新疆昌吉市2 型猪链球菌的分离鉴定及耐药性分析

陈 旺，王 元，刘英玉*，刘俊飞，王雅雯，田亚琴，宋超慧

（ 1. 新疆农业大学动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 830052 ； 2. 昌吉天康畜牧有限公司，新疆 昌吉 831100 ）

猪链球菌病是由猪链球菌（Streptococcus suis）引起的一种细菌性传染病，通常引发猪的肺炎和败血症等疾病，是由C、D、E 及L 群链球菌引起的一种多型性猪传染病的总称，临床表现分为关节肿大、淋巴结肿胀、脑膜脑炎及败血症等多种类型[1-3]。猪链球菌是一种革兰氏阳性菌，在自然界分布非常广泛，不仅可以感染猪，还可以引起人、马、牛、羊等多种动物的感染。猪链球菌可分为35 个血清型（1～34 型和1/2 型），其中1、2、7、9 型在中国比较常见，2 型毒力最强而且流行最广[4]。常见的猪链球菌诊断方法主要有临床诊断、动物尸体剖检、病原分离培养及生化鉴定、血清学鉴定、分子水平鉴定等[5]。

2型猪链球菌可通过黏膜或伤口等传播途径感染人并引发疾病，是一种重要的人畜共患病原菌[6]。2型链球菌病通常呈地方性流行，一年四季均可发病，但常见于4～11周龄的猪群[7-8]。1998—1999 年中国江苏省部分地区和2005年四川省暴发2型链球菌病，对猪养殖业造成了巨大的损失。2022年7月，新疆昌吉市某规模化猪场的保育仔猪出现发热、关节肿胀、站立不稳、腹部背部皮肤有紫色斑块等临床症状。本试验采集了部分病死猪的组织样品，并进行细菌分离鉴定试验，分离纯化菌株通过进行形态学观察、生化反应鉴定、PCR鉴定及血清型分型、药敏试验进一步确定病因，以期为尽快确诊并指导猪场合理使用药物进行预防和治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料来源

样品采集地点为新疆昌吉市某规模化猪场，无菌采集病死猪的心脏、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、淋巴结等组织器官作为试验样品。

1.1.2 主要仪器与试剂

细菌生化管购自杭州微生物试剂有限公司；PCR 仪、凝胶成像仪购自Bio Rad 公司；生物安全柜购自济南鑫贝西生物技术有限公司；全自动核酸提取仪购自上海之江生物医药科技有限公司。

革兰氏染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；核酸提取试剂盒购自上海之江生物医药科技有限公司胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）购自美国BD 公司；胰酪大豆胨液体培养基（TSB）购自美国BD公司。

1.2 试验方法

1.2.1 病原的分离培养与纯化

严格按照无菌要求操作，将病死保育猪的心脏、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、淋巴结等样品划线接种在TSA 平板，37 ℃恒温培养12 h，察看菌落培养生长情况。挑取2～3株疑似目标菌落进行革兰氏染色镜检观察，同时划线接种于TSA琼脂平板进行纯化培养。

1.2.2 生化试验

将菌液分别接种于七叶苷、棉籽糖、甘露糖、尿素、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、乳糖等生化鉴定管中以及甘油、6.5% NaCl液体和麦康凯平板上，培养10～12 h观察生化鉴定结果。

1.2.3 PCR检测和16S rRNA测序

用核酸提取试剂盒提取DNA，-20 ℃保存。根据参考文献[9]合成猪链球菌管家基因谷氨酸脱氢酶（gdh）引物，预扩增目的片段大小为689 bp；按照参考文献[10]合成猪链球菌16S rRNA引物，预扩增目的片段大小为328 bp，引物序列见表1。将阳性PCR 扩增产物送至上海生工测序，将测序结果放在美国生物技术信息中心（NCBI）数据库上进行BLAST碱基序列比对，构建系统进化树。

表1 PCR引物序列信息Tab.1 Primer sequences information for PCR

1.2.4 血清型分型（见表1）

参照文献[9]合成2型猪链球菌荚膜多糖（CPS2J）特异性分型用引物，预扩增片段大小为675 bp。

1.2.5 药敏试验

采用纸片扩散法，检测该分离菌对恩诺沙星、环丙沙星、林可霉素、磺胺嘧啶钠、青霉素、阿莫西林、头孢噻呋、氟苯尼考等8 种临床常用药物的敏感性。将培养10～12 h生长良好的100 μL 分离菌液涂布于TSA 平板表面，取药敏纸片贴于TSA平板表面，待完全吸收后，将平板37 ℃恒温培养24 h 后，测定抑菌圈直径大小，依据抑菌环直径解释标准[5,11]判定菌株对药物的敏感性。

