黑眉锦蛇消化道各部位主要消化酶的活力及pH对消化酶活力的影响※

●王 伟 胡雨佳 宋 华 张盛周

（安徽师范大学生命科学学院重要生物资源保护与利用重点实验室 安徽 芜湖 241000）

黑眉锦蛇（Elaphe taeniura）隶属于爬行纲（Reptile）有鳞目（Squamata）游蛇科（Colubridae），是一种大型无毒蛇，善攀爬，多捕食鼠类和鸟类。其肉味鲜美，有较高的营养价值，同时其肉、胆、蜕均可作为优良的药材，有很高的经济价值[1]。为保护野生动物资源，黑眉锦蛇的人工养殖已得到大范围推广[2]，与其养殖相关的基础生物学研究也在不断深入开展[3-6]。

研究消化酶的活力，可了解动物对不同营养成分的消化能力，进而为天然饲料的选择和人工饲料的配制提供理论基础。目前，国内外有关低等脊椎动物消化酶的研究主要集中在鱼类[7-11]和两栖类[12-15]，爬行动物消化酶的研究也有一些报道[16-20]。宋华等[21]利用酶组织化学技术对黑眉锦蛇消化道黏膜过氧化氢酶、非特异性酯酶、三磷酸腺苷酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、琥珀酸脱氢酶等6 种酶进行了定位和活性研究，但黑眉锦蛇消化道中的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶的活力尚未见报道。采用生化检测方法对黑眉锦蛇消化道蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶的活力及pH 对酶活力的影响进行了研究，旨在增进对黑眉锦蛇消化酶机能的认识，为其人工养殖技术的发展提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

人工养殖的黑眉锦蛇5 条，均购于芜湖市吉和市场，单重320～455 g，体长135～160 cm。低温麻醉，迅速解剖，将消化道分5 段取材，即食道、胃、前肠、中肠、后肠（直肠），用0.65%的生理盐水快速洗净，用吸水纸轻轻吸干、称重。

1.2 酶液的制备

取消化道各段材料，加入25 倍质量的4℃蒸馏水后，分别在冰水浴中用匀浆器充分匀浆，再以4000 r/min 的速度冷冻离心10 min，收集上清液即为酶液。置于-20℃冰箱中保存备用，酶活力在24 h 内测定分析完毕。

1.3 消化酶活力的测定

分别采用福林-酚试剂法、聚乙烯醇橄榄油乳化液水解法、3，5-二硝基水杨酸比色法、羧甲基纤维素钠水解法对蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶活力进行测定，具体方法参考文献[14]。

1.4 pH 梯度的设置

利用不同pH 值的缓冲液来调节反应的pH条件。4 种缓冲液分别为KCl-HCl 缓冲液（pH 值1.0～1.5）、Na2HPO4-柠檬酸缓冲液（pH 值2.2～8.0）、巴比妥钠-盐酸缓冲液（pH 值8.0～9.6）、甘氨酸-NaOH 缓冲液（pH 值10.0）。胃消化酶设置1.0，1.5，2.2，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，7.4，8.0 和9.0共11 个pH 值梯度；食道、前肠、中肠、后肠消化酶设置2.2，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，7.4，8.0，9.0，9.6 和10.0 共11 个pH 值梯度。

1.5 数据处理及分析

实验数据用3 次测量的平均值±标准差（Mean±SD）表示，用单因素方差分析（one-way ANOVA）对不同部位消化酶的活力进行差异显著性比较。

2 结果与分析

2.1 黑眉锦蛇主要消化酶活力

黑眉锦蛇消化道不同部位蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力，见表1。

表1 黑眉锦蛇消化道主要消化酶活力 单位：U/g

由表1 可知，在消化道中，蛋白酶活力排序是前肠＞中肠＞胃＞后肠＞食道。前肠酶活力最高（P＜0.05），中肠和胃酶活力均较高，且两者差异不显著（P＞0.05），后肠和食道酶活力均显著较低（P＜0.05）；脂肪酶活力排序是前肠＞中肠＞胃＞后肠＞食道，前肠和中肠脂肪酶活力显著较高（P＜0.05），胃酶活力较高，后肠酶活力较低，食道酶活力最低（P＜0.05）；淀粉酶在消化道各段活力均较低，酶活力排序是前肠＞后肠＞中肠＞食道＞胃，前肠酶活力最高（P＜0.05），后肠酶活力次之，中肠和食道酶活力较低，胃酶活力最低（P＜0.05）。此外，还对黑眉锦蛇消化道各段纤维素酶活力进行了检测，结果未观测到明显的酶活力。

