骨关节炎模型构建的研究进展

杨博 刘峻承 郑德勇 代国梅 晏和国

骨关节炎(osteoarthritis,OA)是以关节软骨局灶病变、软骨下骨肥厚反应和关节边缘骨赘形成为特征的慢性关节疾病[1]。关节疼痛是骨关节炎的主要临床症状,伴有关节畸形、运动障碍等不良后果,严重影响了患者的生活质量[2,3]。由于多种社会及人文因素,OA发病群体不断扩大,目前的发病率居高不下[4],是常见的关节炎症疾病。骨关节炎的发病已经严重影响着人民群众的生产生活,极大的降低了中老年人的生活质量[5]。目前骨关节炎的诊疗研究领域不仅有内科药物治疗、外科手术治疗、物理疗法等,还包括中医、西医、中西医结合等药物及非药物治疗方案的探讨和研究[6]。设计并选择合适的实验研究模型成为实验可行性、结果可信度的重要保证。通过查阅国内外文献,本文旨在综述各类骨关节炎模型的构建思路,并分析比较各模型建立的优势及目前OA模型建立存在的问题,为骨关节炎的相关科学研究提供更多参考。

1 造模实验动物

在解剖结构、发病基础、病情进展等方面同人类相似的造模实验动物是较为理想的动物模型,但难以同时做到,所以应选择模型构建的不同侧重点[7]。见表1。

表1 常见模型动物优势及劣势分析表

选择造模动物的主要参考因素是实用性,应当依据各模型动物的特色和实验研究方向选择合适的造模动物[18]。

2 常见造模方式

依据OA造模的干预形式,动物模型可分为自发模型、诱发模型(手术型或非手术型)、转基因模型;依据造模过程中干预手段的多寡也可以分类为单因素造模方式及复合因素造模方式。

2.1 自发OA模型 自发OA模型即实验动物无任何有意识的人工处理,在自然情况下自发产生的或由基因突变致病后经定向培育使之具有稳定遗传特性的实验动物。该动物模型具有以下优点:模型在自然条件下发生疾病,与人类疾病的发生发展相似度高,应用价值高。但该类模型存在存活率低、造模周期长、遗传病多、购买及饲养费用高的劣势。在豚鼠自发性膝骨关节炎相关研究中,康鑫源[19]对不同月龄的Dunkin-Hartley豚鼠进行研究,证实该豚鼠在自然生长状态下3月龄时会出现轻度关节软骨退变,且病情随着时间逐渐加重。此外,高龄的STR/ort小鼠可作为骨关节炎的自发动物模型,其疾病病理学始于生命早期,并显示出许多类似于人类原发性OA的特征[20,21]。来源于B6C3F1小鼠的BCBC/Y小鼠[22]也能够自发发生OA,以踝关节为典型的OA损伤部位,伴有关节肿胀和畸形,关节软骨变薄且有裂隙及侵蚀,关节边缘多形成骨赘,并且随着鼠龄增长小鼠多有瘫痪。此外长寿命及大关节的动物也可用于自发性OA模型的建立,类似于灵长类动物,但饲养周期长,可复制性不高,造模成本大[23]。

2.2 诱发模型 是较为常用的OA造模方式,又称为实验性动物模型。指研究者使用物理的、化学的或生物的单一或复合性因素作用于动物,造成动物的组织、器官或全身损害,或动物机体在功能、代谢、形态方面的改变。该类造模方式具有重复性高、人工可控的优点,但存在自然疾病差异性、实验局限性的不足。可分为手术诱发和非手术诱发:

2.2.1 手术诱发:OA模型的建立可通过手术干预造模动物关节的生理状态,形成人为的OA关节模型。传统的造模方法有Hulth法[24]及其改良法,传统方法即切除模型动物膝关节前交叉韧带、后交叉韧带、内侧副韧带以及摘除内侧半月板。邓紫婷等[25]运用此方法研讨体外冲击波对兔膝骨关节炎软骨组织中转化生长因子β1和白介素1β表达的影响。

