基于分子对接技术与实验验证探究熟地锁阳方治疗特发性肺纤维化的疗效及其作用靶点*

张 宁，郭亚丽，彭艳茹，王玉光

（1.首都医科大学附属北京中医医院，北京 100010；2.北京中医药大学，北京 100029）

特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一类慢性、进行性加重的纤维化性间质性肺疾病，普通型间质性肺炎是其典型的组织病理学表现。IPF以慢性咳嗽、渐进性呼吸困难或活动后气喘等为主要临床表现[1]。IPF病因及发病机制未明，多种促炎及促纤维化因子参与本病的发生发展；其中持续性肌成纤维细胞表型可引起细胞外基质过度沉积和肺组织的异常修复，最终可导致肺组织瘢痕形成、肺泡结构扭曲和肺功能不可逆转的丧失[2]。相关报道显示[3]，在体检人群中IPF的检出率约为5.52%，而且男性的患病率高于女性。IPF目前仍缺乏有效的治疗药物，虽然抗纤维化药物吡非尼酮、尼达尼布可延缓疾病的进展，但不能改善患者咳嗽、喘息、疲乏等临床症状，同时存在一定的不良反应，如恶心呕吐等胃肠道症状、皮肤光过敏、肝功能异常等，使部分患者难以接受[4]。

从中医学来讲，IPF属于“肺痿”等范畴。多数医家认为本病的病机为本虚标实，其中肺肾亏虚是IPF的发病基础[5]。因本病的病位、病机及临床症状均与肾关系密切，故现代医家学者在治疗IPF时，强调从肾论治[6-7]。Mate分析结果显示，应用补肾法治疗间质性肺疾病可改善患者咳嗽、喘息等临床症状，未见严重不良反应，安全性可靠[8]。本课题组自拟熟地锁阳方治疗IPF，前期临床观察发现该方可改善患者咳嗽、疲乏无力等症状，但其作用机制尚不明确。中药复方具有多种有效成分，同时其成分也作用于诸多靶点，故其治疗疾病的作用机制十分复杂。应用计算机模拟的分子对接技术，可以从微观的分子角度阐释药物有效化合成分与疾病靶点的结合机制，从而有利于探究中药复方干预疾病的作用机制，而且在一定程度上缩短了研究周期，降低了研究费用[9-10]。故本研究拟采用分子对接技术结合网络药理学，将熟地锁阳方中有效化合物和疾病相关靶点进行模拟对接，并通过体内动物实验进行验证，从而对熟地锁阳方治疗IPF的疗效及其作用靶点进行探究。

1 材料与方法

1.1 有效化合物与靶点筛选及分子对接

1.1.1 熟地锁阳方中有效化合物的收集与筛选 应用TCMSP及BATMAN-TCM数据库收集熟地锁阳方的有效化合物。应用Cytoscape 3.8.0中的CytoNCA软件，通过Degree进行评分，由高到低排序后，选取Degree较高的有效化合物作为小分子配体，进行后续的分子对接。

1.1.2 “药物-疾病”潜在作用靶点的选取 应用TCMSP数据库及相关文献查找熟地锁阳方中化合物所作用的靶点。以“Idiopathic Pulmonary Fibrosis”为关键词，分别从GeneCards、PharmGkb、OMIM、DrugBank及TTD数据库对IPF潜在致病靶点基因进行搜索。各个数据库结果取并集，同时删除重复的靶基因。

将药物作用靶点与疾病作用靶点取交集后，导入STRING数据库，构建蛋白质-蛋白质互作（PPI）网络图。然后将PPI网络图相关信息导入Cytoscape 3.8.0软件，利用此软件中CytoNCA进行拓扑分析，从而对靶点进一步筛选，获得核心作用靶点。主要依据中间值（BC）、贴近度中心度（CC）、度中心度（DC）、特征向量中心度（EC）、局部平均连接基方法（LAC）和网络中心度（NC）来筛选核心靶点，这些值大于或等于中值[11]。结合所获得的核心作用靶点及相关文献，选取相关的靶点作为大分子受体，进行分子对接。

1.1.3 分子对接预测熟地锁阳方干预IPF的可能作用靶点 从PubChem数据库下载熟地锁阳方潜在活性成分的小分子配体2D结构，通过应用ChemOffice软件将其2D结构转化为3D结构。从PDB数据库下载核心靶点基因的大分子蛋白受体，Pymol软件去除蛋白结构中的水分子及小分子配体，并导入AutoDock－Tools进行加氢等预处理。应用Vina软件对受体和配体进行分子对接，分析其结合活性。

