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黑眉锦蛇消化道各部位主要消化酶的活力及pH对消化酶活力的影响※

2023-09-12胡雨佳张盛周

特种经济动植物 2023年9期
关键词:中肠消化酶脂肪酶

●王 伟 胡雨佳 宋 华 张盛周

(安徽师范大学生命科学学院重要生物资源保护与利用重点实验室 安徽 芜湖 241000)

黑眉锦蛇(Elaphe taeniura)隶属于爬行纲(Reptile)有鳞目(Squamata)游蛇科(Colubridae),是一种大型无毒蛇,善攀爬,多捕食鼠类和鸟类。其肉味鲜美,有较高的营养价值,同时其肉、胆、蜕均可作为优良的药材,有很高的经济价值[1]。为保护野生动物资源,黑眉锦蛇的人工养殖已得到大范围推广[2],与其养殖相关的基础生物学研究也在不断深入开展[3-6]。

研究消化酶的活力,可了解动物对不同营养成分的消化能力,进而为天然饲料的选择和人工饲料的配制提供理论基础。目前,国内外有关低等脊椎动物消化酶的研究主要集中在鱼类[7-11]和两栖类[12-15],爬行动物消化酶的研究也有一些报道[16-20]。宋华等[21]利用酶组织化学技术对黑眉锦蛇消化道黏膜过氧化氢酶、非特异性酯酶、三磷酸腺苷酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、琥珀酸脱氢酶等6 种酶进行了定位和活性研究,但黑眉锦蛇消化道中的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶的活力尚未见报道。采用生化检测方法对黑眉锦蛇消化道蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶的活力及pH 对酶活力的影响进行了研究,旨在增进对黑眉锦蛇消化酶机能的认识,为其人工养殖技术的发展提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

人工养殖的黑眉锦蛇5 条,均购于芜湖市吉和市场,单重320~455 g,体长135~160 cm。低温麻醉,迅速解剖,将消化道分5 段取材,即食道、胃、前肠、中肠、后肠(直肠),用0.65%的生理盐水快速洗净,用吸水纸轻轻吸干、称重。

1.2 酶液的制备

取消化道各段材料,加入25 倍质量的4℃蒸馏水后,分别在冰水浴中用匀浆器充分匀浆,再以4000 r/min 的速度冷冻离心10 min,收集上清液即为酶液。置于-20℃冰箱中保存备用,酶活力在24 h 内测定分析完毕。

1.3 消化酶活力的测定

分别采用福林-酚试剂法、聚乙烯醇橄榄油乳化液水解法、3,5-二硝基水杨酸比色法、羧甲基纤维素钠水解法对蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶活力进行测定,具体方法参考文献[14]。

1.4 pH 梯度的设置

利用不同pH 值的缓冲液来调节反应的pH条件。4 种缓冲液分别为KCl-HCl 缓冲液(pH 值1.0~1.5)、Na2HPO4-柠檬酸缓冲液(pH 值2.2~8.0)、巴比妥钠-盐酸缓冲液(pH 值8.0~9.6)、甘氨酸-NaOH 缓冲液(pH 值10.0)。胃消化酶设置1.0,1.5,2.2,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,7.4,8.0 和9.0共11 个pH 值梯度;食道、前肠、中肠、后肠消化酶设置2.2,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,7.4,8.0,9.0,9.6 和10.0 共11 个pH 值梯度。

1.5 数据处理及分析

实验数据用3 次测量的平均值±标准差(Mean±SD)表示,用单因素方差分析(one-way ANOVA)对不同部位消化酶的活力进行差异显著性比较。

2 结果与分析

2.1 黑眉锦蛇主要消化酶活力

黑眉锦蛇消化道不同部位蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力,见表1。

表1 黑眉锦蛇消化道主要消化酶活力 单位:U/g

由表1 可知,在消化道中,蛋白酶活力排序是前肠>中肠>胃>后肠>食道。前肠酶活力最高(P<0.05),中肠和胃酶活力均较高,且两者差异不显著(P>0.05),后肠和食道酶活力均显著较低(P<0.05);脂肪酶活力排序是前肠>中肠>胃>后肠>食道,前肠和中肠脂肪酶活力显著较高(P<0.05),胃酶活力较高,后肠酶活力较低,食道酶活力最低(P<0.05);淀粉酶在消化道各段活力均较低,酶活力排序是前肠>后肠>中肠>食道>胃,前肠酶活力最高(P<0.05),后肠酶活力次之,中肠和食道酶活力较低,胃酶活力最低(P<0.05)。此外,还对黑眉锦蛇消化道各段纤维素酶活力进行了检测,结果未观测到明显的酶活力。

