清热养阴除湿汤对Ⅱ型胶原诱导性关节炎大鼠炎症因子的调节作用*

张阳利，张 净，王 北，刘密凤

（首都医科大学附属北京中医医院，北京 100010）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性自身免疫性疾病，其主要特征为广泛的滑膜炎导致的关节破坏，伴有关节外器官受累。本病全球患病率为0.5%～1.0%[1]。我国RA患病率为0.32%～0.38%[2]，是造成我国劳动力丧失的主要疾病之一。RA治疗药物除改善病情的抗风湿药物（DMARDs）外，还包括非甾体抗炎药（NSAIDs）、糖皮质激素（GCs）、生物免疫抑制剂及靶向小分子制剂等。这些药物在临床实践中又有其各自的局限性[3-5]。中医药治疗RA具有丰富的经验和策略，加之中医药具有多成分、多靶点、多途径的作用特点，使其广泛应用于临床。北京中医医院风湿科国家级老专家王为兰教授认为RA多因风、寒、湿邪内侵或内生湿邪，久蕴不解，化热伤阴，灼津酿毒，热毒湿浊瘀滞，痹阻经隧，致成痹热[6]。其据此创立清热养阴除湿汤（Qingre Yangyin Chushi Decoction，QYCD），该方由半枝莲、虎杖、金银花、连翘等药组成，临床疗效确切。本研究以Ⅱ型胶原诱导性关节炎模型大鼠（collagen-induced arthritis，CIA）为研究对象，探讨清热养阴除湿汤对CIA模型大鼠关节损伤的保护作用及其机制。

1 材料与仪器

1.1 实验动物 40只健康SPF级Wistar大鼠，雌雄各半，6～8周龄，购自北京维通利华实验动物有限公司。动物生产许可证编号：SCXK（京）2018-0006。SPF级动物房饲养，环境温度22～26℃，湿度48%～52%，12 h光照周期，实验期间自由摄食，适应性喂养1周后开始实验。动物实验方案符合本院动物福利伦理委员会要求。所有动物实验均按照中华人民共和国卫生部出版的《动物护理和使用指南》（1998年1月）进行。

1.2 药物与试剂 QYCD组方中所有饮片均购自北京杏林药业有限责任公司，其中白花蛇舌草（批号：19060202）、金银花（批号：19022102）、连翘（批号：18111203）、半枝莲（批号：19070802）、虎杖（批号：19062201）、生地黄（批号：19070601）、白鲜皮（批号：19030101）、桂枝（批号：19051606）、忍冬藤（批号：19022503）、牡丹皮（批号：19050201）由北京杏林药业有限责任公司检验；制川乌（批号：XE8011）由北京华邈药业有限公司检验；土茯苓（批号：1805023）由北京太洋树康中药饮片厂检验。以上药材均符合2020年版《中华人民共和国药典》规定标准。中药汤剂由本院中药房制剂室提供，以中药煎煮机统一制成。甲氨蝶呤（MTX）（上海上药信谊药厂有限公司，批号：H31020644）；牛Ⅱ型胶原（批号：20022）、弗氏不完全佐剂（批号：7002）均购自美国Chondrex.Inc；TGF-β ELISA检测试剂盒（批号：DG20110D）、IFN-γ ELISA检测试剂盒（批号：DG20066D）、IL-4 ELISA检测试剂盒（批号：DG94488Q）和IL-17 ELISA检测试剂盒（批号：DG94480Q）均购自北京冬歌博业生物科技有限公司；TRNzol总RNA提取试剂（批号：DP405-02）购自天根生化科技北京有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Erase（r批号：RR047B）、SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）ROX plus（批号：RR82LR）和DL2000 DNA Marker（批号：3427Q）均购自宝日医生物技术（北京）有限公司；PCR引物由美国英杰生命技术有限（Invitrogen）公司合成。

1.3 主要仪器 FS-1/DQ-3型匀浆机（金坛区西城基铭实验仪器厂）；ME204T型梅特勒托勒多电子天平（Merrler Toledo上海有限公司）；Centrifuge 5415D型高速台式冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；88400V Thermo型超低温保存冰箱（日本SANYO公司）；Rayto RT-6100型酶标分析仪（美国Rayto公司）；SKYSCAN 1276型micro-CT检测仪（德国Bruker公司）；NANODROP 2000型分光光度计（Therno scientific公司）；ABI7500型荧光定量PCR检测仪（Applied Biosystems公司）；IM-15型制冰机（常熟市雪科电器有限公司）。