1.2 动物实验验证

1.2.1 实验动物 SPF级C57BL/6雄性小鼠30只，体质量22~23 g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0010。小鼠饲养于首都医科大学附属北京中医医院动物房，室温（24±2）℃，湿度40%～70%，12 h光照/12 h黑暗交替环境，摄食饮水自由。本研究的动物实验获得了首都医科大学附属北京中医医院实验动物伦理委员会的批准，动物伦理批号：BJTCM-M-2021-05-02。

1.2.2 药物与试剂 熟地锁阳方，方药组成：熟地黄30 g，锁阳20 g，山萸肉20 g，牛膝30 g，人参20 g，麦冬20 g，当归10 g，五味子10 g。熟地黄（批号：21040101）、锁阳（批号：20210204）、山萸肉（批号：21011101）、牛膝（批号：21031401）、人参（批号：20210912）、麦冬（批号：200409）、当归（批号：21082601）、五味子（批号：21051504）均购自首都医科大学附属北京中医医院中药房，并经首都医科大学附属北京中医医院王玉光教授鉴定为正品；上述中药饮片在煎煮之前用去离子水浸泡60 min，煎煮2次，将2次煎煮的药液合并，每剂中药浓缩至生药浓度约为2.4 g/mL。注射用盐酸博来霉素（批号：H20055883，规格：1.5万单位/支）购自浙江翰辉制药有限公司；4%多聚甲醛（批号：BL539A）购自北京兰杰柯科技有限公司；无水乙醇（批号：100092683）、二甲苯（批号：10023418）、中性树胶（批号：10004160）均购自国药集团化学试剂有限公司；PureLinkTMRNA Mini Kit试剂盒（批号：12183018A）购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；一步法荧光定量RT-PCR试剂盒（096A）（批号：PK0445）购自宝日医生物技术（北京）有限公司；小鼠GAPDH内参引物（批号：B661304-0001）及VEGFA、EGFR引物合成均来自生工生物工程（上海）股份有限公司；兔源Anti-α-SMA一抗（批号：19245T）购自美国Cell Signaling Technology；Anti-GAPDH一抗（批号：60004-1-1g）购自武汉Proteintech公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H+L）（批号：A0208g）购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2.3 主要仪器 JJ-12J型脱水机（武汉俊杰电子有限公司）；JB-P5型包埋机（武汉俊杰电子有限公司）；RM2016型病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；正置光学显微镜（日本尼康仪器有限公司）；Tissuelyser-24型全自动样品快速研磨仪（上海净信科技有限公司）；LightCycler 480 Ⅱ型荧光定量PCR仪（德国罗氏公司）；BIO-RAD Gel DocTM XR+型化学发光仪（美国Bio-Rad实验室有限公司）；Centrifuge 5424 R小型离心机（德国艾本德股份公司）；EMMS eSpira Forced Maneuvers型小鼠肺功能仪（英国EMMS公司）。

1.2.4 分组与造模 30只小鼠适应性喂养1周后，逐个称量体质量，按照随机数字表法分为对照组、模型组、熟地锁阳方组，每组10只。目前指南中公认的治疗IPF的药物为吡非尼酮、尼达尼布，既往研究中并未找到确切的证据证明上述两种药物对本研究所验证的靶点（VEGFA、EGFR）具有调控作用，故本研究并未设置阳性药物组。使用单次气管内滴注博来霉素的方法造模[12]，模型组和熟地锁阳方组小鼠单次气管内滴注博来霉素（5 IU/kg）至气管，对照组小鼠滴注等体积的生理盐水至气管。肺纤维化小鼠模型制备成功评判标准[12]：HE染色结果显示小鼠正常肺组织结构被破坏，炎症细胞渗出，肺泡间质增宽；Masson染色结果显示可见大量蓝色胶原纤维沉积。

1.2.5 实验给药 参考相关文献[13]，于模型制备成功后第8天开始给予熟地锁阳方干预。根据2001年版《药理实验方法学》[14]计算临床等效剂量为熟地锁阳方组小鼠的给药剂量，即熟地锁阳方组小鼠灌胃给予熟地锁阳方药液，0.24 g/10 g；对照组及模型组小鼠给予等体积的去离子水灌胃，1次/d，连续给药21 d。

