酿酒酵母烟酰胺核苷激酶的异源表达及其酶学性质分析

何建菊，刘欣欣，史红玲，冉璐妮，王 贤，张英君，唐存多,,3,

（1.南阳师范学院生命科学与农业工程学院，河南 南阳 473061；2.赊店老酒股份有限公司博士后创新实践基地，河南 南阳 473300；3.河南农业大学食品科学技术学院，河南 郑州 450002）

烟酰胺单核苷酸（nicotinamide mononucleotide，NMN）是一种天然存在的活性核苷酸，有α、β两种异构体，其中β-NMN是辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）的活性形式[1]。NMN是细胞氧化还原NAD+的关键中间体[2]。NAD+在人体中发挥着至关重要的生物作用，主要包括参与生物氧化还原反应、维持细胞氧化还原稳态及参与信号传导过程[3]。有研究表明人体中NAD+含量会随着年龄的增长而慢慢减少[4-6]，NMN在体内需要转化成NAD+才有生理功能[5]。临床研究发现，通过调节生物体内NMN水平，对心脏和脑缺血、阿尔茨海默病、饮食和年龄引起的2型糖尿病和肥胖等有较好的治疗和修复作用[6-8]。近几年，NMN被誉为“不老神药”[9]，有实验表明，在小鼠模型中口服NMN会导致NAD+的回升，能抗衰老、延长寿命[10-11]。此外，通过烟酰胺核苷激酶（nicotinamide riboside kinase，NRK）途径增加NAD+含量能恢复抗病毒聚ADP核糖聚合酶功能，对SARS-CoV-2产生先天免疫[12]。

NAD+主要有3 种代谢合成路径：Preiss-Handler途径、从头合成途径和补救合成途径[13]。补救合成途径是以烟酰胺核糖（nicotinamide ribose，NR）为底物，在NRK的作用下磷酸化生成NMN。NMN合成最早使用的是化学合成法，由于使用的各种化学试剂对环境造成污染、产物分离困难，且存在手性异构体等问题，制约了NMN的大规模生产[2]。随着生物催化、酶工程技术的发展，NMN的生物合成成为热点。生物合成包括天然发酵法和酶促合成法，天然发酵法因为底物和产物都很容易被菌体自身消耗，产物很难大量积累，生产效率低下，不适于工业化生产[2]。酶促合成法是一种较为绿色环保的制备方法[14]，因为其没有有机溶剂的残留，也不存在手性问题等优点。

目前，生产NMN的生物催化法有两种，第1种是烟酰胺底物路线，第2种是NR底物路线[11]。烟酰胺底物路线是指以烟酰胺、ATP和核糖为底物，通过烟酰胺磷酸核糖转移酶、核糖磷酸焦磷酸激酶以及核糖激酶制得NMN的方法[15-16]。第2种方法是以NR和ATP为底物，只需NRK的催化即可生成NMN，这是一个单酶反应体系。反应速率快，底物转化率高，是目前比较热门的合成路线[17-19]。虽然NR价格昂贵，但是考虑到NMN的重要性，以及NMN在医疗和生物技术行业的广泛应用，在可接受的成本范围内高效制造NMN仍然具有重要的意义[20]。同时，开发高活性的NRK，降低酶的使用成本也是降低NMN生物合成成本的有效途径。

本研究从酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中克隆出NRK基因片段，再借助pET28a质粒在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中实现高水平的可溶性表达，并对其酶学特性进行分析。本研究有望为NRK进一步分子改造、表达宿主的优选及应用奠定坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试剂

NR、β-烟酰胺核苷酸标准品 麦克林化学试剂有限公司；甲醇（色谱纯）天津科密欧化学试剂有限公司；三磷酸腺苷溶液、磷酸二氢钠、氯化镁、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG）生工生物工程（上海）股份有限公司；rTaqDNA聚合酶、PrimeSTAR®HS DNA聚合酶、PrimeScript™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、DL 2000 DNA Marker、DNA连接试剂盒Ver.2.1 宝生物工程（大连）有限公司。

1.1.2 菌株、质粒与培养基

携带原核表达质粒的BL21（DE3）/pET28a、酿酒酵母菌株由本课题组保藏[21]。LB（Luria-Bertani）培养基用于大肠杆菌的培养，酵母浸出粉胨葡萄糖培养基用于酿酒酵母的培养。

1.2 仪器与设备

核酸电泳仪 北京市六一仪器厂；蛋白电泳仪美国Bio-Rad公司；EC 2006型高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）系统 大连依利特分析仪器有限公司；Hypersil C18柱 美国Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 重组大肠杆菌的构建