2.2 pH 对消化酶活力的影响

2.2.1 pH 对蛋白酶活力的影响根据单因素方差分析,不同pH 条件下,黑眉锦蛇消化道各段蛋白酶的活力变化有显著差异(P<0.05)。由图1 可知,食道、胃、前肠、中肠、后肠蛋白酶最适pH 值分别为4.0,2.2,7.4,7.4 和7.0。食道蛋白酶活力最低,整个酶活力曲线变化平缓,在pH 值4.0 时酶活力最大。胃蛋白酶在pH 值1.5~3.0 范围内活力较强,在pH 值1.0~2.2 范围内酶活力上升迅速,在pH 值为2.2 时酶活力最强,pH 值大于2.2 后酶活力急剧下降,至pH值4.0 时酶活力仅有最大值的26%左右。前肠和中肠蛋白酶活力曲线相似,在pH 值2.2~4.0范围内酶活力均较弱,且上升缓慢,在pH 4.0~7.4 范围内,酶活力随pH 值的升高而迅速升高,pH 值7.4 时酶活力达到最大值,pH 继续增大时酶活力迅速下降,至pH 值9.0 时酶活力仅为最大值的37%左右。后肠蛋白酶活力也较低,变化趋势和食道相似,pH 值为6.0 时酶活力最大。

图1 pH 对蛋白酶活力的影响

2.2.2 pH 对脂肪酶活力的影响根据单因素方差分析,不同pH 条件下,黑眉锦蛇消化道各段脂肪酶的活力变化有显著差异(P<0.05)。由图2 可知,食道、胃和后肠的最适pH 值均为6.0,而前肠和中肠的最适pH 值均为7.4。食道和后肠脂肪酶活力变化趋势相似,在最适pH 值(6.0)前后酶活力上升和下降都较平缓,但后肠酶活力变化稍大。胃脂肪酶活力在pH 值6.0 时达最大值,在pH 值2.2~4.0 和8.0~10.0 范围内上升和下降均较缓慢,在pH 值4.0~6.0 和6.0~8.0 范围内上升和下降均较迅速,在pH 值4.0 与8.0 时酶活力均为最适pH 值时的17%左右。前肠和中肠脂肪酶活力变化趋势也相似,在pH 值2.2~4.0 范围内酶活力变化不明显,但在4.0~7.4 范围内急剧上升,在pH 值7.4 时达到最大值,而后至9.0又迅速下降,在pH 值9.0 时酶活力仅为最大值的21%左右。

图2 pH 对脂肪酶活力的影响

2.2.3 pH 对淀粉酶活力的影响根据单因素方差分析,不同pH 条件下,黑眉锦蛇消化道各段淀粉酶的活力变化有显著差异(P<0.05)。由图3 可知,食道淀粉酶的最适pH 值为7.0,胃、前肠和中肠最适pH 值均为8.0,后肠最适pH 值为7.4。食道和后肠淀粉酶活力变化趋势相似,在pH 值3.0~6.0 范围内酶活力均缓慢上升,pH 值6.0 至最适pH 范围内酶活力上升较快,而后又迅速下降,在pH 值10.0 时酶活力几乎丧失。胃淀粉酶活力较弱,酶活力变化趋势总体平缓,在pH 值8.0 时酶活力最强。前肠淀粉酶的活力在pH 值3.0~5.0范围内上升较缓慢,而在pH 值5.0~8.0 范围内上升较快,在pH 值8.0 时达最大值,而后至10.0又急剧下降,在pH 值10.0 时约为最大酶活力的12%。中肠淀粉酶活力在pH 值3.0~6.0 范围内上升也较缓慢,在pH 值6.0~8.0 范围内上升稍快,在pH 值8.0 时达最大值,而后至10.0 又迅速下降,在pH 值10.0 时酶活力几乎丧失。

图3 pH 对淀粉酶活力的影响

3 讨论

3.1 黑眉锦蛇主要消化酶的活力

蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶是动物消化道中的主要消化酶类,本研究在黑眉锦蛇消化道中检测到蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力,未检测到明显的纤维素酶活力。不同消化酶在黑眉锦蛇消化道中的活力存在显著差异,蛋白酶和脂肪酶活力较强,淀粉酶活力较弱,这与黄金鲈(Perca flavescens)[7]、牛蛙(Rana catesbeinana)[14]、虎斑颈槽蛇(Rhabdophis tigrinus lateralis)[19]、棕黑锦蛇(Elaphe schrenckii)[20]等动物的消化酶活力情况相一致。消化酶活力与动物的食性密切相关,肉食性动物的蛋白酶、脂肪酶活力相对较强,草食性动物的淀粉酶活力相对较强,黑眉锦蛇多捕食鼠类和鸟类等,属于肉食性动物,其蛋白酶及脂肪酶活力较强。在黑眉锦蛇养殖过程中,可对人工饲料的成分进行调整,适当提高饲料中蛋白质和脂肪的含量,减少淀粉含量。

