壮筋养血汤介导MAPK/P38-ERK通路调控成骨成脂分化的作用机制

温蕊嘉 董鑫 庄皓文 王俊岩 张锦芳

1.广州中医药大学第一临床医学院,广东 广州 510405

2.广州中医药大学第一附属医院,广东 广州 510405

3.广州中医药大学中药学院,广东 广州 510006

4.广州中医药大学深圳医院(福田),广东 深圳 518000

骨骼是人类及脊椎动物运动系统中的重要组成部分,与个体的生长发育、行动与生存能力密切相关。随着个体年龄的增长,骨形成能力逐渐减弱,而骨吸收能力逐渐增强,从而引起骨代谢紊乱,最终导致骨质疏松症等骨疾病[1]。大多数骨质疏松症患者骨髓中脂肪细胞增多,导致骨质流失[2]。骨髓脂肪细胞和骨细胞由共同的祖细胞-骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)发育而来。BMSCs是一类起源于中胚层的成体干细胞,具有自我更新及多向分化潜能,在一定微环境下分化为成骨细胞或脂肪细胞[3]。在自然状态下,成骨细胞与脂肪细胞维持动态平衡,并可在特定条件下进行转化,一旦这种动态平衡被打破,则会导致一系列骨代谢疾病[4-5]。因此,维持成骨与成脂的平衡可能是预防或治疗骨代谢疾病的一种候选治疗方法[6-7]。

骨桥蛋白(osteopontin,OPN)与Runt相关转录因子2(RUNX2)为成骨分化早期标志物,对骨组织的形成和重建起着重要作用。现代研究表明,在BMSCs向成骨细胞分化的过程中,RUNX2激活骨基质蛋白如ALP、OPN、骨涎蛋白等的表达,同时可以调控骨形成的进程[8]。过氧化物酶体增殖物激活受体 (peroxisome proliferator-activated receptors, PPARs) 的亚型PPARγ与CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα) 是BMSCs成脂分化通路的晚期分子标志物,对BMSCs成脂分化起关键性调控作用。BMSCs的活性降低及成骨与成脂分化平衡失调可导致骨再生减少,是大多骨代谢疾病的重要病理基础之一。研究发现MAPK/ERK通路是骨机械和激素信号的重要中介,通过RUNX2和PPARγ的磷酸化刺激成骨细胞的生成并抑制脂肪的生成[9]。LncRNA与成骨分化有直接关系,可以调节BMSCs的成骨和成脂分化[10]。LncRNA ANRIL最初是由Pasmant等人在研究黑色素瘤时发现,现有研究表明LncRNA ANRIL通过调控MiR-125a-3p/MAPK信号通路抑制卵巢癌细胞增殖[11],ANRIL通过miR-125a-3p/FGFR1/MAPK信号通路促进头颈部鳞状细胞癌的进展[12]。然而LncRNA ANRIL在BMSCs成骨成脂中的调控机制尚不清晰。中医学治疗骨科疾病的历史悠久,壮筋养血汤(Zhuangjin Yangxue Decoction,ZJYXD)是《伤科补要》中活血壮筋的经典方剂,具有养血活络、强筋壮腰的功效。本研究拟通过体外及体内实验探讨壮筋养血汤通过LncRNA ANRIL对成骨成脂分化的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物:用于制备含药血清的实验动物:SPF级7～8周雄性SD大鼠,共8只,体质量180～200 g;用于提取骨髓间充质细胞和造模的实验动物:SPF级6～8周龄C57BL/6雄性小鼠32只,体质量20～25 g。伦理申请号:20210119002,申请单位:广州中医药大学。购买及饲养均在广州中医药大学实验动物中心,许可证号:[SYXK(粤)2018-0001]。

