广金钱草乙醇提取物不同极性部位抗氧化抗菌活性研究

刘 婷，刘平平，胡深德，成莹莹，陆 俊

（1.中国检验认证集团湖南有限公司，湖南 长沙 410021；2.中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南 长沙 410004）

广金钱草（Desmodium styracifo Lium,(Osb.)Merr）又名假花生、马蹄金、铜草、落地草，为豆科山蚂蟥属植物。国内主要产地为两广地区、福建和湖南等省区也有较为广泛的分布，国外东南亚地区的越南、缅甸、印度等国也有较为普遍的生长[1]，是一种常用的中药材，全草可供药用，能清热利尿、抗炎解毒、抗菌利胆、清除结石，常用于医治尿路感染、黄疸、泌尿系结石、胆囊结石等[2-4]，日常作为泡茶使用，广金钱草中含有多糖成分，可以显著增强输尿管上段的腔内的压力，有显著的利尿作用，广金钱草中的黄酮能够明显增加心肌营养性血流量[5]。

广金钱草是一种比较传统的中药，近年来国内外有关广金钱草的研究主要集中在指纹图谱、药材质量评价及其临床应用方面[6-7]。已有研究报道其含有黄酮类、酚类、萜类、甾醇、苷类等成分[8-10]。但对于不同极性部位的活性成分及其抗氧化、抑菌活性的研究鲜见报道。对广金钱草进行超声提取和运用不同极性溶剂进一步萃取，考查其抗氧化和抑菌活性，明确广金钱草抗氧化活性部位和成分奠定基础，以期能够为广金钱草的开发利用提供更加科学的依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与设备

广西广金钱草产自南宁；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、三氯化铝、芦丁、三氯化铁等碳酸钠，国药集团化学试剂有限公司提供；福林酚、没食子酸，上海源叶生物技术公司提供；大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌菌种，中南林业科技大学食品科学与工程学院微生物实验室提供。

JP-150A-8 型高速多功能粉碎机，永康市久品工贸有限公司产品；JRC-2000 型超声波清洗机，济宁市润通超声电子有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 广金钱草乙醇提取物的制备

将广金钱草于50 ℃烘箱中烘干至恒质量，然后用粉碎机中粉碎，过40 目筛待用。广金钱草乙醇提取物的制备参考文献[11]并加以适当修改，称取10 g金钱草细粉于具塞锥形瓶中，加150 mL 配制好的50%乙醇，等待1 h，置于超声波清洗机中，在50 ℃条件下提取45 min，提取液用高速离心机以转速12 000 r/min 离心10 min，收集上清液，残渣再加50%乙醇150 mL 超声提取45 min 后离心。重复此步骤3 次，合并3 次离心的上清液备用。

1.2.2 广金钱草不同极性部位的制备

将超声提取的广金钱草溶液，于温度40 ℃，0.1 MPa下进行减压旋转蒸发去除乙醇，然后将浓缩液溶于250 mL 水后依次用250 mL 的石油醚、乙酸乙酯和水饱和正丁醇分步重复萃取2 次，合并各部位萃取液并于40 ℃，0.1 MPa 条件下进行减压旋转蒸发去除溶剂，预冻后放于真空冷冻干燥机中进行真空冷冻干燥，分别计算不同极性部位的得率。

1.2.3 广金钱草总酚含量的测定

按照福林- 酚试剂比色法[12]进行多酚含量的测定，具体试验方式如下：分别吸取0.1 mg/mL 没食子酸溶液0，150，250，500，750，1 000 μL 于5 个标号的试管中，加蒸馏水至23 mL，每管再加入500 μL 的福林酚试剂和300 μL 的质量分数为10%的碳酸钠溶液反应30 min 后，于最高吸收峰波长760 nm 处测定吸光度。多酚含量为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。准确吸取1 mL 的各待测样液，进行以上相同操作，平行测定3 次，记录相应吸光度，通过标曲计算出样品中多酚含量（mg GAE/g）。

