胃癌P2RX7表达状态与中医脾虚毒蕴证的相关性研究*

王小娟，邹 晨，戴小军,,3，刘延庆,3，张晓春，吴永健，王珊珊

（1.扬州大学临床中医学院，江苏 扬州 225009；2.扬州市中医院，江苏 扬州 225012；3.国家中医药管理局胃癌毒邪论治重点研究室，江苏 扬州 225009）

胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，较强的肿瘤异质性与较高的复发率、转移率是胃癌预后较差的重要原因[1]。中西医结合治疗胃癌是我国恶性肿瘤综合治疗的特色与优势，中医辨证论治能够有效改善患者的临床症状与预后。随着肿瘤分子生物学研究的不断深入，了解不同中医证型的分子病理特征有助于深化对胃癌中医理论的基础研究与抗肿瘤中药的精准选择[2]。P2RX7（Purinergic Receptor P2X, Ligand-Gated Ion Channel, 7）是一种跨膜受体蛋白，广泛分布于细胞膜表面。研究表明，P2RX7在实体癌和血液系统恶性肿瘤中具有广泛的生物学功能，能在肿瘤细胞的发育和扩散中发挥关键作用，为肿瘤发生和进展的重要介质[3-4]。

本研究采用免疫组化检测胃癌组织中P2RX7蛋白的表达状态，并结合患者的中医辨证分型，以及患者的年龄、性别、肿瘤家族史、Lauren分型和TNM分期等临床特征，分析P2RX7蛋白的表达及各临床因素与中医脾虚毒蕴证之间的相关性，旨在探讨胃癌脾虚毒蕴证的分子生物学基础。

1 资料与方法

1.1 研究对象 纳入2021年1—12月在扬州市中医院就诊的未经任何治疗的新发胃癌患者80例。所有患者均根据《胃癌诊疗规范（2018年版）》[5]中胃癌诊断标准进行诊断，以患者的胃镜或手术病理报告为明确诊断的依据。临床病理分期依据美国癌症联合会（AJCC）胃癌TNM分期第八版。本研究经过扬州市中医院伦理审查（编号：2021-26）。

1.2 中医辨证分型标准 根据《恶性肿瘤中医诊疗指南》[6]的诊断要点，并在课题组专家指导下拟定胃癌脾虚毒蕴证辨证标准。（1）主症：①纳呆食少；②胃脘疼痛；③腹胀；④口臭。（2）次症：①肢体倦怠乏力；②形体消瘦或浮肿；③面色晦暗无华；④便溏。（3）舌脉：舌淡胖或红或暗，苔黄或白腻，脉细数或弦滑。凡具备3项主症，或2项主症和2项次症，结合舌脉即可诊断为脾虚毒蕴证。非脾虚毒蕴证包括肝胃不和证、胃热阴虚证、气血亏虚证、脾胃虚寒证等。

1.3 纳入标准 （1）病理诊断为胃腺癌；（2）TNM分期明确；（3）发病年龄18～75岁；（4）KPS评分≥60分；（5）依从性较好，同意提供组织学样本，并签署知情同意书。

1.4 排除标准 （1）多重癌症患者；（2）合并有心肌梗死、脑梗死、严重肝肾功能不全等急慢性疾病的患者；（3）妊娠、哺乳期妇女；（4）精神病患者。

1.5 主要试剂与设备 山羊抗人P2RX7多克隆抗体（1∶100）（美国Abcam公司，批号：GR50237-25）；SP法免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，批号：17A07F21L0623）；DAB显色试剂（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：224020110）；苏木素染色液（北京索莱宝科技有限公司，批号：20211230）；免疫组化专用粘附载玻片（江苏世泰实验器材有限公司，批号：80312-3161）；自动脱水机（型号：TP1020）、石蜡包埋机（型号：EGHH50H）、切片机（型号：RM2235）均购自美国Thermo公司；电热鼓风恒温烤箱（上海医用恒温设备厂，型号：DGX-9143B-21）；电热恒温水浴箱[邦西仪器科技（上海）有限公司，型号：HH-2]；微波炉（美的集团股份有限公司，型号：MM823EE2-PS00000472）；正置荧光相差显微镜（日本Olympus公司，型号：ECLIPSE 801）。

