自噬在脑缺血-再灌注损伤中的研究进展

贺 乾 李东芳 薛村水

山西医科大学，山西 太原 030000

脑血管病已成为最主要的死亡原因，在缺血性脑血管病的治疗中，再灌注治疗是首选的治疗策略。缺血的脑组织在恢复血流的过程中可能会造成一定程度的脑损伤，甚至出现更严重的并发症，这一过程称之为脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia-reperfusion injury，CI/RI）。自噬（Autophagy）是在真核生物中普遍存在的依赖溶酶体的一种细胞降解回收系统，具有代谢应激适应、干细胞分化、免疫调节和疾病调节等功能。研究表明，自噬参与了脑缺血-再灌注损伤的过程。本文总结了巨自噬调控脑缺血-再灌注损伤的可能机制，阐明了自噬在脑缺血-再灌注损伤中的作用，从而为卒中的治疗选择提供新的线索。

1 脑缺血-再灌注损伤

脑缺血-再灌注损伤是指缺血的脑组织在恢复血供后出现更为严重的神经功能损伤。脑血流中断后，由于无氧代谢时细胞内ATP 减少，依赖ATP 酶的离子转运机制失衡，导致钙超载、细胞肿胀和破裂，以及通过坏死、凋亡和自噬等机制导致的细胞死亡［1］。虽然再灌注后血流和氧气恢复，但在脑缺血过程中会产生大量活性氧，与此同时中性粒细胞也会进入缺血组织加重缺血损伤，最终导致线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）开放和进一步的不可逆损伤［2］。缺血引起的原发性损伤已经无法恢复。当脑血流恢复后，再灌注引起的继发性脑损伤可导致各种神经毒性因子的释放，炎症扩大，脑微环境紊乱［3］。所有这些因素相互作用，导致一连串脑组织损伤、血脑屏障破坏、神经功能减弱，最终导致患者预后不良。其主要机制可能包括氧化应激、内质网应激、神经炎症、线粒体功能障碍、细胞凋亡等［4］。由于脑缺血-再灌注损伤机制繁多且尚不清楚，进一步研究其内在机制具有重要意义。

2 自噬

自噬是细胞受到外界条件刺激或内部条件变化时将错误折叠的蛋白质、DNA、受损细胞器以及脂类等细胞质成分在自噬体囊泡中包裹并被传送至溶酶体/液泡中从而进行降解和循环利用的过程［5］。在维持细胞内稳态、参与免疫反应和代谢调节等方面有至关重要的作用。生理情况下，自噬对人体内环境的稳态和细胞的生命活动起重要作用。研究表明，自噬与自身免疫病、感染、肿瘤、代谢性疾病均有密不可分的关系［6］。在神经系统疾病中，自噬与脑血管病、神经退行性疾病、脱髓鞘疾病均有一定联系［7-9］。根据自噬发生的机制和功能不同，自噬可以分为：巨自噬（本文简称自噬）、微自噬、分子伴侣介导的自噬。巨自噬主要包括诱导、成熟、转运和降解四个阶段。首先，在蛋白质和细胞器周围会形成一种叫做吞噬胞体的开放双膜结构。膜主要来源内质网、线粒体和高尔基体。然后，吞噬体将扩展并融合形成自噬体。在这一过程中，许多蛋白质调节自噬体形成的起始，如VMP1、Atg14和Beclin1-PI3K复合体。自噬体成熟过程中涉及两种泛素样蛋白修饰系统：Atg5-Atg12复合体和ATG8/LC3系统。随着自噬体的扩张和封闭，自噬体经历成熟过程，包括清除ATGs蛋白、招募溶酶体传递蛋白和介导溶酶体融合蛋白。最后，成熟的自噬小体将与溶酶体融合形成自噬溶酶体，自噬溶酶体通过溶酶体酶降解老化或受损的细胞成分。微自噬是溶酶体或晚期内吞体直接吞噬降解内容物的过程，包含三种方式：溶酶体膜突起、溶酶体膜内陷和晚期内吞体膜内陷［10］。分子伴侣蛋白介导的自噬是分子伴侣蛋白HSC70介导的与溶酶体膜上的特殊受体——溶酶体相关膜蛋白Lamp2A结合，从而进入溶酶体被降解的过程。研究表明，自噬参与了脑缺血-再灌注损伤引起的神经损伤和细胞死亡［11-12］。虽然自噬在脑缺血再灌注早期可通过清除受损的细胞器和蛋白质发挥保护作用［13］，但在再灌注晚期，过度的自噬导致自噬细胞死亡，从而导致细胞和组织的后续损伤［11］。因此，通过自噬调节预防和逆转脑缺血-再灌注损伤是一个潜在的新治疗目标。