2 方 法

2.1 大鼠胶原诱导性关节炎（CIA）模型的建立和评估 参照文献[7]建立大鼠CIA模型。将等体积的牛Ⅱ型胶原溶液和不完全弗氏佐剂充分混匀制备成浓度为1 mg/mL的乳剂，备用。每只大鼠尾部皮下注射0.2 mL乳剂进行初次免疫，7 d后再次注射0.1 mL乳剂加强免疫。正常对照组大鼠注射等量生理盐水。大鼠致敏后第7天开始，每周进行1次关节炎指数评价。按5级评分方法[7]计算关节炎评分。0分：正常；1分：小趾红肿；2分：趾关节和足跖肿胀；3分：踝关节以下足爪肿胀；4分：包括踝关节在内的全部足爪肿胀。将各个关节的积分累计得出每只大鼠的关节炎指数。关节炎指数越高，说明关节炎病变程度越重。首次免疫后第14天，关节炎评分≥4分的大鼠视为造模成功。

2.2 动物分组及干预 将24只造模成功的大鼠采用随机数字表法分为模型组（CIA组）、甲氨蝶呤组（MTX组）、清热养阴除湿汤高剂量组（QYCD-H组）、清热养阴除湿汤低剂量组（QYCD-L组），每组6只。另随机取6只未造模大鼠作为正常对照组（Control组）。参照文献[8]，大鼠与人换算系数为6.17，以成人体质量约为60 kg计算大鼠临床等效剂量。Control组和CIA组大鼠分别给予等量生理盐水；QYCD-L组、QYCD-H组剂量分别为临床等效剂量（17 g/kg）和2倍临床等效剂量（34 g/kg）。MTX组为临床等效剂量（0.625 mg/kg）。除MTX组大鼠每周给药2次外，其余各组大鼠每天给药1次。所有大鼠均灌胃给药，给药体积为10 mL/kg。每周观察大鼠的生存状态并记录体质量。药物干预5周后用1%戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉取血，3 000 r/min离心15 min收集血清，-80 ℃保存待测。取血后处死大鼠，剪取大鼠后肢踝、趾关节，置于中性福尔马林固定，用于制作病理切片。另一侧踝关节及后爪用于骨微观结构变化的检测。

2.3 观察指标

2.3.1 足跖肿胀度检测 大鼠致敏后第7、14、21、28、35、42、49天，使用足跖容积测量仪检测大鼠右后足跖容积并记录。

2.3.2 关节炎评分 大鼠致敏后第7、14、21、28、35、42、49天按照“2.1”中按5级评分方法[7]计算各组大鼠关节炎评分。

2.3.3 关节病理组织学分析 将后肢固定在4%甲醛液，并在10%乙二胺四乙酸（EDTA）中脱钙4周，进行乙醇梯度脱水（70%、80%、90%、95%、100%Ⅰ液及100%Ⅱ液）。二甲苯透明，石蜡包埋。制备成5 μm厚的石蜡切片，二甲苯脱蜡，乙醇梯度（从高到低）脱水，苏木精和伊红法（hematoxylin-eosin staining,HE）染色。显微镜下观察大鼠踝关节组织病理形态学改变，并对滑膜炎症、关节软骨侵蚀和软骨下骨侵蚀程度进行半定量评分[9]。（1）滑膜炎症分级评分。0分：正常滑膜，1～2层滑膜细胞，无炎症细胞浸润；1分：3～5层滑膜细胞，轻度炎症细胞浸润，细胞密度低；2分：多层滑膜细胞，中度炎症细胞浸润，细胞密度增高；3分：全关节腔重度炎症细胞浸润，滑膜增生，细胞密度高。（2）软骨侵蚀评分。0级：正常软骨，关节软骨表面光滑；1分：浅表非钙化软骨层轻微变粗糙或轻度缺失，约占软骨面积的1/3；2分：中等程度的浅表非钙质软骨损失，约占软骨面积的2/3；3分：浅表非钙化软骨完全丧失，椎管延伸至下面的钙化软骨层。（3）骨侵蚀评分。0分：正常完整骨表面；1分：皮质骨表面小的局灶性骨病变；2分：局灶性、软骨下骨侵蚀增强，皮质骨部分或完全穿透，皮质骨可能有少量突破至骨髓腔；3分：骨组织大面积扩展延伸性侵蚀，滑膜血管翳侵入导致皮质骨完全突破到骨髓腔，骨结构丧失。