以Saccharomyces cerevisiae和Nicotinamide nucleoside kinase为关键词搜索，在NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中找到酿酒酵母NRK1（ScNRK1），对应的基因组序列（GenBank：AY611479.1）。为了去除模板核苷酸序列中的内含子，选择进行合成NRKcDNA的第1链，根据已报道的NRK1序列设计特异性引物NRK1-F：GGAATTCCATATGATGACTTCG AAAAAAGTGATA（含NdeI酶切位点）和NRK1-R：CCGCTCGAGCTAATCCTTACAAAGCTTTAG（含XhoI酶切位点），并委托苏州弘讯生物技术有限公司进行合成。

以酿酒酵母的总RNA为模板，用PrimeScript™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit进行cDNA第1链的合成，再利用NRK1-F和NRK1-R引物PCR扩增NRK的编码基因，利用限制性内切酶NdeI和XhoI对目的基因及pET28a质粒分别进行双酶切，然后连接转化进入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，经抗性筛选和测序鉴定获得BL21（DE3）/pET28a-ScNRK1重组菌。将上述重组菌连续在无抗LB培养基上传代10 次，然后接种至含卡那霉素的LB培养基上培养，观察它的生长情况，通过卡那霉素抗性筛选考察重组菌携带质粒的遗传稳定性[22]。

1.3.2 重组大肠杆菌的诱导表达及纯化

将BL21（DE3）/pET28a-ScNRK1重组大肠杆菌单菌落接种至5 mL含100 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min条件下振荡培养14 h，以2%接种量转接至100 mL新鲜LB液体培养基中，培养至OD600nm约为1.0，加入1 mol/L IPTG溶液至终浓度为0.1 mmol/L，16 ℃、200 r/min诱导培养20 h；将100 mL菌液于8000 r/min、4 ℃离心5 min，收集菌体，用20 mmol/L Tris-HCl菌体重悬后进行超声破碎，破碎后收集上清液，上清液通过平衡好的镍琼脂糖柱上进行纯化，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析[22-23]。

1.3.3 酶活力分析

NRK活力分析：以NR为底物，NMN生成量为标准计算酶活力。根据已报道的酶活力测定方法[23-24]略作修改。酶活力测定的反应体系为1 m L，包含20 mmol/L pH 7.6 Tris-HCl缓冲液、10 mmol/L MgCl2、2 mmol/L ATP、10 mmol/L NR，加入稀释适当倍数的100 μL酶液，40 ℃反应20 min，沸水中煮5 min终止反应，0.22 μm滤膜过滤反应液，用HPLC测定酶活力。HPLC条件：色谱柱为Thermo Hypersil C18柱，检测波长260 nm，柱温30 ℃，流动相为磷酸二氢钠缓冲液-甲醇（95∶5，V/V），流速1 mL/min，进样体积10 μL。在测定条件下每分钟生成1 μmol NMN所需的酶量定义为1 个酶活力单位（IU）。

1.3.4 NMN的定量分析

将NMN准品用超纯水分别配成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的溶液，然后分别取10 μL进行HPLC分析，获得各浓度NMN的峰面积后，进行线性拟合获得回归方程及相关系数，色谱条件和上述测酶活力方法相同，后面待检样品产物按照同样条件进行HPLC分析，根据测得的峰面积可以由回归方程计算出相应的样品浓度。

1.3.5 重组酶的温度特性

参照1.3.3节方法，分别在25～55 ℃（以5 ℃为间隔）下测定该重组酶的催化活性以获得该重组酶的最适反应温度。将重组酶分别在25～55 ℃（以5 ℃为间隔）下保温1 h，然后在最适反应温度下测定各自的残留酶活力，以冰浴保存1 h后酶活力为100%，以此考察各重组酶的温度稳定性[25]。

1.3.6 重组酶的pH值特性

参照1.3.3节方法，在最适反应温度下，分别在pH 3.4～7.0（以0.6为间隔）下测定重组酶的催化活性以获得重组酶的最适反应pH值。将重组酶分别在pH 3.4～7.0（以0.6为间隔）缓冲液中冰浴1 h，然后在各自最适反应温度和最适反应pH值下测定各自的残留酶活力，以未经处理值为100%，以此考察各重组酶的pH值稳定性[25]。

1.3.7 重组酶的最适Mg2+浓度

已有文献报道，NRK催化活性受Mg2+浓度的影响[26]。为考察Mg2+浓度对重组酶酶活力的影响，参照1.3.3节方法，在最适反应温度下，分别在MgCl2终浓度为0.1～0.4 mol/L（以0.05 mol/L为间隔）下测定重组酶的催化活性，以获得最适Mg2+浓度，以最适Mg2+浓度下酶活力为100%，以此检测重组酶的最适Mg2+浓度。