3 自噬调控CI/RI的可能机制

3.1 PI3K-Akt-mTOR通路哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin protein，mTOR）是与PI3K相关激酶家族有关的一种蛋白激酶，在参与细胞生长、增殖、存活、代谢和自噬方面发挥重要作用。其调节细胞增殖、代谢等功能主要通过两个结构和功能上有明显差异的蛋白复合物mTORC1 和mTORC2实现。其中mTORC1在自噬中发挥负性调控作用［14］。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate3- kinase，PI3K）/蛋 白 激 酶B（protein kinase B，AKT）是一种经典的自噬信号通路，也是mTOR的上游信号，在mTOR激活中起重要的调节作用［15］。XIAN等［16］研究发现，对大鼠预食用芦荟大黄素可增加大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型大鼠脑组织中PI3K和Akt的表达，从而达到神经保护作用。LC3和p62是必需的自噬蛋白。在自噬过程中，LC3I 转化为LC3II，因此，LCII/I代表自噬的程度。p62是自噬底物，p62的清除表明自噬激活。JIN等［17］研究发现，对MCAO模型的糖尿病小鼠给予不同剂量的伊布替尼注射，在I/R 损伤的半球测得PI3K、t-AKT、p-AKT、t-mTOR 和pmTOR 的蛋白表达均较未注射组有所增加。LCII/I水平明显降低，p62 显著增加，说明伊布替尼可能通过PI3K-Akt-mTOR 通路来抑制自噬从而减轻CI/RI。以上研究说明，PI3K-Akt-mTOR 通路介导的自噬在CI/RI 中发挥复杂作用，其通路的激活对自噬起负性调控作用。

3.2 CaMKKβ/AMPK/mTOR 通路钙调蛋白依赖性激酶β（CaM-dependent protein kinase kinase，CaMKKβ）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，受细胞内Ca2+所调控。当细胞内Ca2+水平升高时CaMKKβ 被激活，从而导致下游AMP 依赖的蛋白激酶［Adenosine 5’-monophosphate（AMP）-activated protein kinase，AMPK］信号激活。AMPK 是一种能量传感器和代谢调节剂，对AMP/ATP比值的变化很敏感。在缺血和缺氧条件下，AMPK 通过磷酸化ULK1 直接促进自噬。ST2-104 多肽是参照脑衰反应调节蛋白2（Collapsin respon mediator protein2，CRMP2）的CBD3 结构域设计而来的小分子衍生肽，可以抑制钙超载［18］。YAO等［19］研究发现，对大鼠预注射ST2-104可使MCAO造模后大鼠CaMKKβ 水平和p-AMPK/AMPK 比率降低，p-mTOR/mTOR 比率增加，从而减轻CI/RI。说明ST2-104减弱CI/RI中神经细胞凋亡可能是通过抑制CaMKKβ/AMPK/mTOR 通路抑制自噬来实现的。另一项研究通过诱导大鼠海马神经元细胞建立氧糖剥夺再复氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）模型，从细胞层面模拟了脑缺血-再灌注损伤。发现丙泊酚可显著减少OGD/R诱导的CaMKKβ蛋白表达，降低AMPK磷酸化水平和mTOR磷酸化水平来抑制自噬的发生［20］。以上研究说明，在CI/RI中，CaMKKβ 和AMPK 的表达增多，从而使下游mTOR 的表达增多，进一步来激活自噬，使脑组织损伤加重。所以，抑制CaMKKβ/AMPK/mTOR 通路从而抑制自噬可能为CI/RI的治疗提供一种新的思路。