2.3.4 关节形态计量学指标 固定大鼠后肢，采用微计算机断层扫描技术（Micro computed tomography，Micro-CT）检测关节形态计量学指标。将踝关节置于Micro-CT的测试管内，沿标本长轴进行扫描，以获取连续的图像。Siemens Inveon Micro-CT扫描参数：图像矩阵为4 096×4 096，层间距为28.6 μm，源电压为70 kV，电流为400 μA，扫描时间为432 s，360°范围内旋转扫描。Micro-CT扫描结束后进行重建，进行阈值分割获取大鼠骨骼三维图像并保存，使用Micro-CT自带的软件进行定量分析，分析骨体积（bone volume, BV）、骨表面积和骨体积的比值（bone surface/bone volume, BS/BV）、骨密度（bone mineral density, BMD）和骨小梁厚度（trabecular thickness,Tb.Th）等骨损伤程度及骨形态参数。

2.3.5 血清炎症细胞因子 使用酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒分析外周血中IL-4、IL-17A、TGF-β、IFN-γ表达。按照试剂盒说明书进行操作，酶标仪检测450 nm处吸光度值，然后参考标准曲线计算血清浓度。IL-4、IL-17、TGF-β和IFN-γ的最高检测浓度分别为120、48、240、2 000 pg/mL。

2.3.6 脾脏组织T-bet mRNA、Gata-3 mRNA、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA表达 Trizol法提取脾脏细胞总RNA，NanoDropRND-2000测定RNA浓度和纯度。采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser进行cDNA反转录；TakaRa SYBR Premix EX TaqTMⅡ试剂盒检测组织相关基因表达量。上述实验操作均按产品说明书要求进行。以总RNA为模板合成cDNA，进行PCR反应。扩增条件：95 ℃，30 s；40个PCR循环（95 ℃，5 s；60 ℃，40 s）。为建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按（95 ℃，10 s；60 ℃，60 s；95 ℃，15 s），并从60 ℃缓慢加热到99 ℃。各样品的目的基因和内参分别进行Realtime PCR反应，每个样本检测3个复孔。数据采用2-△△Ct法计算各mRNA相对表达量。

表1 引物序列

2.4 统计学方法 采用SPSS 23.0统计软件进行分析，计量资料符合正态分布且方差齐，以“均数±标准差”（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Bonferroni法或Tamhane法进行分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 各组大鼠踝关节病理改变比较 关节症状一般自后足首发，逐渐蔓延至前足，症状呈进行性加重，在初次免疫后7 d左右出现双足明显肿胀。初次免疫后3～5周出现肿胀高峰，逐渐出现关节强直、畸形以至功能障碍，提示有慢性、对称性、多发性关节炎发生。Control组大鼠关节结构正常，滑膜组织无充血水肿，衬覆1～2层滑膜细胞，无炎症细胞浸润，无血管扩张充血，无血管翳，关节软骨表面光滑平整。CIA组大鼠可见不同程度的滑膜细胞增生，并可见炎症细胞浸润；增生的滑膜组织形成绒毛状，向软骨面爬行形成血管翳。MTX、QYCD-L、QYCD-H治疗对骨质侵蚀和血管翳的形成有明显抑制作用，明显改善炎症、滑膜细胞增殖和细胞浸润，对踝关节病理具有明显的改善作用。（见图1）致炎3周后，CIA组大鼠右后足关节肿胀程度高于Control组，差异有统计学意义（P＜0.05）；MTX、QYCD-L、QYCD-H治疗可以缓解大鼠足关节的肿胀程度（P＜0.05）。CIA组在致炎后5周关节炎评分最高（P＜0.05），MTX组、QYCD-L组、QYCD-H组致炎后4周关节炎评分最高，并于4周后其肿胀程度有所缓解，其中MTX效果最好（P＜0.05）。CIA组大鼠HE评分明显高于Control组（P＜0.01）；MTX组、QYCD-L组、QYCD-H组大鼠HE评分均低于CIA组（P＜0.05或P＜0.01），表明MTX、QYCD-L、QYCD-H治疗对减缓踝关节病理改变具有一定的积极作用。（见图2）