此后因实验需要,人们对传统的Hulth造模法进行改良建立OA关节模型,改良Hulth造模法相对传统方法具有造模成功率高、相对术式简单、造模周期短的优势[26]。其改良方法多以简化传统Hulth造模法为主,如在犬早期骨关节炎模型研究中,通过前交叉韧带的横切造模,观察早期骨关节炎模型;李腾[27]通过切断SD大鼠踝关节外侧副韧带制造出SD大鼠踝关节骨性关节炎模型。关节软骨划伤也属于手术造模中的一种[28],但多在术后采用被动运动等复合因素形成的骨关节炎模型。此外,亦有由外部强力引起关节损伤后诱发的OA模型有助于研究损伤型的骨关节炎[29,30],研究者总结为非侵入型,常用于犬类、鼠类、兔类关节损伤后诱发的OA模型[23]。

手术方法也有不直接作用于关节的:廖源[31]采用3月龄雌性大鼠去卵巢的方式造模;戴七一等[32]采用血流阻断法导致造模关节血供不足形成OA模型,避免了关节手术创伤及术后的炎症,其中一种方式以阻断造模关节周围静脉为主,造成关节骨内高压从而诱导形成类似骨关节炎的模型;但由于造模时间长,造模成功率不高[33],目前使用该种造模方式较少,但仍可用于研究骨关节炎的早期发病。

2.2.2 非手术诱发:非手术诱发的OA关节模型即采用其他方式,如关节固定、关节注射、关节强迫运动等物理化学方式建立模型。研究认为OA的关节损伤绝大部分都是由关节组织的机械损伤引起的,病理力学是引起临床OA病情进展的关键因素[34]。因此传统Videman造模法[35]是经典的诱导性体外关节制动造模法,该方法可较好地模拟人类膝骨关节炎但避免了手术创伤和关节内操作的影响。在之后的研究及动物造模中人们不断改进,形成了改良的Videman法,史晓伟等[36]应用改良Videman法建立早期KOA兔模型,使用医用胶带及高分子固定绷带进行制动4周;高分子绷带固定与普通石膏固定造模相比去繁就简,局部固定稳定性好,关节角度可控,并且固定装置使膝关节完全暴露,局部透气性较好[37]。易强等[38]利用非加压固定的体外关节制动造模方式,构建无皮肤软组织损伤的兔膝OA模型,其造模效果与传统Videman造模法比较,效果一致,但对皮肤软组织的保护强于后者。

通过向关节腔内注射损害关节的药物造模称为关节腔内注射模型,药物有木瓜蛋白酶、透明质酸酶、胶原酶、菲律宾菌素、碘乙酸盐、碘醋酸盐等[22]。冯帅华等[39]采用木瓜蛋白酶膝关节腔注射于3月新西兰兔关节方式造模。谢平金等[40]采用木瓜蛋白酶与L-半胱氨酸混合溶液在大鼠左膝关节腔注射后,结合末次运动控制方式建立早期膝骨关节炎模型。也有利用富血小板血浆(Platelet-rich Plasma,PRP)等新的制剂关节腔注射造模的方式[41]。柳占彪等[42]用4%木瓜蛋白酶泊洛沙姆溶液膝关节注射0.05 ml,50℃作用2 h建立OA模型。

但笔者发现注射药物差别及其具体浓度、计量对关节模型构建影响的相关研究较少。周康等[43]证实关节腔注射碘乙酸能较快建立大鼠OA模型,并且具有剂量效应,随着剂量的加大,大鼠关节损伤越严重。王明建等[44]发现木瓜蛋白酶、碘乙酸钠和Ⅱ型胶原蛋白酶注射均可构建大鼠KOA模型,且雌雄组别无显著差异,碘乙酸钠模型关节病理特征更为显著。鲍哲明等[45]探讨碘乙酸钠大鼠骨关节炎模型在不同时段的病理及软骨下骨微结构的变化特点,认为碘乙酸钠造模2周时达到OA中期阶段,造模4周时为OA晚期阶段,会造成软骨下骨密度减低和骨小梁稀疏等骨质疏松表现,并且随病情进展逐渐加重。

此外,研究认为骨关节炎是一种进展性关节疾病,其特征是关节软骨生物合成和降解失衡,归因于炎症和生物力学因素,异常的关节负荷增加了骨关节炎的风险[46]。曹红等[47]利用高强度跑台运动方式造成C57BL/6小鼠膝关节软骨损伤,诱发膝骨关节炎。