3.3 Beclin1信号通路 Beclin1 是首个被发现的自噬调控基因，又称自噬相关基因6（Autophagy-Related Genes，ATG6），其通过PI3KC3复合物或Bcl-2在自噬中发挥核心作用［21］。通常来说，Beclin1 表达量与自噬呈正相关，一定程度上可以代表自噬活性。DENG等［22］研究发现，通过对MCAO造模后的大鼠连续7 d注射EGb-761（一种银杏叶提取物），发现注射EGb-761后大鼠梗死体积、神经功能缺损和神经细胞凋亡显著减弱。其中缺血半暗带区域Beclin1和LC3-Ⅱ水平均显著高于对照组（MCAO+生理盐水组）。表明EGb-761可能是通过激活自噬来达到CI/RI的神经保护作用。相反，LAN等［23］对MCAO造模后的大鼠注射山茱萸素后发现，相比于模型组（MCAO 造模后注射生理盐水），实验组（MCAO 造模后注射山茱萸素）可显著减少MCAO 大鼠的脑梗死体积和血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）渗漏，改善神经功能恢复。但是缺血半暗带区域Beclin1和LC3-Ⅱ水平均小于模型组，说明山茱萸素通过抑制自噬来改善CI/RI后的神经功能恢复。这些研究说明，自噬参与缺血-再灌注的过程是极其复杂的。在缺血再灌注早期，抑制自噬可达到神经保护作用；而在缺血-再灌注后期，适当的激活自噬亦可达到神经保护作用。

3.4 HIF-1α信号通路 缺氧诱导因子-1（hypoxiainducible factor-1，HIF-1）是肝癌细胞株Hep3B 细胞的核提取物中发现一种蛋白特异性地结合于红细胞生成素（erythropoietin，EPO）基因增强子的寡核酥酸序列。HIF 分为HIF-α 和HIF-β，其中HIF-α 又可分为HIF-1α、HIF-2α 和HIF-3α。HIF-1α 主要参与急性、周期性低氧的调节。HOU 等［24］研究发现使用姜黄素处理后的PC12细胞可免受OGD/R的损伤，程度与姜黄素的剂量呈正相关。研究发现，使用姜黄素后可降低HIF-1α、LC3II的表达和增加P62水平，而且在使用自噬抑制剂3-MA 后HIF-1α 亦可被抑制，表明HIF-1α 和自噬之间存在联系，HIF-1α 表达水平的下降可抑制自噬，从而达到CI/RI中的神经保护作用。

3.5 miRNA相 关 途 径 微 小RNA（MicroRNA，miRNA）是高度保守的小型单链非编码RNA，平均长度为18～22个核苷酸。miRNA首要功能是结合3’非翻译区（untranslated regions，UTR）作为识别位点，降低mRNA 的稳定性，从而降低基因表达。miRNA 在细胞的增殖、分化和凋亡等方面起重要作用。近年来研究表明，miRNA可以调节自噬的相关基因和蛋白，如ATGs 和Beclin-1［25］。MO 等［26］发现miR-379-5p 在脑卒中患者血清中和OGD处理的HCN-2细胞中表达水平显著降低。miR-379-5p的上调增强了细胞的活力和生长，减少了OGD诱导的细胞凋亡，降低了细胞中自噬标记蛋白Beclin1 的表达，而雷帕霉素可阻断miR-379-5p的神经保护功能。表明miR-379-5p对CI/RI的神经保护作用可能是通过自噬实现的。另一项研究表明，丹红注射液可能通过miR-132-3p 作用于ATG12并调节自噬信号通路蛋白表达来抑制脑缺血再灌注后的神经元自噬［27］。由此可见，miRNA 参与CI/RI 可能是通过调节自噬水平来实现的，未来治疗中miRNA可能成为CI/RI新的方向。

3.6 调节氧化应激氧化应激（oxidative stress，OS）是指细胞氧化还原失衡，引起过量活性氧（reactive oxygen species，ROS）和 活 性 氮（reactive nitrogen species，RNS）堆积，或抗氧化能力下降，导致机体氧化和抗氧化系统之间失衡而造成的应激状态。自噬通过去除受损的细胞器和展开的蛋白质，在维持细胞内稳态中发挥重要作用。OS 是CI/RI 病理过程中的主要机制之一。ROS是维持自噬进程至关重要的主要细胞内信号转导之一。XY03-EA是丁苯酞的一种新型衍生物，其清除ROS的能力比丁苯酞更强。CUI等［28］研究发现XY03-EA 可能通过AMPK-mTORC1-ULK1和Bcl-2-Beclin 1信号通路抑制自噬的启动和延长以及自噬体和自溶酶体的形成。ATM/CHK2/Beclin1 轴通过感知ROS 促进自噬，控制ROS 过度积累，清除受损线粒体并减轻氧化应激。GUO 等［29］对敲除CHK2基因的小鼠进行MCAO 后发现p-Beclin1 S90/93 激活下降，自噬水平降低，脑梗死面积增大。表明CHK2-Beclin1自噬途径可能有助于缺血性卒中的细胞存活。以上研究表明，在脑缺血-再灌注过程中，ROS通过多种途径调节自噬；反过来，自噬能降解细胞内受损的线粒体和清除细胞中不可逆氧化的生物分子。

