电针联合延胡索水提物对绝经后骨质疏松大鼠的改善作用

温志刚 路帅 马欣

1. 河北省中医院骨伤二科,河北 石家庄 050000

2.石家庄市中医院,河北 石家庄 050000

3.河北省第八人民医院,河北 石家庄 050000

绝经后骨质疏松症是一种被认为与卵巢激素缺乏相关的骨质疏松症,是迄今为止与年龄相关的骨质流失的最常见原因。目前西医主要以雌激素替代疗法为主,但存在不良反应多、致癌风险高等缺点。电针作为一种特定的中医疗法,是在普通针灸的基础上使用现代技术来模拟医者完成相应的运针并给予患者长时间规律的电刺激,具有操作方便、无副作用等优点,在临床上得到广泛应用[1]。电针在骨质疏松症中的治疗效果已被大量临床和动物实验研究所证实。将针灸疗法与药物治疗结合起来已成为目前临床上治疗骨质疏松症的研究热点。延胡索是罂粟科细紫堇属植物的干燥块茎,也被称为“元胡”。作为传统中药,延胡索有行气活血、化瘀通络的功效。包含延胡索的中药制剂已被用于治疗腰椎间盘突出、风湿性关节炎和颈椎病[2]。现代药理学研究[3]发现,延胡索的主要化学成分是生物碱,具有抗炎、抗肿瘤、抗凋亡和镇痛等多种生物学作用。Ling等[4]发现,延胡索提取物通过抑制细胞凋亡来减少心肌缺血再灌注大鼠的心脏功能。Wang等[5]发现,延胡索提取物巴马汀通过抑制炎症小体的活化和半胱天冬酶-1的形成来减轻痛风性关节炎的炎症反应。然而,延胡索水提物在骨质疏松症中的作用及相关机制尚未明确。本研究探讨了电针联合延胡索水提物对骨质疏松大鼠的保护作用,并初步探究其可能的潜在机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物:48只成年雌性SD大鼠购自购自华兰生物工程股份有限公司[许可证号SYXK(豫)2018-0014],体重300～330 g,8～10周龄。将大鼠饲养在标准实验室条件下,自由获取食物和水,室温为22 ℃,湿度约为45 % ～ 55 %。所有实验程序均经本院伦理委员会批准,并按照国家有关规定进行。动物伦理审查号为(院科伦审:AEWC -2001281)。

1.1.2药物及试剂:延胡索中药饮片购自张仲景大药房,经河南食品药品检验所检验为真品。IP细胞裂解液(货号P0013)、蛋白浓度测定试剂盒(货号P0010)购自碧云天生物技术研究所;抗GSK-3β抗体(货号ab93926)、抗DVL抗体(货号ab233003)、抗Runx2抗体(货号ab236639)、抗Wnt3a抗体(货号ab219412)、抗β-catenin抗体(货号ab68183)、抗GAPDH抗体(货号ab9485)购自美国Abcam公司。骨保护素(Osteoprotegerin,OPG;货号MOP00)和核因子-κB配体的受体激活剂(Receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL;货号462-TR)酶联免疫吸附试剂盒购自美国R&D Systems公司;酶联免疫检测仪(DNM9606)购自北京普朗新技术有限公司。SDZ-III型华佗牌电子针疗仪购自苏州医疗用品厂有限公司;MEDIX90双能X线骨密度检测仪购自法国奥斯托公司。

1.2 方法

1.2.1延胡索有效成分的提取及处理:延胡索提取物采用水提方式制备,方法如下:取延胡索中药饮片500 g,加入1 800 mL水,大火烧开后浸泡1 h,再次大火烧开后,文火煮1 h。静置冷却至室温后,经100目滤布过滤收集水提液。经高效液相色谱(HPLC)分析发现,延胡索水提取物的主要成分详见图1。

图1 延胡索水提物的HPLC图

1.2.2骨质疏松症模型及分组:采用双侧卵巢切除法[6]制备骨质疏松症大鼠模型,共40只。简而言之,用2 %戊巴比妥钠麻醉大鼠,然后切除两个卵巢。同时,Sham组(假手术组,8只)的大鼠只切除了卵巢附近的脂肪组织。手术后,以青霉素5万 U/d的剂量进行肌肉注射,每次持续3 d。手术一周后,将卵巢切除大鼠随机分为五组(每组8只):模型组、雌二醇组、电针组、延胡索组和针药组。