图1 大鼠踝关节典型病理切片 （HE 染色）

图2 各组爪体积、关节炎评分、HE 评分比较 （±s）

3.2 各组大鼠显微CT指标BV、BS/BV、BMD、Tb.Th比较 Control组大鼠关节表面光滑没有骨侵蚀现象。CIA组大鼠出现了严重的软骨和骨质破坏，关节表面不光滑，具有严重的骨侵蚀现象。MTX具有很好的保护作用，MTX组大鼠关节破坏程度最轻。QYCD具有一定的保护作用，QYCD-L组、QYCD-H组大鼠的骨破坏程度在一定程度上被缓解，关节较为完整，只有轻微的骨质缺失。表明QYCD对CIA模型大鼠关节损伤具有一定的保护作用。（见图3）

图3 大鼠右爪显微CT 检查代表性图像

CIA组大鼠BV和BS/BV值均明显高于Control组（P＜0.01），BMD和Tb.Th值均明显低于Control组（P＜0.01）。MTX组、QYCD-L组、QYCD-H组大鼠BV值均显著低于CIA组（P＜0.01），BMD值显著高于CIA组（P＜0.05或P＜0.01）。（见图4）

图4 各组大鼠显微CT 指标BV、BS/BV、BMD、Tb.Th 比较 （±s）

3.3 各组大鼠血清细胞因子IL-4、IL-17A、TGF-β、IFN-γ水平比较 CIA组大鼠血清促炎因子IL-17A、IFN-γ的水平均高于Control组（P＜0.01），血清抗炎因子IL-4、TGF-β的水平均低于Control组（P＜0.01）；MTX组、QYCD-L组、QYCD-H组大鼠血清IL-17A水平均低于CIA组（P＜0.01），MTX组和QYCD-H组大鼠血清IFN-γ水平均低于CIA组（P＜0.05或P＜0.01）；MTX组、QYCD-L组、QYCD-H组大鼠血清IL-4、TGF-β水平均高于CIA组（P＜0.01）。表明MTX、QYCD均可以抑制炎症，且以MTX对炎症反应的抑制作用最强。（见图5）

图5 各组大鼠血清IL-4、IL-17A、TGF-β、IFN-γ 水平比较 （±s）

3.4 各组大鼠脾脏组织T-bet mRNA、Gata-3 mRNA、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA表达比较 CIA组大鼠脾脏T-bet mRNA、GATA-3 mRNA、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA相对表达量均显著低于Control组（P＜0.01）；MTX组大鼠脾脏上述4项指标表达水平均显著高于CIA组（P＜0.01）；QYCD-L组、QYCD-H组大鼠脾脏T-bet mRNA、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA 相对表达量均高于CIA组（P＜0.05或P＜0.01）；QYCD-L组、QYCD-H组大鼠脾脏Gata-3 mRNA相对表达量与CIA组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见图6）

图6 各组大鼠脾脏细胞特异性转录因子Gata-3 mRNA、T-bet mRNA、Foxp3 mRNA 和RORγt mRNA 表达水平比较 （±s）

4 讨 论

中医学认为RA属于“痹证”范畴，其病因多为气血亏虚，风、寒、湿、热之邪外袭，痰瘀互结，痹阻经络。如《素问·痹论篇》所言：“风寒湿三气杂至，合而为痹也。”[10]其病因主要为风、寒、湿三邪所致。《素问·刺法论篇》指出：“正气存内，邪不可干”[11]。《素问·评热病论篇》指出：“邪之所凑，其气必虚。”[11]又如《济生方·诸痹门》[12]曰：“皆因体虚腠理空疏，受风寒湿气而成痹也。”指出正虚是该病发病的内因。QYCD中白花蛇舌草、半枝莲、虎杖、银花、连翘为君药，既可清热解毒于内，又可透邪达表于外，兼有消肿止痛之功效。土茯苓、白鲜皮、生地黄、熟地黄、白芍为臣药。其中土茯苓、白鲜皮二药合用祛内毒解外邪，可起到清热解毒除湿之功效。热邪内郁久必伤阴，故以生地黄、熟地黄、白芍养阴血补肾精。桂枝、川乌为佐药。二药性辛温通以防苦寒太过，且温经通络止痛。忍冬藤为使药，清热解毒，疏通经络。全方共奏清热解毒、通络止痛之功效[13]。