1.1.2药品与试剂:壮筋养血汤(白芍9 g、当归9 g、川芎6 g、川断12 g、红花5 g、生地12 g、牛膝9 g、牡丹皮9 g、杜仲6 g,广州中医药大学附属第一医院);β-甘油磷酸盐(货号G9422),地塞米松(货号D4902),L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐(货号49752),吲哚美辛(货号I8280),胰岛素(货号 I5523),3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(货号I5879),美国默克公司;α-MEM培养基(货号12571063),PBS(货号8121447),FBS(货号2173969RP),Lipofectamine 3000 Reagent(货号:L3000001),美国赛默飞公司;电泳液(货号P0561),BCA试剂盒(货号P0012S),凝胶制备试剂盒(货号P0690),碱性磷酸酶检测试剂盒(货号P0321S),BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒(货号C3206),茜素红S染色液(货号C0140),改良油红O染色试剂盒(货号C0158S),中国上海碧云天生物科技有限公司;CCK-8试剂盒(货号CA1210),全蛋白提取试剂盒(货号BC3710),北京索莱宝科技有限公司;显影液(货号KGP1121),中国南京凯基生物科技发展有限公司;β-actin抗体(货号20536-1-AP),PPARγ抗体(货号16643-1-AP),C/EBPα抗体(货号18311-1-AP),OPN抗体(货号25715-1-AP),RUNX2抗体(货号20700-1-AP),P-ERK抗体(货号28733-1-AP),ERK1/2抗体(货号51068-1-AP),P38抗体(货号14064-1-AP),武汉三鹰生物技术有限公司。

1.1.3主要仪器:酶标仪(型号Multiskan FC,美国赛默飞公司);倒置荧光显微镜(型号IX73),日本奥林巴斯公司;实时荧光定量PCR仪(型号CFX96),全自动凝胶成像系统(型号Gel Doc EZ),高压电泳仪(型号Power Pac TMB asic),美国伯乐公司;离心机(型号Allegra X-30R),美国贝克曼公司;多模式小动物活体成像系统(型号FX Pro),美国Bruker公司。

1.2 方法

1.2.1大鼠含药血清的制备:壮筋养血汤制备水煎液,加热浓缩至含药浓度1 g/mL。参照大鼠与人等剂量换算公式,ZJYXD剂量为8.085 g/kg进行灌胃,2次/d,连续灌胃1周。末次灌胃2 h后,深度麻醉大鼠,通过腹主动脉进行采血,制备血清,56 ℃水浴灭活1 h,过滤后冻存用于后续试验。

1.2.2BMSCs原代细胞的提取:取6～8周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠8只,麻醉处死后,取双下肢股骨,按文献[13]中具体操作提取细胞。待细胞密度至80 %左右时,消化后进行传代培养。

1.2.3小鼠股骨横断骨折模型:选用小鼠股骨横断骨折模型为实验研究对象,具体方法参照文献[14],选取髓内针作为固定方法,缝合收紧,标记骨折部位。

1.2.4CCK-8实验检测BMSCs细胞增殖活力:使用CCK-8试剂盒测定不同浓度的ZJYXD含药血清对BMSCs细胞增殖的影响。细胞分别按0 %、2 %、4 %、6 %、8 %、10 %含药血清分组进行相应的处理,随后按CCK-8试剂盒说明书进行操作。

1.2.5慢病毒感染BMSCs并进行分组给药:取对数生长期的BMSCs细胞接种于6孔板中,分别将空载(NC)和LncRNA过表达(ANRIL)慢病毒按照Lipofectamine3000 Reagent试剂盒说明书转染至BMSCs。将细胞分为NC组(阴性对照组),NC +ZJYXD组(对照组+6 % ZJYXD含药血清组),ANRIL组(LncRNA ANRIL过表达组),ANRIL+ZJYXD组(LncRNA ANRIL过表达组+6 % ZJYXD含药血清组)。随后使用荧光显微镜观察感染效率,qRT-PCR检测各组细胞中ANRIL mRNA的表达。

1.2.6成骨、成脂诱导各组BMSCs:细胞以每孔5×105个接种于12孔板中,贴壁后进行成骨、成脂诱导。成骨及成脂诱导分别按照文献[15]说明进行诱导。每3天更换一次培养基。