2 结果与分析

2.1 细菌分离纯化及染色镜检

无菌取病死猪的心、肺、淋巴结等组织器官涂抹在TSA 平板上，37 ℃培养10～12 h后观察菌落形态并挑取目标菌落进行革兰氏染色镜检观察，结果见图1。

图1 分离株菌落形态及镜检结果Fig.1 Colony morphology and microscopic examination results of isolated strains

由图1（a）可知，分离株菌落针尖大小、灰白色、圆形、表面光滑湿润、边缘整齐。

由图1（b）可知，菌株革兰氏阳性，有长链状、短链状、单链或双链等多种形态。

2.2 分离株生化反应试验结果

将纯化后的分离株接种于细菌生化反应管内，培养12 h后观察。结果显示，分离株可发酵葡萄糖、棉籽糖、麦芽糖、蔗糖、木糖、乳糖、甘露糖、果糖；能够分解七叶苷，但不能分解尿素；在甘油、6.5% NaCl溶液和麦康凯平板中无法生长。生化鉴定结果与猪链球菌的生化特性相符。

2.3 分离株PCR鉴定及测序结果（见图2、图3）

图2 分离株PCR鉴定结果Fig.2 PCR identification results for isolated strains

图3 系统进化树构建结果Fig.3 Construction results of phylogenetic tree

由图2可知，采用细菌16S rRNA基因通用引物和猪链球菌管家基因gdh引物对分离株进行PCR扩增，电泳结果显示扩增出约328 bp和689 bp的目的条带，与预期目的条带大小一致。

由图3 可知，将16S rRNA 扩增产物的测序结果在NCBI数据库上进行BLAST碱基序列比对，结果显示分离株与猪链球菌同源性高达100%，在系统进化树上与2型猪链球菌处于同一分支，确定所分离株为2型猪链球菌。

2.4 分离株血清型分型结果（见图4）

由图4 可知，使用CPS2J特异性基因引物经PCR 扩增和电泳后，扩增出约675 bp的目的条带，该菌株为2型猪链球菌。

注 ： M为DL2000 Marker；1为2型猪链球菌；2为阴性对照。

2.5 分离株药敏试验结果（见表2）

表2 分离株药敏试验结果Tab.2 Drug sensitivity test results of isolated strain

由表2可知，分离株对恩诺沙星、环丙沙星、林可霉素、阿莫西林、头孢噻呋钠、氟苯尼考均敏感，对青霉素中介，对磺胺嘧啶钠耐药。

3 讨论

猪链球菌病是一类非常重要的人畜共患急性传染病，除了能够感染人和猪以外，还能够感染马、羊、猫、狗、野猪等其他动物[5]。猪链球菌的致病性差异非常大，与其不同的血清型有关，只有强毒力的菌株才能够引起猪肺炎、败血症和突然死亡等症状，低毒力的菌株多见于猪的呼吸道[12-14]。近些年，随着规模化养猪业蓬勃发展，猪链球菌发病率也呈升高的趋势发展，极大地影响了我国养猪业的健康发展[15]。尤其是在中国湖南、广东、广西、江苏、四川、新疆、上海等地均有2 型猪链球菌感染的报道[6,15]。此外，猪链球菌作为革兰氏阳性菌，对各种抗生素药物的抵抗力不是很强[16-17]。但随着近年来日常生产过程中抗生素的大量使用，导致猪链球菌出现不同程度的耐药现象，进而产生了大量的耐药菌株，引起临床用药效果不明显、疾病控制难度越来越大等现象。而且，猪链球菌的耐药基因可通过食物链传递给人类，因此猪场管理者在临床用药时应按照交替轮换用药、联合用药的准则，避免产生大量耐药菌株[18]。

本研究中，经药敏试验表明分离株对8 种临床常见药物均表现出不同程度的耐药性，其中对环丙沙星、林可霉素、恩诺沙星、阿莫西林、头孢噻呋钠、氟苯尼考敏感，对青霉素中介，对磺胺嘧啶钠耐药，推测可能与临床长期使用磺胺类药物存在较大关系。此药敏试验结果与彭凌等[19]、刘泽文等[20]、徐引弟等[21]研究结果不完全相同，说明抗生素在生产过程中的普遍使用造成临床上菌株的耐药性差异很大。因此，为了解在猪链球菌的防治过程中抗生素的耐药情况，开展药敏试验非常有必要。

4 结论

本研究结果表明，新疆昌吉市某规模化猪养殖场保育仔猪死亡的原因是2型猪链球菌感染，建议该猪场可选择环丙沙星、林可霉素、恩诺沙星等药物进行治疗与防控。