、酚类、酯类和含氮类等[15-20]，其中1,2,3-三甲氧基苯等甲氧基苯类化合物含量最高[15-16,21]。

如表1所示，将普洱茶茶香水用二纯水以4n倍稀释后进行GC-O嗅闻实验，筛选出FD在16以上（即log4FD≥2）的22 种香气物质，其中FD值高达1024的香气化合物有苯甲醛、芳樟醇、异佛尔酮、3,4-二甲氧基甲苯、1,2,3-三甲氧基苯、1,2,4-三甲氧基苯、β-紫罗兰酮7 种。

表1 普洱茶关键香气物质初步筛选结果Table 1 Results of preliminary screening of key aroma compounds in Pu-erh tea

2.2 普洱茶关键香气物质的确定

MS分析仪主要有全扫描模式和选择离子扫描模式两种扫描模式，全扫描模式扫描的质量范围覆盖被测化合物的分子离子和碎片离子的质量，质量扫描范围是检测前设定，通过MS分析仪连续扫描可以获得所有待测物质的全谱图，可通过NIST谱库检索出各挥发性化合物的CAS号、英文名称、匹配度、保留时间等化合物信息，一般用于未知化合物的定性分析；选择离子扫描模式仅跳跃式的扫描方法事先设定的质量，不能得到待测化合物的全谱图，不能进行谱库检索，但是可以排除其他物质的干扰，分析的灵敏度得到很大的提高，此方法用于少量已知化合物的检测分析[24]。

用香气物质标准品配制混合标准溶液，MS扫描模式采用选择离子扫描模式进行GC-MS检测分析，建立香气物质标准曲线（表2）。

表2 普洱茶香气化合物标准曲线Table 2 Standard curves for quantitation of aroma compounds in Pu-erh tea

根据表2的标准曲线计算FD值不小于16的22 种香气物质浓度，并根据浓度和香气阈值公式计算OAV，将OAV不小于1的香气化合物确定为普洱茶香水的关键香气物质，OAV计算结果见表3，FD值≥16的22 种香气物质OAV均大于1，故这22 种香气物质是普洱茶茶香水的关键性香气化合物。其中OAV不小于10000的关键香气化合物有：苯乙醛、芳樟醇、α-松油醇、香叶醇、α-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯7 种，其中芳樟醇和β-紫罗兰酮的FD值为1024，可见芳樟醇和β-紫罗兰酮2 种香气化合物是普洱茶茶香水中贡献最大的关键香气物质。

2.3 非线性拟合模型分析各类关键性香气化合物热释放规律

将普洱茶加到沸水中不断加热，沸水浸提回收冷凝水的方式连续分段接收水中蒸馏茶香水40 管，每管接收30 mL，经过GC-MS检测分析。采用非线性拟合模型[28]直观的呈现总体及各大类关键香气化合物变化趋势，以茶香水接收的离心管数为横坐标（x）及其相应关键香气物质总量为纵坐标（y）分析关键香气化合物热释放规律。