1.2.7碱性磷酸酶、茜素红染色及定量分析检测各组细胞成骨能力:成骨诱导后第7天进行碱性磷酸酶染色与定量分析。对于碱性磷酸酶染色,根据BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒中的方案进行配制操作,于扫描仪上进行观察。对于碱性磷酸酶的定量检测,根据碱性磷酸酶检测试剂盒说明书进行操作,置于酶标仪检测吸光值。成骨诱导后第14天进行茜素红染色及定量分析。对于茜素红染色,细胞进行固定后,加入茜素红S染液,随后清洗3～5次,置于扫描仪观察拍照。对于茜素红钙盐定量分析,取染色后孔板加入10 %氯化十六烷基吡啶,收集液体于560 nm检测吸光值。

1.2.8油红O染色检测各组细胞成脂能力:成脂诱导7 d后进行油红O染色,吸出培养基,4 %多聚甲醛进行固定,根据改良油红O染色试剂盒说明进行溶液配制,染色30 min,随后ddH2O清洗置于显微镜下拍照。

1.2.9qRT-PCR检测成骨、成脂相关mRNA基因的表达:将细胞均匀铺于六孔板上,根据分组进行不同处理,待细胞贴壁后,进行成骨成脂诱导,诱导7 d后将细胞消化,离心提取RNA,根据反转录试剂盒说明书进行逆转录,根据定量PCR试剂盒提供的方案进行加板上样。使用实时荧光定量PCR法进行扩增,随后进行定量分析,检测相关基因的表达。引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.10Western Blot法检测成骨成脂及相关通路蛋白的表达:对细胞进行蛋白提取,运用BCA蛋白浓度定量法对蛋白浓度进行定量;采用SDS-PAGE凝胶经80～120 V电泳分离目标蛋白,随后转膜;5%脱脂奶粉室温封闭1 h,加入一抗(1∶1 000),4 ℃孵育过夜;加入二抗(1∶2 000)室温孵育1 h,随后加入显影液避光进行显影,其中内参为β-actin,使用软件ImageJ进行结果分析。

1.2.11X-ray与Micro-CT检测ZJYXD促进骨愈合的能力:造模小鼠术后3 d将慢病毒感染后的BMSCs细胞收集制成1×106个/mL细胞悬液,将小鼠按照1.2.4分组于皮肤标记骨折处注射细胞,术后5 d开始进行灌胃。小鼠分为四组:NC组(阴性对照组),NC+ZJYXD组(对照组+6 % ZJYXD含药血清组),ANRIL组(LncRNA ANRIL过表达组),ANRIL+ZJYXD组(LncRNA ANRIL过表达组+6 % ZJYXD含药血清组),每组6只,其中NC+ZJYXD组与ANRIL+ZJYXD组参照小鼠与人等剂量换算公式,ZJYXD剂量为11.68 g/kg灌胃,其余两组给予等量生理盐水灌胃,2周后麻醉进行脱臼处死,取股骨进行X-ray与Micro-CT检测。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 不同浓度的ZJYXD对BMSCs细胞活力的影响

CCK-8结果见图1,ZJYXD含药血清能明显促进BMSCs的增殖活性,与0 %含药血清浓度相比,6 % ZJYXD含药血清对BMSCs细胞增殖能力最强,故选用6 % ZJYXD含药血清浓度进行后续实验。

图1 不同浓度ZJYXD含药血清对BMSCs细胞增殖活性

2.2 BMSCs细胞转染LncRNA ANRIL慢病毒及ZJYXD对ANRIL的影响

荧光显微镜下观察荧光明显,细胞存活较多。与NC组比较,NC+ZJYXD组ANRIL mRNA表达降低(P<0.01),ANRIL组ANRIL mRNA表达显著提高(P<0.01);与NC+ZJYXD组对比,ANRIL+ZJYXD组ANRIL mRNA表达升高(P<0.01);ANRIL+ZJYXD组与ANRIL组相比不具有差异性(P>0.05)。见图2。