1.2.4 广金钱草总黄酮含量的测定

参考Acácio A F Z 等人[13]方法测定广金钱总黄酮含量，称取5 mg 儿茶素，加超纯水定容至25 mL，配制成质量浓度为0.2 mg/mL 的儿茶素标准液，并将其稀释为6 个不同质量浓度的儿茶素溶液（准确吸取0，50，100， 150，200，250 μL 的儿茶素标准液），分置于试管中，加30%乙醇至2 970 μL，然后加入质量分数为5%的亚硝酸钠溶液120 μL，反应5 min 后，再加入质量分数为10%的FeCl3溶液120 μL 放置5 min，加入质量分数为4%的NaOH 溶液800 μL，摇匀。测定波长510 nm 处吸光值。以吸光度为纵坐标，儿茶素含量为横坐标，制成标准曲线。将广金钱草醇提物用50%乙醇稀释，配制成一定浓度的待测液，准确吸取待测液250 μL 于试管中，按上述标曲的方法来测定待测液的吸光度，根据标曲计算得待测液中的黄酮含量（mg CE/g）。

1.2.5 DPPH 自由基清除活性

参考文献[14]经过适当修改测定DPPH 自由基清除活性。操作方法如下：用移液枪精密吸取100 μmol/L Trolox 0，50，100，150，200，250，300 μL，加80%甲醇至300 μL，然后加入浓度为0.094 μmol/L的DPPH 溶液1 900 μL ，放置于37 ℃恒温水浴锅中等待30 min，测定波长517 nm处的吸光度。以Trolox 含量为横坐标，吸光度为纵坐标作标准曲线。按上述方法测定样品液的吸光度，并根据标曲计算其抗氧化能力（μmol TE/g）。

1.2.6 ABTS 自由基清除活性

参考文献[15]测定广金钱草醇提物ABTS 自由基清除活性。具体方法为：将浓度为7.4 mmol/L 的ABTS 溶液与浓度为2.45 mmol/L 的过硫酸钾溶液按1∶1 等体积混合，避光、棕色瓶中保存12～16 h 制成ABTS 原液，将ABTS 原液于波长734 nm 处测定吸光度，用无水乙醇不断减小浓度至其吸光度为0.70±0.02，即可得到现配好的稳定的ABTS·+溶液。于试管中吸取4 000 μL 的ABTS·+溶液分别加入1 000 μL的提取液、Trolox 标准液（0，4，8，10， 12，14，16 μmol/L） 并做好标记，溶液混合均匀后于波长734 nm 处利用紫外分光光度计进行测定，无水乙醇作为空白对照。以Trolox 含量为横坐标，吸光值为纵坐标作标准曲线。按上述方法测定样品液的吸光度，并根据标准曲线计算其抗氧化能力（μmol TE/g）。

1.2.7 FRAP 法测定抗氧化活性

参考文献[16]经过适当修改进行铁离子还原能力的测定。具体方法为：依次吸取100 μmol/L Trolox（80%甲醇配制） 180，360，450，540，630，720，900 μL，加入2.7 mL 的FRAP 试剂和270 μL 的去离子水，然后放置于37℃恒温水浴锅中等待30 min，使用紫外分光光度计测定波长595 nm 处的吸光度，以蒸馏水作为空白对照。以Trolox 含量为横坐标，吸光值为纵坐标作标准曲线。按上述方法测定样品液的吸光值，并根据标准曲线计算其抗氧化能力。

1.2.8 抑菌圈直径的测定

参考文献[17]的方法将广金钱草各部位萃取物用无菌蒸馏水和二甲基亚砜（1%） 配制成质量浓度为400，200，100 mg/mL 的样品溶液备用。在超净工作台上，取20 mL 灭菌后的营养琼脂培养基倒入经过高温高压灭菌后的培养皿中，待培养基凝成固体后，分别将培养好的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌3 种菌用无菌蒸馏水调配成含量为1.5×107个/mL的菌悬液，精确移取菌悬液20 μL 置于平板中涂布均匀，之后用挖孔器挖4 个孔，于孔中加30 μL 不同浓度样品液，于温度37 ℃下培养24 h，用游标卡尺精确测量每个平板的抑菌圈直径。

1.2.9 最小抑菌浓度（MIC） 的测定

参照文献[18]的方案经修改，采用微量营养肉汤稀释的方法测定广金钱草各萃取物最小抑菌浓度。于96 孔板每孔中加80 μL 营养肉汤培养基，A 行加入质量浓度为200 mg/mL 的各待测样品80 μL，混匀并吸取80 μL 于B 行混匀，重复此操作至G 行，以此对待测样品进行2 倍稀释，留H 行作为对照组（A～H 行各待测广金钱草萃取物质量浓度按顺序为100，50，25，12.5，6.25，3.125，1.625，0 mg/mL）。于1～4 列加入金黄色葡萄球菌、5～8 列加入大肠杆菌、9～12 列加入沙门氏菌，3 种菌液各10 μL，于37 ℃下培养22 h 后加6.25 mg/mL 刃天青钠溶液10 μL，反应一段时间后观察抑菌效果，以肉眼观察样品最低浓度管中无细菌生长者（未变为粉红色）为该试验样品的MIC。