1.2.6 观察指标

1.2.6.1 小鼠肺功能 给药结束后，小鼠行气管插管术，应用EMMS eSpira Forced Maneuvers有创肺功能仪，检测小鼠的用力肺活量（FVC）、吸气能力（IC）。

1.2.6.2 小鼠肺系数 收集小鼠的肺组织，用纱布擦拭干净，称重，计算肺系数。肺系数（Lung index）=肺湿质量/体质量（mg/g）。

1.2.6.3 组织病理学检测 将分离的新鲜左肺组织在4%多聚甲醛中固定48 h，常规石蜡包埋、切片（5 μm）、脱蜡，分别运用HE和Masson的三色试剂盒染色，在光学显微镜下观察肺组织的炎症与纤维化情况。

1.2.6.4 实时荧光定量PCR（quantitative real time PCR，qRT-PCR）检测VEGFA mRNA、EGFR mRNA相对表达量 称取小鼠右肺组织适量，加入1×磷酸盐平衡生理盐水PBS匀浆。然后根据PureLinkTMRNA Mini Kit试剂盒说明书提取总RNA。依据一步法荧光定量RT-PCR试剂盒（096A）中的说明书，配置相应的体系。在96孔板每孔中加入总RNA 2 μL，同时加入18 μL的反应体系，将96孔板放入荧光定量PCR仪中进行定量检测。PCR仪设置的条件为：45 ℃5 min，95 ℃10 s；95 ℃5 s，60 ℃20 s，40个循环。以小鼠GAPDH为内参，采用2-△△Ct法计算VEGFA mRNA、EGFR mRNA相对表达量。引物序列：VEGFA，上游引物TAGAGTACATCTTCAAGCCGTC，下游引物CTTTCTTTGGTCTGCATTCACA；EGFR，上游引物ACAGAAGGAGTAGATACGCTTG，下游引物GATTATTCGATGATGCTTCCCG。

1.2.6.5 Western blotting法检测α-SMA蛋白相对表达量 将混合蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液加入肺组织匀浆中，裂解以获得总蛋白；应用SDS-PAGE分离等量的蛋白质，转移到PVDF膜上；使用由TBST配制的5%脱脂奶粉室温封闭2 h后，在4 ℃条件下与兔源Anti-α-SMA（1∶1 000）、Anti-GAPDH（1∶5 000）一抗孵育过夜。与辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H+L）（1:1 000）二抗室温摇床孵育2 h后，将化学发光显色剂滴加于PVDF膜上，运用化学发光仪对免疫印迹进行可视化。GAPDH被用作负荷对照。所有值均根据GAPDH蛋白水平的条带强度进行标准化，同时应用ImageJ软件对条带进行半定量分析。

1.2.7 统计学方法 所有数据采用GraphPad Prism 8.0软件和SPSS 26.0软件进行统计分析及作图。计量资料以“均数±标准差”表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 熟地锁阳方中有效化合物筛选 通过TCMSP与BATMANTCM数据库收集熟地锁阳方的有效化合物，共获得115个有效化合物，然后根据Degree进行评分后，由高到低进行排序，选取Degree≥110的化合物作为小分子配体，共5个。（见表1）

表1 熟地锁阳方有效成分信息表（Degree≥110）

2.2 “药物-疾病”潜在作用靶点 共获得药物、疾病的潜在作用靶点分别为847、837个，得到163个“药物-疾病”潜在作用靶点。将“药物-疾病”潜在作用靶点运用Cytoscape 3.8.0软件中CytoNCA进行拓扑分析后，筛选得到的核心靶点为VEGFA、EGFR、MAPK1、TP53、AKTI、MAPK14、TNF、FOS、JUN。（见图1）