还有研究表明,高脂饮食增加了骨关节炎中骨赘的形成[48],肥胖诱导的骨关节炎可能是由全身水平的促炎介质和关节局部生物力学因素介导的[49],高脂饮食可以增加OA模型构建的成功率。

2.3 转基因模型 随着生物基因领域的发展,利用转基因技术建立动物模型为骨关节炎的研究提供了新的选择,即利用基因编辑等技术将外源基因插入动物基因组,或对动物自身基因进行突变或敲除等改变导致OA发生的模型建立方式。

唐玉玲等[22]根据基因的不同改造策略及结果,将转基因OA模型小鼠分为三类,即基因突变小鼠模型、全身性敲除小鼠模型及条件性敲除小鼠模型;并总结出转基因OA模型多为全身性的突变或敲除小鼠,条件性基因敲除小鼠模型构建仍然不足,但转基因模型相较于自发性模型具有培育周期短的优点,相较诱发性模型具有创伤小及模型稳定性高的优势,但模型成本高。吴桐等[50]通过CRISPR/Cas9技术,建立了Cdkn2a-e定点敲入的杂合子小鼠模型,可在小鼠活体内追踪衰老经典标记物Cdkn2a(p16,p16INK4a)的表达情况,结合影像学检查,可以实时观察衰老和OA发生、进展的关系,但转基因造模动物的基因序列与人类存在差异,模型研究的结果普遍性不高。Yu等[51]利用C57黑鼠和TNF-α敲除小鼠,分别建立了KOA模型,并进行全身震动干预,发现了全身震动干预引起的软骨退行性变的新机制。

3 病证结合OA模型

病证结合的OA模型均为复合型造模方式,多在OA关节常规造模方式的基础上复合证型演变条件,最终形成病证结合的动物骨关节炎模型。周丽[52]通过Hulth+去势法(摘除睾丸)、Hulth+腺嘌呤灌胃构建肾阳虚KOA病证结合复合模型,且后者更为适宜;此外该实验证实肾阳虚可能加重KOA软骨退变程度,且肾阳虚越重KOA软骨退变越重。陈颖颖等[53]通过实验证实腺嘌呤浓度100mg/kg是最适肾虚骨关节炎复合模型建立浓度;袁普卫等[54]运用类似方法建立豚鼠绝经后肾虚型原发性骨关节炎模型。郭蕾等[55]在石膏制动法基础上利用薄荷油叠加气候箱模拟出阳虚寒凝型骨关节炎模型。有研究表明骨关节炎的证候分型与患者年龄及病程均有相关性,可以将造模动物的年/月龄及造模时间的长短考虑为病证结合型动物模型的影响因素[56]。普遍认为骨关节炎的证型是由多种病因相互作用的结果,故常有多种证型兼夹或转变,在实际造模时可以按需求和内在规律,组合建立复合的中医证候模型;但构建过程中干预因素多,操作较困难,模型稳定及可靠性不高,此外动物的饮食及垫料、光照等周围环境和饲养条件也极为重要[57]。研究不同表型骨关节炎的病理机制或其效用药物的治疗方法,需要依据表型的不同特点建立,积极构建合理、稳定的实验动物模型。具体动物模型辩证方法可参照《大鼠、小鼠辩证论治实验方法学》[58]。

4 小结

骨关节炎模型的建立不仅是研究药物防治OA的基础,还可以通过模型的建立研究骨关节炎形成各期的生理病理表现[59,60];然而完美的骨关节炎模型,即创建尽可能准确地模拟人类疾病的模型是基本不存在的[61],有研究者对不同造模方式进行对比研究,认为OA模型都以模型动物关节软骨病理改变为主[62]。骨关节炎动物模型的建立可依据研究的必要性,或相关作用药物的关键影响基点不同选择具有针对性的造模动物及造模方式,选择方法的重点在研究目标[63]。对于药用靶点较为复杂或同时兼具由多种治疗效应的药物,在其实验的造模阶段也多可使用复合造模方式[64-66]。

目前构建OA模型的相关比较研究尚不足,例如不同种造模方式的比较或同种造模方式不同时长、不同计量比较的实验研究相对较少;此外,构建OA模型成熟后的标准不统一,尚需实验研究及权威规范。