3.7 调节内质网应激内质网是一种横跨细胞的膜状细胞器，具有制造新蛋白质的重要功能。此外，内质网在脂质生物合成、转移和信号传导中发挥作用。当细胞受到Ca2+平衡失调、缺氧等刺激时，内质网功能受损，其运输加工蛋白质功能被破坏。当内质网腔中未折叠蛋白质的负担超过其促进正确蛋白质折叠的能力时，就会产生内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）并触发未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）从而拯救细胞［30］。而激活的UPR会激活自噬，提高蛋白折叠能力，抑制ERS。ATG5 是自噬体和LC3-II 形成的关键蛋白。ZHAO 等［31］对ATG5 缺陷小鼠的蛋白和mRNA 水平进行测定。与ATG5+/-小鼠相比，ATG5-/-小鼠的ERS 标记蛋白（p-PERK、p-IRE-1、ATF6 和Grp78）显著降低，而相应的mRNA无明显差异，说明通过抑制ATG5介导的自噬可以进一步抑制ERS蛋白的表达，表明自噬能通过抑制ERS相关蛋白的表达对ERS进行负性调节，减轻受损细胞ERS的水平。

3.8 介导炎症反应在CI/RI 的病理生理过程中神经炎症反应起重要作用，其特征是细胞因子和趋化因子的产生，以及白细胞对缺血组织的浸润［32］。ZHA 等［33］研究发现，雷帕霉素诱导的自噬可以在体外保护神经元免受IL-6 诱导的损伤，抑制星形胶质细胞在OGD 后的炎症反应，抑制MCAO 大鼠脑组织中促炎细胞因子IL-1β和IL-6的表达，其保护作用与自噬反应水平、CI/RI 阶段和干预时间之间存在关系，表明自噬与炎症反应之间关系复杂，如何有效理解这种关系对于减轻CI/RI至关重要。

3.9 其他调控机制沉默信息调节因子1（Silent information regulator 1，SIRT1）是 经 典 的 依 赖 于NAD+的组蛋白去乙酰化酶，具有调节细胞凋亡、炎症、DNA 修复、氧化应激和自噬等功能［34］。研究表明SIRT1 通 过FOXOs 通 路、AMPK 通 路、PINK1/Parkin通路、mTOR通路和p53信号通路参与脑缺血-再灌注损伤中的自噬调控［35-40］。丰富环境（enriched environment，EE）是一种提供视觉、味觉、听觉、嗅觉等多感官刺激、运动和社会互动的居住模式，是复杂的非生物和社会刺激的组合。HAN 等［41］研究发现，EE 预处理可抑制MCAO 大鼠缺血半暗带细胞凋亡，其可能是通过ER 应激诱导的PERK-ATF4-CHOP 和IRE1-JNK通路来减轻CI/RI后的自噬水平。

4 总结与展望

脑梗死现在仍是关注的问题，严重影响人类的生命安全，其治疗的基石是恢复血供。然而再灌注引起的CI/RI的病理生理学极为复杂。近年来大量研究表明，自噬在维持细胞稳态和调节免疫反应等方面起至关重要的作用。首先，虽然通过调节自噬对治疗CI/RI 的帮助很可观，但仍有许多问题需要探索。现阶段关于自噬与CI/RI的关系还需要通过大量实验和研究来进一步探索，尤其是临床试验方面。其次，自噬机制在CI/RI治疗过程中相当复杂，特别是在后期，过度的自噬还可能造成后续损伤。有学者认为这可能是由于脑缺血后再灌注时间或自噬表达水平高低不同所导致的。因此，细化再灌注时间或调控自噬水平并使其发挥更强的保护作用有待进一步探索。最后，希望能够通过调节自噬减轻CI/RI，但在这个过程中，要明确自噬的特征，尽量避免其他加重反应的出现。因此更深入地了解和研究自噬与CI/RI的关系对脑卒中的治疗具有重要意义。