图1 核心作用靶点筛选

2.3 分子对接结果 为预测熟地锁阳方治疗IPF可能的潜在作用靶点，选取熟地锁阳方中Degree≥110的化合物作为小分子配体，包括十四烷酸（tetradecanoic acid）、9-十八烯酸（9-octadecenoic acid）、槲皮素（quercetin）、豆甾醇（stigmasterol）、山奈酚（kaempferol）。结合相关文献[15-17]，本研究选取VEGFA、EGFR为大分子受体，应用AutoDock_Vina进行分子对接，根据结合能结果，预测大分子受体与小分子配体的结合活性及对接是否良好。依据相关文献显示[18]：若结合能≤-7.0 kcal/mol则表示具有明显结合活性，若结合能＜-5.0 kcal/mol则表示结合活性较好，若结合能＜-4.0 kcal/mol则表示有一定的结合活性。本研究结果显示，VEGFA、EGFR与上述5种化合物均存在结合活性，≤5.0 kcal/mol者占总数70%，≤-7.0 kcal/mol者占总数60%，则表示绝大部分靶点和成分的结合活性较强。（见表2、图2）

图2 分子对接模拟图（部分）

表2 熟地锁阳方有效化合物与核心靶点分子对接结果

2.4 各组小鼠FVC、IC、肺系数及肺组织中α-SMA蛋白相对表达量比较 与对照组比较，模型组小鼠FVC、IC均明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，熟地锁阳方组小鼠FVC、IC均明显升高（P＜0.01），提示熟地锁阳方可明显改善肺纤维化小鼠的肺功能。与对照组比较，模型组小鼠肺系数及肺组织中α-SMA蛋白相对表达量均明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，熟地锁阳方组小鼠肺系数及肺组织中α-SMA蛋白相对表达量均明显降低（P＜0.01）。（见图3）

图3 各组小鼠FVC、IC、肺系数及肺组织中α-SMA 蛋白相对表达量比较

2.5 各组小鼠肺组织病理学改变情况 HE染色结果显示：对照组小鼠肺组织结构清晰、完整，未见炎症细胞浸润及结缔组织增生；模型组小鼠肺组织结构被破坏，肺泡融合塌陷、结构紊乱，肺泡腔内有不同程度炎症细胞浸润，肺泡间质增宽，同时也有不同程度炎症细胞渗出；与模型组比较，熟地锁阳方组小鼠肺组织上述病理变化均有不同程度的好转，肺泡融合塌陷较少，肺组织结构较完整，病变范围局限，炎性渗出物减少。（见图4）

图4 各组小鼠肺组织病理切片图 （×200）

Masson染色结果显示：对照组小鼠肺组织结构清晰、完整，未见明显的蓝色胶原纤维沉积；模型组小鼠肺组织结构被破坏，肺泡融合塌陷、结构紊乱，可见大量蓝色胶原纤维沉积；与模型组比较，熟地锁阳方组小鼠肺组织蓝色胶原纤维的沉积减少。（见图4）

2.6 各组小鼠肺组织中VEGFA mRNA、EGFR mRNA相对表达量比较 与对照组比较，模型组小鼠肺组织中VEGFA mRNA、EGFR mRNA相对表达量均明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，熟地锁阳方组小鼠肺组织中VEGFA mRNA、EGFR mRNA相对表达量均明显降低（P＜0.01）。（见图5）

图5 各组小鼠肺组织中VEGFA mRNA、EGFR mRNA相对表达量比较 （±s，n=6）

3 讨 论

IPF是一种慢性、进展性间质性肺疾病，其特征是纤维化组织在肺实质中进行性异常积聚[19]。虽然抗纤维化药物（吡非尼酮、尼达尼布）应用于临床使IPF的治疗取得了突破性进展，但因其费用较昂贵、部分患者不耐受等，需积极探索与开发新的治疗药物。本病因气虚而起，虽与肺、脾、肾等脏均相关，但其重点仍在于肾精亏虚，故其病机与肺肾亏虚、摄纳失司有关，治予熟地锁阳方。熟地锁阳方是由《景岳全书》中的贞元饮及《辨证录》中的定喘神奇丹加减而成。方中熟地黄、山萸肉滋肾阴，益精髓；锁阳以阳中求阴，以达补阴及益精血之目的；人参益肺肾之元气，与熟地黄合用，以阴中求阳，生精生血；麦冬甘寒养阴，入肺经，以养肺阴；牛膝既引血下行，又补其下元之气，以补益肾精；当归补血活血，使补而不滞，并防熟地黄之腻；五味子味酸收敛，甘温而润，能上敛肺气，下滋肾阴；全方温敛并用，补中有降，共奏补肾益肺、填精纳气、调补阴阳之功。