图2 慢病毒转染效率荧光对比及mRNA表达量(×200)

2.3 ZJYXD通过ANRIL调节BMSCs细胞成骨分化

染色结果见图3。与NC组对比,NC+ZJYXD组染色更深,成骨分泌标志物更多,细胞外矿化结节的形成与沉积较多(P<0.01);与NC组对比,ANRIL组染色浅,成骨分泌标志物较少,矿化结节形成较少,碱性磷酸酶活性与钙质沉积量减少(P<0.01);与NC+ZJYXD组对比,ANRIL+ZJYXD组染色弱,碱性磷酸酶活性与钙盐沉积被抑制(P<0.01),表明ANRIL的表达抑制了ZJYXD促进骨形成作用。ANRIL+ZJYXD组与ANRIL组对比染色及定量分析无统计差异,表明ZJYXD促进成骨分泌及骨矿化结节的形成能力被ANRIL的过表达抑制(P>0.05)。

图3 碱性磷酸酶染色、茜素红染色及定量分析

2.4 ZJYXD通过ANRIL调节BMSCs细胞成脂分化

与NC组对比,NC+ZJYXD组脂肪颗粒较少,ANRIL组红色脂肪细胞较多,成脂能力较强;与NC+ZJYXD组对比,ANRIL+ZJYXD组脂肪颗粒较多,成脂能力增强;ANRIL+ZJYXD组与ANRIL组对比脂肪颗粒变化不明显。见图4。

图4 显微镜下观察油红O染色脂滴形成情况(×100)

2.5 ZJYXD通过ANRIL调节BMSCs细胞成骨成脂相关基因及蛋白的表达

与NC组对比,NC+ZJYXD组OPN、RUNX2的mRNA及蛋白表达显著升高,C/EBPα、PPARγ的mRNA及蛋白表达显著降低(P<0.01);ANRIL组OPN、RUNX2的mRNA及蛋白表达降低,C/EBPα、PPARγ的mRNA及蛋白表达升高(P<0.01);与NC+ZJYXD组对比,ANRIL+ZJYXD组OPN、RUNX2的mRNA及蛋白表达明显降低,C/EBPα、PPARγ的mRNA及蛋白表达明显升高(P<0.01);与ANRIL组对比,ANRIL+ZJYXD组成骨成脂相关基因及蛋白表达不具有差异性(P>0.05)。见图5。

图5 成骨成脂相关基因及蛋白的表达

2.6 ZJYXD通过ANRIL介导的MAPK/P38-ERK信号通路促进BMSCs成骨分化

与NC组对比,NC+ZJYXD组P-ERK、P38蛋白的表达增加(P<0.01),ANRIL组P-ERK、P38蛋白表达降低(P<0.01);与NC+ZJYXD组对比,ANRIL+ZJYXD组P-ERK、P38蛋白表达明显降低(P<0.01);ANRIL+ZJYXD组与ANRIL组对比P-ERK、P38蛋白表达无差异性(P>0.05)。见图6。

图6 P38、ERK、P-ERK蛋白的表达

2.7 ZJYXD通过ANRIL促进骨折愈合,增加骨量

X-ray可见,与NC组对比,NC+ZJYXD组骨折后愈合能力增强,骨痂较厚,ANRIL组愈合能力较弱;与NC+ZJYXD组对比,ANRIL+ZJYXD组愈合能力减弱,骨痂形成量较少,表明ANRIL的表达抑制了ZJYXD的促进骨形成作用。Micro-CT也显示出同样的结果,进一步数据测算则准确的反应了骨折断端的骨痂体积(TV)与骨量体积(BV)。这些数据表明ZJYXD促进骨折后愈合的能力被ANRIL的过表达抑制。见图7。