1.3.8 重组酶的动力学参数

重组NRK动力学参数的测定根据已报道方法稍加修改，以确定NR底物的特异性[27]，反应系统中ATP浓度为1 mmol/L。在最佳反应条件下，在0.1～0.35 mmol/L不同NR浓度下测定重组酶的催化活性。每次测定重复3 次。同样地，固定NR浓度为1 mmol/L，将ATP浓度设置为0.04～0.2 mmol/L，以测定重组酶的催化活性，每次测定执行3 次，依次考察对ATP的动力学参数。使用Michaelis-Menten方程计算未表现出底物抑制酶的表观动力学数据，或者当观察到底物抑制时使用以下方程：V=Vmax/（1+Km/S+S/Ki）[28]，所有计算均使用Origin 9.0软件。

1.3.9 NMN的生物合成

NMN反应进程：配制1 mL体系，包含50 mmol/L pH 5.8 Tris-HCl缓冲液、17.5 mmol/L MgCl2、3 mmol/L ATP、6 mmol/L NR，加入稀释适当倍数的100 μL酶液，在反应10、20、30、40、50、60 min时取样，终止反应，用0.22 μm滤膜过滤，进行HPLC分析，获得各反应时间下的NMN峰面积，计算NMN随反应时间变化的得率。

1.3.10 常用网站及软件

NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库和BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）：蛋白质、基因序列及蛋白质3-D结构的搜索；DNAMAN：用于基因序列及限制性酶切位点分析和测序结果分析；ProtParam（https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam）网站：预测蛋白质的理论理化性质；TMHMM-2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.phpTMHMM-2.0）：用于预测蛋白质的跨膜结构。

1.4 数据统计及图表绘制

图片均用Adobe Photoshop CS 8.0软件进行色阶、对比度调节及标注等处理。简单的数据处理及分析均借助Origin 9进行。

2 结果与分析

2.1 重组大肠杆菌的构建

目的基因PCR扩增产物的电泳图如图1A所示，在约750 bp处出现了明显的特异性条带，PCR产物的片段长度与预期的理论长度基本一致。潜在重组质粒双酶切的电泳检测如图1B所示，鉴定后送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序鉴定，获得ScNRK1的基因序列，并推测出其氨基酸序列。

图1 ScNRK1基因的PCR扩增（A）及pET28a-ScNRK1的双酶切验证（B）Fig.1 PCR amplification of ScNRK1 (A) and double-enzyme digestion of pET28a-ScNRK1 (B)

2.2 ScNRK1的序列分析

将上述推测出的ScNRK1氨基酸序列在ProtParam上进行理论理化性质的预测，结果表明ScNRK1的理论等电点为6.23，理论分子质量为27689.58 Da，不稳定指数II为25.59，是一个较稳定的蛋白，其在大肠杆菌和酵母体内的半衰期分别能达到10 h和20 h以上。利用TMHMM-2.0服务器预测蛋白跨膜结构的结果显示，ScNRK1的240 个氨基酸残基均为膜外残基，表明ScNRK1理论上较容易实现胞外分泌型表达。

2.3 重组大肠杆菌的诱导表达及鉴定

图2结果显示，BL21（DE3）/pET28a-ScNRK1上清液在约27 kDa处有明显的特异性条带，与ScNRK1的理论分子质量27689.58 Da基本一致，表明已成功实现了ScNRK1在大肠杆菌中的可溶性表达。经亲和纯化后产物在约27 kDa处出现了单一特异性条带，表明经过亲和层析，获得了电泳纯的重组ScNRK1，可以用于后续酶学特性的分析。酶活力测定结果表明，BL21（DE3）/pET28a-ScNRK1发酵液中NRK活力达14.75 U/mL，纯化后重组ScNRK1的比活力为2252.59 U/mg（表1），其表达水平和比活均显著高于已报道的水平[7]，具有较好的应用前景。

表1 不同来源NRK的比活力及动力学参数的比较Table 1 Comparison of specific activity and kinetic parameters of nicotinamide nucleoside kinases from different sources

图2 重组大肠菌表达产物的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of expression products in recombinant E.coli

2.4 NMN标准品的HPLC分析

将分析纯的NMN在ThermoHypersil C18柱上进行HPLC分析，在该分析条件下，NMN的保留时间约为2.79 min（图3A），底物标准品也进行HPLC分析，保留时间为4.02 min（图3B）。将NMN浓度（x/（mmol/L））对相应峰面积（y）进行线拟合，获得NMN标准曲线，回归方程为y=173.87x+101.32，R2=0.9935，结果表明在该HPLC分析条件及浓度范围下，NMN浓度与峰面积呈良好线性相关，因此，利用此法可以对NMN进行精确定量。