1.2.10 数据分析

所有的测定都需要做3 次平行，试验的数据记录为平均值±标准偏差（SD）。然后使用SPSS 20.0软件进行相关的统计及分析，使用Spearman 相关系数进行相关性的检测，当p＞0.05 时，表示无显著性差异；p＜0.05 时，表示有显著性差异；p＜0.01 时，表示有极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 总酚、黄酮及抗氧化活性的标准曲线

标准曲线见图1。

图1 标准曲线

由图1 可知，用于测定多酚的没食子酸标准曲线、用于测定黄酮的儿茶素标准曲线、用于测定抗氧化活性的DPPH、FRAP、ABTS 的Trolox 当量标准曲线分别对应图A、B、C、D、E，其R2的范围均在在0.999～1.000，线性相关性良好。

2.2 广金钱草醇提物及各萃取部位的得率

用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇对广金钱草50%乙醇提取物浓稠浸膏进行萃取，冷冻干燥后，称质量并按照公式进行计算，得出个萃取部位的得率分别为石油醚部位：（16.72±1.01）%、乙酸乙酯部位：（10.98±0.87）%、正丁醇部位：（24.39±1.41）%、水部位：（46.21±3.21）%，其中乙酸乙酯部位得率最低，水部位得率最高，符合一般植物不同极性溶剂萃取特点。

2.3 总酚、黄酮含量及抗氧化活性

广金钱草不同极性萃取部位的多酚、黄酮含量见图2。

图2 广金钱草不同极性萃取部位的多酚、黄酮含量

结果表明，广金钱草醇提物中的总酚含量为（7.074±0.312） mg GAE/g，总黄酮含量为（9.038±0.261） mg/g。经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取后，多酚、黄酮富集后的含量均有显著性提高，并且含量均为乙酸乙酯部位＞正丁醇部位＞石油醚部位＞水提取部位＞醇提物，特别是乙酸乙酯部位，多酚含量达到（13.190±0.072） mg CE/g，是醇提物的1.87 倍；黄酮含量达到了（80.697±0.121） mg CE/g，是醇提物的8.93 倍，远远高于醇提物中的含量，表明广金钱草中的活性物质主要存在于乙酸乙酯部位中。

广金钱草不同极性萃取部位的抗氧化活性见图3。

图3 广金钱草不同极性萃取部位的抗氧化活性

DPPH 自由基清除活性在（98.844±1.193）～（121.929±0.556）μmol TE/g。石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位的DPPH 自由基清除活性均有显著性差异（p＜0.05），而对于铁离子还原能力和ABTS 自由基清除活性，石油醚、乙酸乙酯部位和正丁醇部位抗氧化活性无显著性差异，且这3 个部位均显著高于水部位抗氧化活性。铁离子还原能力在（151.305±1.424） ～（209.066±1.576） μmol TE/g，ABTS 自由基清除能力在（32.455±0.929） ～（74.414±2.029） μmol TE/g。3 种抗氧化活性均呈现出乙酸乙酯部位＞正丁醇部位＞石油醚部位＞水部位的规律。由此可见，广金钱草醇提物的乙酸乙酯萃取部位的抗氧化活性效果最好，而剩余水相部位的抗氧化活性最差。可能是乙酸乙酯和正丁醇部位含有较多多酚和黄酮的原因，其作用机制通过黄酮类、多酚、多糖等多种生物活性成分发挥出来[19]。广金钱草总黄酮类活性成分对黄嘌呤—黄嘌呤氧化酶体系产生的O2-、-OH 有非常好的清除效果，且用量与清除作用呈显著的正相关[20]。广金钱草中的酚酸类成分主要有绿原酸[21]、水杨酸、阿魏酸、升麻酸、香草酸、3,4 - 二甲基苯酚[22]等酚酸类化合物。其黄酮物质主要为黄酮碳苷化合物，分别为夏佛塔苷[10]、异牡荆素、木樨草素、异荭草素、文赛宁、6-C- 木糖-8-C- 葡萄糖洋芹素、6-C- 葡萄糖-8-C- 木糖洋芹素、芹菜素[3，10]。