图7 X-ray、Micro-CT观察骨折愈合程度并分析BV与TV

3 讨论

随着现代社会的高速发展以及人口老龄化程度的不断加重,骨代谢疾病的发病率逐年增加[16]。中医学治疗骨科疾病具有独特的理论及方法,壮筋养血汤源自清·钱秀昌《伤科补要》,主要功效为养血活络,强筋壮腰,其药物组成为当归、白芍、川续断、杜仲、生地黄、川芎、红花、牡丹皮、牛膝。实验研究表明壮筋养血汤可降低NO、IL-1及iNOS的含量,从而减轻关节软骨损伤[17]。此外,临床研究显示壮筋养血汤对腰椎间盘突出症、骨关节炎、腰背痛、跟骨关节骨折亦有较好的疗效[17-19]。本研究通过实验证实6 %壮筋养血汤含药血清可以显著促进BMSCs细胞的增殖。

LncRNA相关中药作用机制是当下中医药研究的热点之一,多种中药可通过LncRNA发挥疾病治疗作用[20]。LncRNA ANRIL是众多LncRNA中的一员,位于激酶4抑制因子(INK4)位点,作为一种反义非编码RNA[21],它与众多疾病均有一定的相关性。已有研究证明LncRNA ANRIL沉默可促进牙周韧带成骨细胞的分化,促进人BMSCs细胞的增殖,抑制其凋亡[22-23]。本研究发现壮筋养血汤可以显著促进钙盐沉积与成骨分泌物的形成,同时促进成骨相关因子基因及蛋白的表达,进一步研究发现壮筋养血汤可以降低ANRIL mRNA表达,过表达ANRIL则导致壮筋养血汤成骨及矿化结节形成能力减弱,抑制成骨相关转录因子基因及蛋白的表达,这些研究结果表明壮筋养血汤可能通过LncRNA ANRIL发挥成骨作用。

骨代谢疾病的发生不仅与成骨细胞减少相关,还与骨髓中脂肪细胞增加有关[24]。因此增加成骨细胞形成,抑制脂肪细胞生成,对于防治骨质疏松症等一系列骨代谢性疾病具有重要的意义[25]。本研究发现壮筋养血汤可抑制成脂细胞中的脂滴形成,并且降低成脂相关因子基因及蛋白的表达量,过表达ANRIL后壮筋养血汤抑制成脂细胞能力减弱,这些结果表明壮筋养血汤通过抑制ANRIL能够促进成骨细胞形成,同时抑制成脂细胞的增殖。体内实验也验证了以上结论,X-ray与Micro-CT均显示壮筋养血汤可提高骨折后愈合程度,过表达ANRIL则会导致愈合缓慢。由此可见壮筋养血汤对BMSCs成骨和成脂具有双向影响,促进BMSCs成骨分化的同时又在抑制成脂分化,且这种影响是通过调控ANRIL实现。

MAPK信号通路在骨代谢疾病进程中具有促进成骨细胞增殖分化的作用[26]。MAPK信号通路主要由p38 MAPK、ERK1/2、ERK5等组成[27]。研究表明LncRNA ANRIL通过MAPK信号通路调节肿瘤的发生发展[11-12], ANRIL通过调节RAS/RAF/ERK信号通路促进动脉粥样硬化进展,同时有研究证实激活MAPK通路会诱导成骨的生成,加入抑制剂后会增加脂肪细胞的生成[28-29]。据此,笔者推测壮筋养血汤可能通过LncRNA ANRIL介导的MAPK/ ERK信号通路发挥作用。通过本研究发现,壮筋养血汤可以显著增强P38、P-ERK的表达,过表达ANRIL则抑制其表达。以上实验结果证实壮筋养血汤通过LncRNA ANRIL介导的MAPK/P38-ERK通路调控BMSCs成骨成脂分化。

综上所述,本研究通过体外、体内实验证实了壮筋养血汤具有促进成骨的生成、抑制成脂分化的作用,而这种作用是通过LncRNA ANRIL调控MAPK/P38-ERK信号通路实现的。本次研究为壮筋养血汤治疗骨代谢疾病提供了重要的实验依据,拓宽了临床治疗骨代谢疾病的思路。