1.6 免疫组织化学染色 胃癌病理标本来自于2021年1—12月在扬州市中医院就诊的未经任何治疗的80例新发胃癌患者。患者同意提供组织学样本，并签署知情同意书。胃癌组织离体后立即冲洗，修剪，固定，脱水，透明，浸蜡，包埋，连续切片厚度约4 μm，45 ℃水浴锅中展片，捞片。温箱60 ℃烤片2 h，脱蜡复水；滴加3%H2O2溶液覆盖组织，避光，室温中孵育10 min，PBS清洗；将组织浸入0.01 mmol/L枸橼酸缓冲液中高温煮沸6 min，PBS清洗；免疫组化标记笔固定组织范围，用兔血清封闭液覆盖组织，置于湿盒内于37 ℃孵育20～30 min，不洗；孵一抗，湿盒内4 ℃冰箱过夜；PBS清洗，孵二抗，湿盒置于37℃的恒温箱内孵育30 min；PBS清洗，滴加SABC（链霉亲和素-生物素复合物）覆盖组织，37 ℃，孵育30 min；PBS清洗，DAB显色，显微镜实时观察细胞状态以确定最终显色时间，用双蒸水充分清洗终止显色；用含乙醇的苏木精复染；脱水及透明；中性树脂封片；拍照。

1.7 结果判定 在光学显微镜下，根据切片肿瘤细胞染色强度计算分值；在Image J中分析阳性细胞比例计算分值。分值标准如下。（1）染色强度：无着色，计0分；淡黄色，计1分；棕黄色，计2分；黄褐色，计3分。（2）肿瘤细胞中阳性细胞比例：未染色，计0分；0%～≤10%，计1分；10%～≤50%，计2分；50%～≤75%，计3分；＞75%，计4分。评分=染色强度评分×阳性细胞百分率评分。评分范围为0～12分。结果判定标准：0～1分为阴性；2～3分为弱阳性；4～6分为中等阳性；＞6分为强阳性。0～3分为低表达；4～12分为高表达。

1.8 统计学方法 采用SPSS 24.0统计软件进行数据分析，计数资料采用χ2检验，采用Pearson分析系数进行相关性分析，采用Logistic回归进行脾虚毒蕴证的危险因素分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 胃癌患者的临床特征 脾虚毒蕴证胃癌患者肿瘤家族史、P2RX7表达、TNM分期与非脾虚毒蕴证胃癌患者比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；年龄、性别、肿瘤部位、Lauren分型比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（见表1）

表1 80 例胃癌患者的临床基本特征

单因素Logistic回归分析显示脾虚毒蕴证胃癌患者的肿瘤家族史（P=0.000）、P2RX7高表达（P=0.000）、TNM分期（P=0.000）与非脾虚毒蕴证胃癌患者比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；年龄（P=0.215）、性别（P=0.194）、肿瘤部位（P=0.109）、Lauren分型（P=0.695）比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。P2RX7蛋白高表达、肿瘤家族史和TNM分期均是影响胃癌脾虚毒蕴证的危险因素，而年龄、性别、肿瘤原发部位、Lauren分型不是危险因素。

2.2 胃癌组织中P2RX7表达分布特征 在40倍的光镜下观察，胃癌P2RX7蛋白定位于细胞膜和细胞质，免疫组织化学染色呈棕褐色。（见图1）80例胃癌患者中，P2RX7蛋白表达阴性者9例（11.25%），弱阳性表达24例（30.00%），阳性表达31例（38.75%），强阳性表达16例（20.00%）。本研究将P2RX7蛋白表达阴性和弱阳性者视为低表达，阳性表达和强阳性表达视为高表达。其中，低表达者33例，高表达者47例。

图1 P2RX7 蛋白在胃癌组织中的表达情况（免疫组化，×40）

2.3 P2RX7与胃癌脾虚毒蕴证的关系

2.3.1 脾虚毒蕴证患者P2RX7表达与非脾虚毒蕴证比较 胃癌脾虚毒蕴证患者的P2RX7蛋白表达水平显著高于胃癌非脾虚毒蕴证患者（P＜0.05）。（见表2）

2.3.2 胃癌脾虚毒蕴证与P2RX7表达的相关性 Pearson相关性分析显示P2RX7与胃癌脾虚毒蕴证具有一定的相关性（R2=0.253，P＜0.01）。将年龄、性别、肿瘤家族史、P2RX7蛋白表达水平、肿瘤部位、Lauren分型及TNM分期7个因素纳入多因素Logistic回归模型分析，进行变量筛选。P2RX7蛋白高表达和肿瘤家族史是胃癌患者脾虚毒蕴证的独立危险因素，而TNM分期中的Ⅲ、Ⅳ期比Ⅰ期更容易使胃癌患者发生脾虚毒蕴。（见表3）