RA是一种以周围关节病变为主的多系统炎症性自身免疫疾病，其中Th细胞亚群失衡及相关细胞因子网络和“瀑布效应”异常是其发病的重要机制[14-15]。衰老的CD4+T细胞聚集是RA的一个重要标志[16]。幼稚的CD4+T细胞在不同的刺激模式、抗原浓度和细胞因子环境下分化为不同的细胞亚群[17]。Th1/Th2和Th17/Treg细胞亚群的失衡在RA的发病和进展中起重要作用，与RA疾病活动和骨侵蚀有关，且相关细胞因子水平的变化可能是其主要原因[18]。Th1/Th2细胞的平衡被认为是由其特异性转录因子T-bet/GATA-3的表达比例决定的，对于诱导自身免疫和过敏性免疫反应具有重要作用[19]。Th1/Th2细胞失衡可诱导自身免疫疾病，包括RA、糖尿病及克罗恩病等。随着认识的深入，Th1/Th2失衡已无法解释RA的部分病变[20-21]，提示RA疾病进展中可能还存在着其他重要的机制。相关研究也由Th1/Th2模式逐渐转变为Th1/Th2/Th17/Treg假说，即来自同一Th前体细胞的多谱系分化模式[22-23]。Thl7/Treg失衡及其相关细胞因子的异常表达与包括RA在内的多种自身免疫性疾病的发病及病理损伤密切相关。IL-17是Th17细胞分泌的主要细胞因子，可诱导滑膜细胞产生金属蛋白酶，抑制软骨基质形成，促进滑膜血管翳形成，加重关节破坏[24-26]。此外，IL-17还可以刺激患者滑膜细胞产生GM-CSF和PGE2[27]，上调IL-6[28-29]、IL-1β、TNF-α[28]等局部炎症介质协同作用[30]，并诱导核因子κB受体活化剂配体（receptor activator of the nuclear factor kappa B ligand, RANKL）的表达，在破骨细胞形成和骨溶解吸收中充当着重要角色[25]。研究发现Treg细胞表面高表达抑制性辅助因子细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTAL-4），可抑制效应细胞功能，并分泌IL-10、TGF-β、IL-2等抑制性细胞因子，从而发挥免疫抑制作用[31-34]。Treg细胞已成为RA发病机制新模式中的核心成员之一，且这一模式强调了Treg和Th17之间的平衡[35-37]。

本研究结果表明，给予QYCD-L、QYCD-H处理均可降低CIA大鼠血清促炎因子IFN-γ和IL-17A水平，提高抗炎因子IL-4和TGF-β水平。对炎症细胞因子的调节可能成为RA治疗的重要靶点。QYCD治疗RA的可能机制之一是通过调节炎症细胞因子对RA发挥保护作用。QYCD-L、QYCD-H处理对CIA大鼠脾脏T-bet mRNA、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA表达下降均有不同程度的缓解，但对RA患者Foxp3/RORγt比值变化无明显影响，与TADA Y等[38]报道的药物治疗与其比值变化无明确相关性相一致。代谢组学研究[39]显示，QYCD对L-苹果酸、抗坏血酸、L-丝氨酸3种差异代谢物及紊乱的甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路均有回调趋势，提示其可能通过调节异常的能量代谢过程和抗氧化应激来减轻炎症反应。

综上所述，清热养阴除湿汤能有效改善CIA大鼠关节炎症状，调节炎症细胞因子IFN-γ、IL-17A、IL-4和TGF-β水平及转录因子T-bet mRNA、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA表达。更多作用机制有待进一步的深入研究。