图3 NMN（A）、NR（B）标准品分析Fig.3 HPLC chromatograms of NMN (A) and NR (B) standards

2.5 温度对重组ScNRK1活力的影响

从图4可以看出，在20～30 ℃温度范围内，酶促反应速率随温度的升高而增大。当温度超过30 ℃时，反应速率降低，重组ScNRK1的最佳反应温度为30 ℃，这和之前文献报道的最适温度相同[30]。由图5可知，当孵育的温度超过40 ℃时，其残余酶活力显著下降，仅为50%左右，这在一定程度上也会限制它在NMN生物合成中的应用，在以后研究中可通过蛋白质工程和固定化技术对ScNRK1的热稳定性进行改造，以满足工业化生产的需求[20]。

图4 重组ScNRK1的最适反应温度Fig.4 Optimal temperature of recombinant ScNRK1

图5 重组ScNRK1的温度稳定性Fig.5 Temperature stability of recombinant ScNRK1

2.6 pH值对重组ScNRK1活力的影响

缓冲液pH值过高或过低可能会导致酶的空间结构发生变化，从而降低其催化活性[31]。从图6可以看出，重组ScNRK1是一种嗜酸性酶，其最适反应pH值为5.8。当pH值稍微偏离其最佳pH值时，其催化活性显著降低。因此，在使用过程中必须严格控制反应系统的pH值。从图7可以看出，重组ScNRK1对pH值的耐受性较好，在测定条件下，它的残余酶活力均大于90%。

图6 重组ScNRK1的最适pH值Fig.6 Optimal pH of recombinant ScNRK1

图7 重组ScNRK1的pH值稳定性Fig.7 pH stability of recombinant ScNRK1

2.7 重组ScNRK1的最适Mg2+浓度

从图8可以看出，重组ScNRK1的最佳Mg2+浓度为350 mmol/L，过低的Mg2+浓度不能充分发挥酶的催化活性，过高的Mg2+浓度对酶的催化活性也有一定的抑制作用。

图8 Mg2＋浓度对重组ScNRK1酶活力的影响Fig.8 Effect of Mg2+ concentration on the activity of recombinant ScNRK1

2.8 重组ScNRK1的动力学参数

重组ScNRK1对NR有很高的催化效率，其Kcat和Kcat/Km值分别为63.28 s-1和1.17 L/（mmol·s）。同样，其对ATP也表现出较高的催化效率，其Kcat和Kcat/Km值分别为92.96 s-1和1.71 L/（mmol·s），表明重组ScNRK1在NMN的酶法合成中具有重要潜力，对降低合成过程中酶的使用成本具有重要的意义。

2.9 NMN的生物合成

如图9所示，已有部分NR（4.01 min）转化成烟酰胺核苷酸（2.79 min）。6 mmol/L的NR用上述方法得到反应进程曲线，如图10所示，表明离理论得率仍有一定的差距[19]，在后续研究中仍需对反应条件进行系统的优化。但这种一步酶法反应节约了一定的反应时间[9,17]。

图9 NMN反应液相色谱图Fig.9 Liquid chromatogram of NMN reaction products

图10 NMN的反应进程Fig.10 Evolution of NMN yield during the reaction process

3 讨论

NMN是公认NAD+生物合成中间体的一种核苷酸[11]，是食品、化妆品、保健品的研究热点[9]。采用基因组挖矿技术，可以快速地将假定酶变为真实酶，为生物催化提供更多的选择[32]。

本研究从酿酒酵母中克隆出NRK基因片段，再借助pET28a质粒在大肠杆菌BL21中实现高水平的可溶性表达，酶活力测定结果表明，BL21（DE3）/pET28a-ScNRK1发酵液中NRK活力达14.75 U/mL，纯化后重组ScNRK1比活力为2252.59 U/mg，其表达水平和比活力均显著高于已报道的水平[7]。表明从酿酒酵母中挖掘的NRK有一定优势。温度特性结果表明，酿酒酵母来源NRK的最适温度为30 ℃，且稳定性差，这与之前的报道相同[30]，这都限制了NMN的工业化生产。接下来将对NRK进一步分子改造、表达宿主的优选。最后对底物NR进行催化生成NMN进行研究，虽然离理论得率仍有一定的差距[19]，但反应节约了反应时间，为更快生产NMN奠定了基础。