本研究预测结果显示，熟地锁阳方主要化合成分包括十四烷酸（tetradecanoic acid）、9-十八烯酸（9-octadecenoic acid）、槲皮素（quercetin）、豆甾醇（stigmasterol）、山奈酚（kaempferol）等。据相关研究报道[20]，单羟基十四烷酸异构体具有抗脲酶、抗磷酸酶和抗氧化活性，而IPF的发病机制包括氧化应激反应及TGF-β、PI3K/Akt等信号通路中相关靶点发生磷酸化使信号通路激活，促使上皮间质转化、细胞外基质沉积及成纤维细胞向肌成纤维细胞转化等，故十四烷酸可能是治疗IPF的一个潜在化合物[21]。BHAGAT M等[22]研究显示，雪松树皮挥发油中主要成分9-十八烯酸等化合物与NF-κB具有显著的结合亲和力，可使结肠癌细胞中NF-κB的表达水平降低。而NF-κB在IPF发病机制中发挥重要作用，NF-κB激活后可介导成纤维细胞向肌成纤维细胞转化。由此可知，9-十八烯酸可能会通过调控NF-κB表达而改善肺纤维化程度[23]。槲皮素是一种天然黄酮类化合物，具有抑制炎症反应、改善氧化与抗氧化系统功能、调控TGF-β1表达、调节成纤维化细胞凋亡与增殖等作用，是治疗IPF的一个重要化合物[24]。张兴彩等[25]研究发现，槲皮素可显著降低FN、α-SMA、Collagen I等肺纤维化相关蛋白的表达水平，通过调控S1P/SphK1信号通路而发挥其改善小鼠肺组织纤维化程度的作用。豆甾醇具有较强的表面活性与生理活性，其主要作用包括抗炎、抗氧化及抗肿瘤等[26]。山奈酚属于黄酮类化合物中的一种，具有抗氧化、抗炎及免疫调节等作用[27]。GONG J H等[28]研究显示，山奈酚可逆转E-钙黏蛋白的表达，降低N-钙黏蛋白及α-SMA表达水平，显著抑制TGF-β诱导的上皮间质转化过程，减少小鼠肺组织胶原沉积，减轻纤维化气道重塑。因此，筛选出的有效化合物很有可能是熟地锁阳方治疗IPF的关键化合物。

本研究共筛选得到VEGFA、EGFR、MAPK1、TP53等9个核心作用靶点。IPF的纤维化机制仍不明确，与异常修复、胶原纤维大量沉积和血管重塑发展相关[29]。多种信号通路参与IPF的发生发展，如TGFβ、PI3K/AKT及VEGF信号通路等[30-31]。VAGFA为血管内皮生长因子A，可影响肺泡Ⅱ型细胞生长、表面活性剂的产生及血管的生成，在肺损伤后修复过程中发挥重要作用[32]。相关报道[33]显示，IPF患者外周血中VEGFA表达水平与疾病的严重程度及进展相关。相关的基础研究[34]也证明，在BLM诱导的肺纤维化大鼠肺组织中VEGFA的表达水平显著升高。BARRATT S L等[35]研究显示，VEGFA可调节HIF-1α的表达，是肺纤维化的驱动因素。EGFR即表皮生长因子受体其参与肺纤维化的发生发展，可能是通过上皮细胞和成纤维细胞之间的EGFR通路依赖性旁分泌环发生的。EGFR可导致过度的胶原生成和沉积[36]。ISHII Y等[37]研究显示，抑制EGFR可缓解BLM诱导的小鼠肺纤维化程度。由此可知，VEGFA、EGFR在IPF的发生发展中发挥重要作用，可能是治疗IPF的靶点。

本研究结果显示，VEGFA、EGFR与所筛选的关键的5种化合物均存在结合活性，且绝大部分靶点和成分的结合活性较强。动物实验结果显示，熟地锁阳方可改善肺纤维化小鼠的肺功能，降低肺组织的炎症细胞浸润、改善肺结构及减少胶原纤维的沉积，降低肺系数，并可明显降低肺组织中α-SMA蛋白相对表达量及VEGFA mRNA、EGFR mRNA相对表达量。本研究表明熟地锁阳方对IPF具有治疗作用，VEGFA、EGFR可能是熟地锁阳方干预IPF的重要作用机制与关键靶点。本研究为临床应用熟地锁阳方治疗IPF提供了理论基础，同时也为后续的基础实验提供了一定方向，但其具体的作用机制仍需进一步的实验深入验证。