1.2.3干预方法:按照人鼠等效剂量,雌二醇组给予戊酸雌二醇50 μg/(kg·d)灌胃,每天一次。电针组根据参考文献[7]取穴,将毫针刺入肾俞穴、三阴交穴、关元穴和足三里穴后,连接电针仪,连续波、设置刺激强度2 mA,2 Hz/100 Hz,每次15 min,每天一次。延胡索组给予延胡索水提物灌胃治疗,根据参考文献[8],选择剂量为0.5 g/kg。针药组先通过灌胃延胡索水提物0.5 g/kg,间隔15 min后进行电针治疗,处理方法同上。Sham组和模型组每日给予等体积生理盐水。连续治疗12周。

1.3 标本采集

治疗结束后,将大鼠经腹腔注射3 %戊巴比妥钠(每100 g体质量0.1 mL)麻醉后,腹主动脉取血,3 000 r/min离心10 min后将血清置于- 20 ℃保存。大鼠放血致死后,剥离大鼠右侧股骨远端干骺端、右侧股骨组织以及股骨远端部分骨组织,一部分置于10 % EDTA溶液(pH 7.4)中在4 ℃下固定3周,用于观察骨组织形态;另一部分置于- 80 ℃保存,用于蛋白免疫印迹分析。

1.4 检测指标

1.4.1骨密度测定:使用骨密度仪扫描剥离的大鼠右侧股骨远端干骺端,记录各组大鼠的骨密度(bone mineral density, BMD)值。

1.4.2骨组织形态及骨小梁微结构测定:将经DETA溶液固定的股骨组织脱钙后,用石蜡包埋,并在冠状面切割成3 μm厚的切片。切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水合、行常规苏木精-伊红(HE)染色后,于显微镜下观察组织形态学变化,并进行定性分析。通过微型CT测量胫骨远端结构,测量的参数包括骨小梁的平均厚度(Tb.Th)、骨小梁面积百分比(Tb.Ar,%)、骨小梁数量(Tb.N)和骨小梁分离度(Tb.Sp)。具体操作根据CT操作手册进行。

1.4.3酶联免疫吸附测定(ELISA):根据ELISA试剂盒说明书检测血清中骨特异性碱性磷酸酶(bone-specific alkaline phosphatase,BALP)、核结合因子-α1(core-binding factor subunit- α1,CBF-α1)、I型前胶原氨基端前肽(precollagen type I amino-terminal prepropeptide,PINP)、骨钙素(osteocalcin,OC)、骨保护素(osteoprotegerin,OPG)和核因子-κB配体的受体激活剂(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)的含量。

1.4.4蛋白免疫印迹分析:将骨组织用含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液裂解。将裂解物以12 000g离心15 min。收集上清液,使用双辛可宁酸定量测定法测定蛋白质浓度。将蛋白质与负载缓冲液混合,并在100 ℃下孵育6 min。将等量的蛋白质(50 μg)进行10 %十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳,然后转移至孔径为0.45 μm的聚偏氟乙烯膜上。将膜与抗Runx2、抗Wnt3a、抗β-catenin、抗GAPDH抗体于4 ℃下孵育过夜。洗涤后,将膜与二级抗体辣根过氧化物酶缀合的抗小鼠(或兔)IgG在室温下孵育1 h。ECL试剂显影后,使用Image Lab软件对免疫反应带的像素强度进行量化。以GAPDH作为内部参照。

1.5 统计分析

2 结果

2.1 体重和骨密度的比较

治疗前,各组之间大鼠的体重和骨密度值均无明显差异(P>0.05)。治疗后,与Sham组相比,模型组大鼠的骨密度值明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后,与模型组相比,雌二醇、电针、延胡索、针药组大鼠的骨密度值明显升高,且针药组大鼠的骨密度值显著高于电针组和延胡索组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠治疗前后体重和骨密度的比较