2.2 pH 对消化酶活力的影响

2.2.1 pH 对蛋白酶活力的影响根据单因素方差分析，不同pH 条件下，黑眉锦蛇消化道各段蛋白酶的活力变化有显著差异（P＜0.05）。由图1 可知，食道、胃、前肠、中肠、后肠蛋白酶最适pH 值分别为4.0，2.2，7.4，7.4 和7.0。食道蛋白酶活力最低，整个酶活力曲线变化平缓，在pH 值4.0 时酶活力最大。胃蛋白酶在pH 值1.5～3.0 范围内活力较强，在pH 值1.0～2.2 范围内酶活力上升迅速，在pH 值为2.2 时酶活力最强，pH 值大于2.2 后酶活力急剧下降，至pH值4.0 时酶活力仅有最大值的26%左右。前肠和中肠蛋白酶活力曲线相似，在pH 值2.2～4.0范围内酶活力均较弱，且上升缓慢，在pH 4.0～7.4 范围内，酶活力随pH 值的升高而迅速升高，pH 值7.4 时酶活力达到最大值，pH 继续增大时酶活力迅速下降，至pH 值9.0 时酶活力仅为最大值的37%左右。后肠蛋白酶活力也较低，变化趋势和食道相似，pH 值为6.0 时酶活力最大。

图1 pH 对蛋白酶活力的影响

2.2.2 pH 对脂肪酶活力的影响根据单因素方差分析，不同pH 条件下，黑眉锦蛇消化道各段脂肪酶的活力变化有显著差异（P＜0.05）。由图2 可知，食道、胃和后肠的最适pH 值均为6.0，而前肠和中肠的最适pH 值均为7.4。食道和后肠脂肪酶活力变化趋势相似，在最适pH 值（6.0）前后酶活力上升和下降都较平缓，但后肠酶活力变化稍大。胃脂肪酶活力在pH 值6.0 时达最大值，在pH 值2.2～4.0 和8.0～10.0 范围内上升和下降均较缓慢，在pH 值4.0～6.0 和6.0～8.0 范围内上升和下降均较迅速，在pH 值4.0 与8.0 时酶活力均为最适pH 值时的17%左右。前肠和中肠脂肪酶活力变化趋势也相似，在pH 值2.2～4.0 范围内酶活力变化不明显，但在4.0～7.4 范围内急剧上升，在pH 值7.4 时达到最大值，而后至9.0又迅速下降，在pH 值9.0 时酶活力仅为最大值的21%左右。

图2 pH 对脂肪酶活力的影响

2.2.3 pH 对淀粉酶活力的影响根据单因素方差分析，不同pH 条件下，黑眉锦蛇消化道各段淀粉酶的活力变化有显著差异（P＜0.05）。由图3 可知，食道淀粉酶的最适pH 值为7.0，胃、前肠和中肠最适pH 值均为8.0，后肠最适pH 值为7.4。食道和后肠淀粉酶活力变化趋势相似，在pH 值3.0～6.0 范围内酶活力均缓慢上升，pH 值6.0 至最适pH 范围内酶活力上升较快，而后又迅速下降，在pH 值10.0 时酶活力几乎丧失。胃淀粉酶活力较弱，酶活力变化趋势总体平缓，在pH 值8.0 时酶活力最强。前肠淀粉酶的活力在pH 值3.0～5.0范围内上升较缓慢，而在pH 值5.0～8.0 范围内上升较快，在pH 值8.0 时达最大值，而后至10.0又急剧下降，在pH 值10.0 时约为最大酶活力的12%。中肠淀粉酶活力在pH 值3.0～6.0 范围内上升也较缓慢，在pH 值6.0～8.0 范围内上升稍快，在pH 值8.0 时达最大值，而后至10.0 又迅速下降，在pH 值10.0 时酶活力几乎丧失。

图3 pH 对淀粉酶活力的影响

3 讨论

3.1 黑眉锦蛇主要消化酶的活力

蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶是动物消化道中的主要消化酶类，本研究在黑眉锦蛇消化道中检测到蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力，未检测到明显的纤维素酶活力。不同消化酶在黑眉锦蛇消化道中的活力存在显著差异，蛋白酶和脂肪酶活力较强，淀粉酶活力较弱，这与黄金鲈（Perca flavescens）[7]、牛蛙（Rana catesbeinana）[14]、虎斑颈槽蛇（Rhabdophis tigrinus lateralis）[19]、棕黑锦蛇（Elaphe schrenckii）[20]等动物的消化酶活力情况相一致。消化酶活力与动物的食性密切相关，肉食性动物的蛋白酶、脂肪酶活力相对较强，草食性动物的淀粉酶活力相对较强，黑眉锦蛇多捕食鼠类和鸟类等，属于肉食性动物，其蛋白酶及脂肪酶活力较强。在黑眉锦蛇养殖过程中，可对人工饲料的成分进行调整，适当提高饲料中蛋白质和脂肪的含量，减少淀粉含量。