表3 Logistic 回归分析参数估计值

3 讨 论

胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，其发病率位列全球恶性肿瘤发病率第五，相关死亡率位列第四[7]。国家肿瘤中心预测2022年我国将有50.9万人确诊胃癌，相关死亡人数预估有40万，发病率和死亡率在常见癌症中均排第三位[8]。尽管近些年来胃癌的发病率在下降，综合治疗策略在不断更新发展，但胃癌的预后仍然较差。

中医学中虽无胃癌病名的记载，但关于其证候描述、病因病机的记载却十分丰富。根据其临床表现，胃癌可归属于中医学中“噎膈”“胃反”“翻胃”“积聚”等范畴。阴虚痰凝毒结是晚期胃癌的核心病机，胃阴不足为疾病进展之根本，痰凝毒结、聚散流窜为标且贯穿其始终[9]。经过历代中医学家的不断丰富发展，目前多数研究者从“健脾益气”“清热解毒”“化痰散结”“化瘀解毒”等治法出发，在基础研究和临床研究中取得了丰富的成果[10-14]。在本研究的80例胃癌患者中，脾虚毒蕴证36例，占45.00%，显著高于其他证型，与多位医家的辨治思路存在一致之处[15-17]。

慢性炎症和免疫抑制是肿瘤微环境形成的核心特征，是激发肿瘤发生与发展的重要因素。韩钦芮等[18]通过梳理文献发现，脾虚患者存在慢性炎症，癌症患者在脾虚状态下存在免疫抑制反应。程海波等[19]认为肿瘤微环境中的炎症微环境可能是热毒的表现，而痰湿毒邪也与肿瘤微环境中黏附因子的表达密切相关；刘磊等[20]认为恶性肿瘤中的“痰毒”与肿瘤微环境中肿瘤相关成纤维细胞（cancer associated fibroblasts,CAFs）分泌多种因子的病理过程密切相关。此外，肿瘤患者的血液普遍存在高凝状态，与癌细胞特异性促血栓形成特性及宿主细胞炎症反应有关[21]。这可能是瘀毒内阻的表现。瘀毒内阻导致气血津液运行不畅，机体能量利用与代谢障碍，产生低氧微环境。低氧微环境会增加低氧诱导因子（HIF-1α）的分泌，进而诱导新生血管形成，有利于肿瘤细胞的生长与转移。研究显示，中药能够调节癌症患者的免疫功能，提升机体抗癌能力。中药对胃癌机体免疫的影响主要体现在降低Treg细胞的免疫抑制，提高CD4+、CD8+效应细胞表达，调节细胞因子及免疫球蛋白等方面[22]。BAROJA-MAZO A等[23]发现P2X7激活后，可抑制NK细胞的抗肿瘤效力。综上所述，脾虚毒蕴可能是肿瘤微环境形成的关键病机。有研究[24]表明调节肿瘤微环境的生化成分是癌症治疗的新前沿。在生理条件下，ATP在体内的浓度较低，不足以激活P2RX7。当恶性肿瘤发生时，肿瘤细胞会向细胞外基质中释放大量ATP，导致TME中ATP浓度升高，过度激活P2RX7。由于P2RX7在构成TME的不同细胞类型中广泛表达，P2RX7的过度激活会导致细胞膜上的离子通道开放，使Na+和Ca2+流入，K+流出，进一步激活参与细胞内信号转导通路的酶和激酶（如c-Jun、PKA、PKC、PLA、ATK、JNK、MAPK、ERK1/2和p38等），诱导炎症因子（如TNF-α、IL-10、IL1β、NALP3和Caspase-1/2等）的释放，最终促进肿瘤细胞的生长、增殖、迁移和侵袭[25]。目前P2RX7与肿瘤之间的内在联系已被广泛认识，其中胃癌的预后也与其相关[26-27]。

本研究中，P2RX7高表达47例，占58.75%（47/80），表明胃癌组织中P2RX7处于高表达状态。此外，本研究结果证明了脾虚毒蕴是胃癌最常见的病理因素，且发现P2RX7表达状态与脾虚毒蕴证相关。P2RX7高表达可能是胃癌脾虚毒蕴证的分子机制之一，P2RX7高表达和有肿瘤家族史是胃癌患者有脾虚毒蕴证的独立高风险因素，并且晚期胃癌更容易发展成脾虚毒蕴证。

综上所述，P2RX7可作为免疫组化的检测指标协助胃癌的临床诊断，并可作为胃癌脾虚毒蕴证的监测指标，有助于更好地协助胃癌的临床治疗。