2.2 骨组织形态及骨小梁微结构参数的比较

如HE染色所示(图2),Sham组显示出完整的骨小梁结构,且骨小梁排列有序、直径正常、罕见空骨陷窝。与Sham组相比,模型组骨小梁结构紊乱、骨小梁变薄,且空骨陷安窝增加,并观察到轻微骨折。与模型组相比,雌二醇、电针、延胡索、针药组的骨组织形态损伤明显减轻。进一步比较骨小梁微结构参数发现(表2),与Sham组相比,模型组大鼠的Tb.Th、Tb.Ar和Tb.N均明显降低,而Tb.Sp明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。干预12周后,与模型组相比,雌二醇、电针、延胡索、针药组大鼠的Tb.Th、Tb.Ar和Tb.N均明显增加,而Tb.Sp明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。此外,针药组的干预效果明显优于电针组和延胡索组,差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组大鼠治疗后骨小梁微结构参数的比较

图2 各组大鼠股骨组织HE染色(×400)

2.3 骨代谢标志物的比较

与Sham组相比,模型组大鼠骨代谢标志物BALP、CBF-α-1、PINP和OC含量均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。干预12周后,与模型组相比,雌二醇、电针、延胡索、针药组大鼠的BALP、CBF-α-1、PINP和OC水平均明显升高,且针药组大鼠骨代谢标志物水平显著高于电针组和延胡索组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠治疗后骨代谢标志物含量的比较

2.4 各组大鼠血清OPG和RANKL水平的比较

与Sham组相比,模型组大鼠血清OPG水平明显降低,而RANKL水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后,与模型组相比,雌二醇、电针、延胡索、针药组大鼠血清OPG水平明显升高,而RANKL水平明显降低(P<0.05)。针药组血清OPG水平明显高于、RANKL水平明显低于电针组和延胡索组(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠血清OPG和RANKL水平的比较

2.5 各组大鼠股骨远端骨组织中Runx2、Wnt3a和β-catenin蛋白表达的比较

与Sham组相比,模型组大鼠骨组织中Runx2、Wnt3a和β-catenin蛋白表达明显降低,而GSK-3β和DVL1蛋白表达显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,雌二醇、电针、延胡索、针药组大鼠骨组织中Runx2、Wnt3a和β-catenin蛋白表达明显升高,而GSK-3β和DVL1蛋白表达显著降低,且针药组Runx2、Wnt3a和β-catenin蛋白的表达显著高于电针组和延胡索组,而GSK-3β和DVL1蛋白表达显著低于电针组和延胡索组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3、表5。

表5 各组大鼠股骨远端骨组织中Runx2、Wnt3a和β-catenin蛋白表达的比较

图3 蛋白免疫印迹检测股骨远端骨组织中GSK-3β、DVL1、Runx2、Wnt3a和β-catenin蛋白的表达

3 讨论

针灸和中药作为中医学的两大疗法,被广泛用于疾病的治疗。电针作为一种改良的针灸方法,其原理是调节阴阳、消除气滞和气血瘀的通道和侧支。基于中医学原理,肾俞穴、三阴交穴、关元穴和足三里穴是预防和治疗绝经后妇女骨质疏松症最常用的传统穴位[9]。动物研究[10]表明,电针预处理可防止卵巢切除术导致的骨丢失和骨结构恶化,并促进骨愈合和骨痂形成。此外,电针刺激不仅可以增加骨密度,还可以防止卵巢切除引起的骨质流失[11]。延胡索作为传统中药之一,其水提物中含多种化学成分,其中延胡索乙素、脱氢紫堇碱、盐酸小檗碱等都被证实是钙离子拮抗剂[12]。研究[13]已证实,口服延胡索提取物能够降低大鼠耳朵肿胀,提示其具有良好的抗炎作用。此外,延胡索提取物在多种肿瘤细胞中的抗癌细胞增殖作用也被证实[14]。然而,延胡索提取物在骨质疏松症中的作用尚未见报道。本研究发现,电针刺激和延胡索水提物治疗均能够减轻骨组织形态损伤和骨小梁结构损伤,提示电针和延胡索水提物治疗能够改善骨质疏松症中发生的病理变化。PINP、CBF-α1和OC的水平降低会影响骨代谢过程中的骨形成[7]。本研究发现电针和延胡索水提物治疗均能够增加骨质疏松症大鼠血清ALP和BGP水平、增加骨密度,提示电针和延胡索水提物能够改善骨代谢。