2.4 广金钱草醇提物不同极性部位抑菌活性

2.4.1 抑菌圈直径测定结果

广金钱草不同极性萃取部位的抑菌圈直径见表1。

表1 广金钱草不同极性萃取部位的抑菌圈直径

当广金钱草萃取物的测试质量浓度为100～400 mg/mL 时，对沙门氏菌的抑菌圈直径：乙酸乙酯部位＞正丁醇部位＞石油醚部位＞水部位；对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径：乙酸乙酯部位＞石油醚部位＞正丁醇部位＞水部位，低质量浓度的广金钱草水部位萃取物对金黄色葡萄球菌没有抑菌活性，只有当其质量浓度为400 mg/mL 时，广金钱草水部位萃取物对金黄色葡萄球菌才有一定的抑菌活性，广金钱草石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位萃取物在其质量浓度为400 mg/mL 时，其对沙门氏菌的抑菌圈直径依次达到了14.42，16.32，15.60，14.04 mm，其对金葡的抑菌圈直径依次达到了12.16，13.10，10.16，8.38 mm。由此可见，各萃取部位对沙门氏菌的抑菌效果最好，而对大肠杆菌的抑菌效果最差。乙酸乙酯部位和正丁醇部位对沙门氏菌均有高敏感的抑菌效果，石油醚部位和乙酸乙酯部位对金黄色葡萄球菌的抑制效果较好。综合来讲，广金钱草萃取物对沙门氏菌的抑菌效果好于金黄色葡萄球菌的抑菌效果好于大肠杆菌的抑菌效果。

2.4.2 广金钱草不同极性部位的最低抑菌浓度

广金钱草不同极性部位对的最小抑菌浓度见表2。

表2 广金钱草不同极性部位对的最小抑菌浓度

由表2 可知，不同极性部位对其都具有较好的抑菌效果，石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位对于金黄色葡萄球菌的最小抑菌质量浓度分别为6.25，6.25，12.50，25.00 mg/mL；对于大肠杆菌的最小抑菌质量浓度为50，25，50，50 mg/mL；对于沙门氏菌的最小抑菌质量浓度为6.25，6.25，3.13，25.00 mg/mL。由此可知，对石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位这4 种极性溶剂萃取物最不敏感的菌株是大肠杆菌，而金黄色葡萄球菌和沙门氏菌对这4 种极性部位的敏感性则较高。具有一定的应用潜力。动物试验研究[23]表明，复方广金钱草颗粒对变形杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果是最明显的，MIC 为4.5%（药物浓度在培养基中的比例）；对绿脓杆菌和大肠杆菌有一定程度的抑菌效果，MIC 分别为18.0%和9.0%。复方广金钱草颗粒对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌都有非常明显的抑制细菌生长的效果，而且安全剂量的范围很大。用方金钱草颗粒对小白鼠进行灌喂的急性毒性试验，该试验最后未观察到比较显著的毒性反应，最大耐受为157.5 g/kg。这些抑菌活性的物质基础则很大可能是由于其含有丰富的多酚类化合物。

3 结论

主要研究了广金钱草醇提物及其不同极性萃取部位的抗氧化活性物质和抗氧化活性。50%乙醇提取物中的总多酚含量为（7.074±0.312） mg/g，总黄酮含量为（9.038±0.261） mg/g。经石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇依次萃取后，萃取部位的多酚、黄酮含量均有显著性提高，并且含量均为乙酸乙酯部位＞正丁醇部位＞石油醚部位＞水部位＞醇提物，表明广金钱草中的活性物质主要存在于乙酸乙酯部位中。3 种体外抗氧化活性评价结果也以广金钱草醇提物的乙酸乙酯萃取部位的抗氧化活性效果最好，而剩余水相部位的抗氧化活性最差。广金钱草不同极性萃取部位的多酚、黄酮含量及抗氧化活性均为乙酸乙酯部位＞正丁醇部位＞石油醚部位＞水部位，在趋势上呈现明显的正相关性，多酚、黄酮含量越高，抗氧化活性越好。抑菌试验表明，广金钱草不同极性萃取物的抑菌圈直径乙酸乙酯部位＞正丁醇部位＞石油醚部位＞水部位，抑菌效果为沙门氏菌＞金黄色葡萄球菌＞大肠杆菌。综合来说，乙酸乙酯部位的抑菌效果要好于其他部位，且抑菌效果随着萃取物浓度的增大而增大。后续可通过液质手段进一步对不同极性部位具体化学组成成分进行鉴定，利用动物模型考查其体内抗氧化和抑菌活性。