如图1所示，甲氧基苯类、醇类、酮类、其他类4 大类关键香气化合物总量和22 种关键香气化合物总量均能被指数函数ExpDec1模型成功拟合，虽然他们拟合模型相同，但是每类香气化合物的释放规律不同。关键香气化合物总量变化趋势符合ExpDec1模型（R2=0.98）变化，随着离心管接收的管数增加而缓慢减少，值得注意的是第1管中香气浓度较高，偏离模型拟合范围，说明普洱熟茶受热后最开始香气化合物释放速率最快；甲氧基苯类香气化合物与ExpDec1模型拟合度较高（R2=0.99），在前20 管时甲氧基苯类香气化合物保持着较高的释放量，20 管之后释放速率减慢，从纵坐标数值看，甲氧基苯类香气物质是所有香气物质中含量最高的一类香气物质，在每管中甲氧基苯类香气化合物含量占所有关键香气化合物总量的70%以上，可见甲氧基苯类香气物质是对普洱熟茶香气呈香贡献最大的一类化合物；醇类香气化合物与ExpDec1模型拟合度相比于其他几类化合物较低（R2=0.83），在前10 管中醇类香气物质释放速率呈断崖式下降，在第10管后释放速率较平缓，变化趋势近似于直线，这将导致在10 管后茶香水中醇类香气物质比例减少，香气组成发生了很大的改变，感官嗅闻发现第8管后陈味、霉味、不愉快气味加重；酮类香气化合物与ExpDec1模型拟合（R2=0.85）结果如图1所示，随着接收管数的增加，酮类香气化合物快速释放，第1管质量浓度为102.51 mg/L，第2管迅速降到70 mg/L以下，第11管之后释放量低于40 mg/L，29管以后每管的释放量已经不足10 mg/L；其他类香气化合物也成功与ExpDec1模型拟合（R2=0.89），变化趋势呈30°左右的倾斜角度直线下降的趋势，第1管中的含量较高，且也偏离拟合范围，在前10 管中每管其他类香气化合物质量浓度均在200 mg/L以上，第11管之后降到170 mg/L以下。但在第40管时其他类香气化合物质量浓度依然保持在110 mg/L以上，可见其在普洱熟茶中的稳定持久性，始终保持着较高的释放量，本研究中其他类香气化合物包括二氢猕猴桃内酯和吲哚两种，其中在这40 管茶香水样品中二氢猕猴桃内酯质量浓度为吲哚的38～71 倍，即其他类香气化合物主要为二氢猕猴桃内酯，二氢猕猴桃内酯呈现木香；醛类是产生甜味的关键化合物[29]，本研究中醛类香气化合物的热释放规律变化趋势较复杂，它的变化规律与其他几类香气化合物都不同，并没有随着释放量的增加而减少，其变化趋势无法与ExpDec1模型拟合，能与正弦函数（sin）成功拟合（R2=0.63），其变化趋势呈先增后减再增加的趋势。综上所述，普洱熟茶香气物质在第1管释放的量最多，而后释放量缓慢减少，由于各大类关键香气物质释放规律不同，释放速率存在差异，故普洱茶在连续沸水浸提过程中，关键香气物质受热释放时各香气成分含量比值发生较大变化，导致每一阶段茶香水感官嗅闻结果差异较大，呈现陈腐气味的甲氧基苯类香气物质含量缓慢减少，总含量一直稳居最高水平，而醇类、酮类和其他类香气物质释放速度过快，使得香气成分组成发生变化，这可能是茶香水接收后期呈现不愉快气味加重的主要原因。

图1 普洱熟茶关键香气化合物热释放规律非线性拟合图Fig.1 Non-linear fitting of the heat release pattern of key aroma compounds in Pu-erh ripe tea