目前研究认为,针药并用能够在保证治疗效果的基础上减轻针灸的刺激量、降低药物的毒副作用[15]。本研究中电针与延胡索水提物联用能够发挥出比单独治疗更好的抗骨质疏松症效果。既往研究[16]指出,电针能够提高中药作用的敏感性和靶向性。一项荟萃分析[17]显示,电针与中药或西药结合可以改善单一干预方式的不足之处,提高整体疗效。基于既往研究推测,电针刺激“肾俞穴”“三阴交穴”“关元穴”和“足三里穴”可治本扶正、益肾调经,防止卵巢切除术导致的骨丢失和骨结构恶化;延胡索提取物可减轻促使骨质疏松发生的病理因素;二者结合在治疗骨质疏松症时可起到协同增效作用。

绝经后骨质疏松症的致病机制十分复杂,与多种细胞信号转导途径有关。OPG/RANKL系统是骨生物学史上最重要的发现之一,被证明参与了骨代谢的调节[18]。RANKL作为肿瘤坏死因子配体家族的膜结合分子,参与促进破骨细胞的形成并抑制成骨细胞的增殖和分化,为破骨细胞祖细胞提供重要信号[19]。RANKL与其受体结合,诱导破骨细胞生存和成熟破骨细胞活化。OPG是RANKL的诱饵受体,由成骨细胞合成和分泌。其通过阻断RANKL与其受体之间的相互作用,抑制破骨细胞的形成和成熟破骨细胞的活化。本研究发现,电针和延胡索水提物治疗导致OPG表达上调、RANKL表达上调。基于既往研究推测电针和延胡索水提物可能通过激活成骨细胞的形成并抑制破骨细胞的形成,从而改善卵巢切除术诱导的骨质疏松症。

Wnt/β-catenin信号通路在骨生长和骨重塑的调节中发挥关键作用[20]。Wnt信号缺失时,GSK-3β、酪蛋白激酶1(CK1)和轴蛋白(Axin)会构成降解复合物,介导β-catenin的泛素化和降解。在异常持续激活时,Wnt配体与细胞表面卷曲蛋白和低密度脂蛋白受体相关蛋白组成的受体复合物相互作用,经DVL传递信号后,导致降解复合物的失活,进而抑制β-catenin的降解。β-catenin是Wnt信号通路经典途径的核心蛋白分子。β-catenin在细胞核中积累,并与淋巴增强子结合因子-1/转录因子结合,以上调Wnt靶基因的表达,如Runx2,进而引发多种效应,包括成骨细胞的增殖和分化。靶向Wnt/β-catenin信号途径已成为骨质疏松靶向治疗的研究热点之一。范怀玲等[21]发现,电针刺激能够激活Wnt/β-catenin信号通路来改善骨质疏松。与既往研究一致,本研究也发现电针治疗能够上调Runx2、Wnt2a和β-catenin的表达,并下调GSK-3β和DVL1的蛋白表达,提示其对Wnt信号途径的激活。此外,延胡索水提物治疗也能够激活Wnt信号途径,且电针与延胡索水提物联合治疗对Wnt信号途径的激活效应比单一处理更明显。基于这些研究,推测电针和延胡索水提物联合能够协同增效,至少部分是激活Wnt/β-catenin通路来抑制卵巢切除术诱导的骨质疏松症。

综上所述,本研究发现,电针刺激与延胡索水提物联合治疗能够减少骨质疏松症大鼠的骨量损失、增加骨密度、改善骨组织的微观结构和骨代谢,从而减轻卵巢切除术诱导的骨质疏松症,其可能是通过调控OPG/RANKL和Wnt/β-catenin途径来实现。此外,电针刺激与延胡索水提物结合能够起到协同增效作用,这一新发现可能为骨质疏松症的治疗提供新思路。然而,考虑到临床应用中患者需接受长时间电针刺激,可能存在依从性较差的缺点,因此仍需结合临床病例进行深入研究。