在最适pH 值下，黑眉锦蛇消化道中蛋白酶活力在前肠最强，中肠和胃次之。不同动物消化道中蛋白酶活力分布有较大差异，如黄金鲈[7]和蒙古鲌（Culter mongolicus）[8]蛋白酶活力均在前肠显著较高，与本研究结果相似，而牛蛙[14]、幼鳖（Trionyx sinensis）[16]和北草蜥（Takydromus septentrionalis）[17]的蛋白酶活力均为胃强于肠道。黑眉锦蛇脂肪酶活力在前肠和中肠较强，黑斑蛙（Rana nigromaculata）[13]脂肪酶活力在中肠显著较强，而黄金鲈[7]脂肪酶活力以胃最强，牛蛙[14]脂肪酶活力在后肠较强。黑眉锦蛇淀粉酶活力在前肠显著较强，黄金鲈[7]淀粉酶活力也在前肠较强，而蒙古鲌[8]淀粉酶在各部位分布无明显差异，翘嘴红鲌（Erythroculter illshaeformis）[10]和牛蛙的淀粉酶活力均在中肠较强，可见不同动物的消化酶分布存在物种特异性。黑眉锦蛇消化道中消化酶的分布表明前肠、中肠和胃是蛋白质的主要消化部位，前肠和中肠是脂质的主要消化部位，前肠是淀粉的主要消化部位。

3.2 pH 对消化酶活力的影响

pH 是影响酶促反应的重要因素之一，pH 值过大或者过小都会影响酶的活力。本研究中pH对蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力的影响均较为显著，且三种酶的活力随pH 值的变化曲线大都呈单峰型。蛋白酶活力在不同组织中的最适pH 值不同，其中胃蛋白酶活力的最适pH 值为2.2，表明胃蛋白酶在强酸性时活力较强，这与胃中蛋白质只有在强酸时才能被有效分解的结论[22]一致。黄金鲈[7]和牛蛙[14]胃蛋白酶活力最适pH 值分别为2.5 和2.2，均与本研究结果相似，但金建丽等[20]对棕黑锦蛇的研究显示胃蛋白酶活力的最适pH 值为6.6。蒙古鲌[8]、翘嘴红鲌[10]和牛蛙[14]肠道蛋白酶活力的最适pH 值分别为7.4，7.0，7.4，本研究中黑眉锦蛇的肠道蛋白酶活力最适pH 值在7.0～7.4，与上述动物研究结果相类似。但黄金鲈[7]肠道蛋白酶活力最适pH 值为9.0，棕黑锦蛇[20]肠道蛋白酶活力最适pH 值在8.6～9.0，明显高于黑眉锦蛇。

大量研究表明，肠道脂肪酶在中性pH 环境中活力较强，如黄金鲈[7]肠道脂肪酶活力的最适pH 值为6.0～7.0，蒙古鲌[8]、翘嘴红鲌[10]和牛蛙[14]肠道脂肪酶活力的最适pH 值均为7.4。黑眉锦蛇的脂肪酶活力在前肠和中肠的最适pH 值均为7.4，在后肠的最适pH 值为6.0，与上述几种动物的研究结果相一致。黑眉锦蛇胃脂肪酶活力最适pH 值为6.0，而牛蛙[14]胃脂肪酶活力最适pH 值为2.2，黑斑蛙[13]胃脂肪酶活力最适pH值为5.0，棕黑锦蛇[20]胃脂肪酶活力最适pH 值为5.4，表明不同动物胃脂肪酶活力的最适pH 值存在一定的物种特异性。

黄金鲈[7]胃淀粉酶活力最适pH 值为6.0，牛蛙[14]淀粉酶在胃中最适pH 值为7.0，棕黑锦蛇[20]胃淀粉酶活力最适pH 值为6.2。而本研究中黑眉锦蛇的淀粉酶活力在胃中最适pH 值为8.0，明显高于上述动物胃淀粉酶的最适pH 值。黄金鲈[7]、蒙古鲌[8]、翘嘴红鲌[10]和牛蛙[14]的肠道淀粉酶活力最适pH 值分别为7.0，7.4，7.0，8.0，黑眉锦蛇的淀粉酶活力在前肠和中肠最适pH 值为8.0，在后肠最适pH 值为7.4，与上述动物消化道淀粉酶活力的最适pH 范围相一致，但棕黑锦蛇[20]肠道淀粉酶活力的最适pH 值为5.8～6.6。

蛋白酶和脂肪酶是黑眉锦蛇消化道主要消化酶类，黑眉锦蛇胃蛋白酶活力在强酸下较强，脂肪酶活力也在酸性时较强。据此，在配制黑眉锦蛇人工饲料时，适量添加酸化剂可提高黑眉锦蛇对饲料中蛋白质和脂质的消化能力，进而提高养殖效益。