2.4 热图聚类分析关键性香气化合物热释放规律

为更直观呈现出普洱熟茶各种关键香气物质热释放规律，采用聚类热图分析分段截流收取的40 管普洱熟茶茶香水中22 种关键香气化合物，对香气化合物的含量进行归一化，以减小含量之间的差异，然后再对化合物进行聚类分析，可以将变化趋势相同的化合物聚集在一起[30]。如图2所示，下方横坐标表示茶香水接收的离心管数，右侧纵坐标为22 种关键香气化合物名称，热图上方是对茶香水接收的离心管数进行聚类，左侧是对22 种关键香气化合物进行的聚类，方块颜色越红含量越高，颜色越蓝含量越低甚至为0（未检出），以22 种关键香气化合物浓度为评价指标，考察随着茶香水接收的管数的增加各种关键香气化合物含量变化情况。从图2可以看出，可将分段截流管数分为4 大类，第1、2管由于关键香气化合物含量极高而被分为一大类，可见在前60 mL的水蒸气释放量里总体关键香气化合物释放的速度最快；第3～16管含量仅次于前两管，被分为1 类；第17～31管组成1 类，1,2,3-三甲氧基苯、1,2,4-三甲氧基苯、1,2,3,4-四甲氧基苯等在普洱茶中含量最高的甲氧基苯类化合物含量逐渐减少；第32～40管分为1 类，在这一阶段，茶香水香气变淡，不愉快气味变强，绝大多数关键香气物质含量降到最弱。根据22 种关键香气化合物含量变化趋势对22 种关键香气化合物进行聚类，可以将它们分为两大类，第一大类为顺-茉莉酮、β-紫罗兰酮、香叶基丙酮、香叶醇、二氢猕猴桃内酯、异佛尔酮、3,4-二甲氧基甲苯、α-松油醇、苯乙酮、4-萜烯醇、橙花醇、α-紫罗兰酮12 种关键香气化合物，它们主要在第1～16管中含量均比较高，在第17～40管中含量较低或未检出；第二大类香气化合物为1,2,3-三甲氧基苯、1,2,4-三甲氧基苯、1,2,3,4-四甲氧基苯、苯甲醛、β-环柠檬醛、苯乙醇、吲哚、苯甲醇、苯乙醛、芳樟醇10 种关键香气化合物，它们在第1～40管中绝大多数方块颜色为红色，即含量普遍较高，总体释放速率较慢，有的甚至释放得越来越多，或者释放量虽然有在下降，但在茶香水接收后期才开始加速下降。并不是所有关键香气化合物在1～40管中均存在，它们的性质不稳定，也可能是由于加热过程中发生的美拉德反应、热降解等化学反应，因此，一些原本在茶叶中不存在或浓度很低的香气物质在达到一定水蒸气释放量后才释放出来[31]。而部分关键香气化合物则与之相反，在水蒸气释放量达到一定程度后部分香气化合物未检出。苯甲醇在第1管中含量为0（即未检出），第2管开始少量出现，之后含量呈逐渐增加的趋势；苯乙醛在第1～7管茶香水内未检出，第8管后含量呈现出上升趋势；吲哚在第1、2管中未检出，从第3管后被稳定检测到，而且其含量一直保持在一个稳定的数值范围内，故其热图色带只有红色和蓝色两种颜色；4-萜烯醇在第1管中的含量最高，然后急速下降，第1管到第2管下降幅度极高，第3～10管中含量很微弱，到第11管及其之后的茶香水中4-萜烯醇不再被检测出，可见4-萜烯醇在茶叶受热沸腾后能瞬间大量释放出来，并能在极短时间内释放完全；与4-萜烯醇具有相似的释放规律的化合物是α-紫罗兰酮，α-紫罗兰酮在第1管中具有最高释放量，但第2管急速下降，到第30管及其之后未检出；异佛尔酮在第1～25管中含量呈逐渐减少趋势，在第26管及之后不再被检测出。

图2 分段截流关键香气化合物含量热图聚类分析Fig.2 Heatmap cluster analysis of key aroma compound contents in sequential distillation fractions

3 结论

本实验以普洱熟茶为原料，采用水中蒸馏方式收取茶香水，将茶香水样品采用梯度稀释方式进行GC-O嗅闻实验，筛选出log4FD不小于2的22 种重要香气活性成分，使用香气化合物标准曲线，进行定量分析，计算OAV，将OAV大于1的22 种香气活性成分定为普洱茶关键性香气化合物。采用分段截流方式收取茶香水，接收40 管茶香水，每管接收30 mL，进行GC-MS定性定量分析。实验结果采用非线性拟合模型分析关键香气物质热释放规律，实验结果表明茶叶在连续保持煮沸条件下，香气化合物总浓度逐渐减少，甲氧基苯类、醇类、酮类、其他类等关键香气化合物含量也是随着水蒸气释放量的增加而呈现不同程度下降的趋势，醛类香气物质呈现出先增加后减少再增加的变化趋势；热图聚类分析将22 种关键香气化合物分为两大类，第1类主要在第1～16管中含量均比较高，在第17～40管中含量较低或未检出，第2类在第1～40管中绝大多数均比较高或者释放速率较慢。每种关键香气化合物在受热后释放的规律有不同程度的差异，1,2,3-三甲氧基苯等甲氧基苯类化合物在茶香水中含量一直保持最高，且随着水蒸气释放量的增加，它们的含量逐渐减少。有部分香气化合物在水蒸气释放量达到一定程度后才开始释放，有的则在茶香水接收到一定阶段后释放量接近于零或者不再检出。分段截留管数分为4 大类，第1类：第1、2管，含量极高；第2类：第3～16管，含量仅次于前两管；第3类：第17～31管；第4类：第32～40管，茶香水香气很淡。本实验研究了普洱熟茶在煮沸过程中释放的关键香气物质及其释放规律，有助于了解采用水中蒸馏方式富集回收高浓度的挥发性化合物混合物的回收量及其香气品质，为普洱熟茶香气化合物回收应用提供一定的理论基础。