在最适pH 值下,黑眉锦蛇消化道中蛋白酶活力在前肠最强,中肠和胃次之。不同动物消化道中蛋白酶活力分布有较大差异,如黄金鲈[7]和蒙古鲌(Culter mongolicus)[8]蛋白酶活力均在前肠显著较高,与本研究结果相似,而牛蛙[14]、幼鳖(Trionyx sinensis)[16]和北草蜥(Takydromus septentrionalis)[17]的蛋白酶活力均为胃强于肠道。黑眉锦蛇脂肪酶活力在前肠和中肠较强,黑斑蛙(Rana nigromaculata)[13]脂肪酶活力在中肠显著较强,而黄金鲈[7]脂肪酶活力以胃最强,牛蛙[14]脂肪酶活力在后肠较强。黑眉锦蛇淀粉酶活力在前肠显著较强,黄金鲈[7]淀粉酶活力也在前肠较强,而蒙古鲌[8]淀粉酶在各部位分布无明显差异,翘嘴红鲌(Erythroculter illshaeformis)[10]和牛蛙的淀粉酶活力均在中肠较强,可见不同动物的消化酶分布存在物种特异性。黑眉锦蛇消化道中消化酶的分布表明前肠、中肠和胃是蛋白质的主要消化部位,前肠和中肠是脂质的主要消化部位,前肠是淀粉的主要消化部位。

3.2 pH 对消化酶活力的影响

pH 是影响酶促反应的重要因素之一,pH 值过大或者过小都会影响酶的活力。本研究中pH对蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力的影响均较为显著,且三种酶的活力随pH 值的变化曲线大都呈单峰型。蛋白酶活力在不同组织中的最适pH 值不同,其中胃蛋白酶活力的最适pH 值为2.2,表明胃蛋白酶在强酸性时活力较强,这与胃中蛋白质只有在强酸时才能被有效分解的结论[22]一致。黄金鲈[7]和牛蛙[14]胃蛋白酶活力最适pH 值分别为2.5 和2.2,均与本研究结果相似,但金建丽等[20]对棕黑锦蛇的研究显示胃蛋白酶活力的最适pH 值为6.6。蒙古鲌[8]、翘嘴红鲌[10]和牛蛙[14]肠道蛋白酶活力的最适pH 值分别为7.4,7.0,7.4,本研究中黑眉锦蛇的肠道蛋白酶活力最适pH 值在7.0~7.4,与上述动物研究结果相类似。但黄金鲈[7]肠道蛋白酶活力最适pH 值为9.0,棕黑锦蛇[20]肠道蛋白酶活力最适pH 值在8.6~9.0,明显高于黑眉锦蛇。

大量研究表明,肠道脂肪酶在中性pH 环境中活力较强,如黄金鲈[7]肠道脂肪酶活力的最适pH 值为6.0~7.0,蒙古鲌[8]、翘嘴红鲌[10]和牛蛙[14]肠道脂肪酶活力的最适pH 值均为7.4。黑眉锦蛇的脂肪酶活力在前肠和中肠的最适pH 值均为7.4,在后肠的最适pH 值为6.0,与上述几种动物的研究结果相一致。黑眉锦蛇胃脂肪酶活力最适pH 值为6.0,而牛蛙[14]胃脂肪酶活力最适pH 值为2.2,黑斑蛙[13]胃脂肪酶活力最适pH值为5.0,棕黑锦蛇[20]胃脂肪酶活力最适pH 值为5.4,表明不同动物胃脂肪酶活力的最适pH 值存在一定的物种特异性。

黄金鲈[7]胃淀粉酶活力最适pH 值为6.0,牛蛙[14]淀粉酶在胃中最适pH 值为7.0,棕黑锦蛇[20]胃淀粉酶活力最适pH 值为6.2。而本研究中黑眉锦蛇的淀粉酶活力在胃中最适pH 值为8.0,明显高于上述动物胃淀粉酶的最适pH 值。黄金鲈[7]、蒙古鲌[8]、翘嘴红鲌[10]和牛蛙[14]的肠道淀粉酶活力最适pH 值分别为7.0,7.4,7.0,8.0,黑眉锦蛇的淀粉酶活力在前肠和中肠最适pH 值为8.0,在后肠最适pH 值为7.4,与上述动物消化道淀粉酶活力的最适pH 范围相一致,但棕黑锦蛇[20]肠道淀粉酶活力的最适pH 值为5.8~6.6。

蛋白酶和脂肪酶是黑眉锦蛇消化道主要消化酶类,黑眉锦蛇胃蛋白酶活力在强酸下较强,脂肪酶活力也在酸性时较强。据此,在配制黑眉锦蛇人工饲料时,适量添加酸化剂可提高黑眉锦蛇对饲料中蛋白质和脂质的消化能力,进而提高养殖效益。

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