褪黑素合成调控及功能乳制备研究进展

王 俊,王维佳,王立凯,路永强*,刘国世*

(1.北京市畜牧总站,北京 100107;2.中国农业大学 动物科技学院,北京 100193)

在现代生活中,人们越来越关注健康和营养,而食物作为健康的重要来源,其营养价值也受到了更多的关注。尤其是动物源性食品,如牛奶,是人们日常饮食的重要组成部分,因此提高其营养价值具有重要的实际意义。褪黑素(melatonin,MT)俗称美拉酮宁、抑黑素、松果腺素、褪黑激素和脑白金。褪黑素主要是由脑松果体合成分泌的激素之一,具有抗氧化、抗炎症、抗抑郁和调控生殖活动等多种功能。目前褪黑素在动物身体内的自然生成及其在提高食物营养价值方面的潜力引起了人们的关注,但在这个领域的研究还处于早期阶段,需要更多的科学数据和实践证据来支持。富含褪黑素的功能性食品在世界市场上广受欢迎。在世界范围内,美国和中国香港等少数国家和地区把人工合成的褪黑素作为食品添加剂,而加拿大、英国和法国等绝大多数国家和地区把人工合成的褪黑素归为药物,不能直接作为食品添加剂。研发富含天然褪黑素的食品成为欧洲及国际上崇尚天然、追求安全人群的迫切需求。因此,文章详细探讨了褪黑素的生物合成、调控因素和生理学功能,以及不同国家(芬兰、英国、德国和中国)关于提高牛奶中褪黑素含量的研究进展,希望能为对这个领域感兴趣的读者提供有用的信息,也能为未来褪黑素功能性食品的开发和牛奶生产的改进提供理论基础。

1 褪黑素生物合成及生理学功能

1.1 褪黑素生物合成

褪黑素化学名称为N-乙酰基-5-甲氧基色胺,广泛分布于多种细菌、真菌、植物和动物中[1-3]。哺乳动物的多个组织器官(松果体、视网膜、皮肤、唾液腺、胃肠道、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、红细胞、胎盘、卵巢等)均能以自分泌或旁分泌的方式合成褪黑素[4-11]。褪黑素合成后可被运送到全身各处,存在于血液、唾液、尿液和乳汁中[12-14]。在哺乳动物中,褪黑素生物合成主要以色氨酸为底物,经过四个步骤合成:第一步,在色氨酸羟化酶(tryptophane hydroxylase,THP)的催化下形成5-羟基色氨酸;第二步,5-羟基色氨酸在L-芳香族氨基酸脱羧酶(L-aromatic amino acid decarboxylase,AAAD)的催化下形成5-羟色胺(血清素);第三步,5-羟色胺在5-羟色胺N-乙酰转移酶(serotonin-N-acetyltransferase,SNAT)或芳基烷基胺N-乙酰转移酶(arylalkylamine-N-acetyltransferase,AANAT)乙酰化作用下生成N-乙酰基-5-羟色胺(N-乙酰血清素);最后在N-乙酰基-5-羟色胺在N-乙酰-5-羟色胺-O-甲基化酶(N-acetylserotonin methyltransferase,ASMT)或羟吲哚-O-甲基转移酶(hydroxyindole-o-methyl transferase,HIOMT)甲基化作用下合成褪黑素[15](见图1)。

注:引自参考文献[16]。

褪黑素一旦合成,可迅速被释放至体循环,到达中枢和外周靶组织,发挥生理功能[17]。生物体内大多数组织器官都能够分泌褪黑素,但只有松果体和视网膜中褪黑素合成具有昼夜节律性,表现为昼低夜高的变化趋势,并且可根据四季白昼长短的不同表现出季节性变化。此外,褪黑素分泌也受到年龄的影响,随年龄增长外周血中浓度不断下降,在幼儿期含量保持最高值,进入老年期后含量大幅降低[18]。

1.2 褪黑素的生理功能

褪黑素是一种多效分子,具有调节睡眠和情绪、提高机体免疫水平和抗氧化能力、促进骨骼生长、保护神经系统和抑制肿瘤发生等功能[19]。同时,褪黑素作用位点广泛,可在卵巢、子宫、胎盘和肝脏等多种组织器官发挥生理功能。

众所周知,褪黑素在促进睡眠、调节情绪和重建生物节律方面发挥重要作用[20]。保持正常睡眠对人的情绪和身体健康至关重要,睡眠不足会导致肥胖、糖尿病、心脏病和抑郁症等疾病的发生[21]。当前,由于夜班和轮班导致工作人员整夜暴露于光线下,受到光刺激的影响,造成褪黑素分泌减少、昼夜节律紊乱,从而引起睡眠障碍和多种疾病的发生。目前,外源褪黑素已被用于临床治疗入睡困难和睡眠障碍等[19]。此外,褪黑素在欧洲已被批准用于治疗55岁以上患者的原发性失眠。临床试验结果表明,褪黑素可有效治疗失眠、自闭症和抑郁症[22]。外源补充褪黑素有助于维持体内褪黑素的水平,减轻由褪黑素分泌减少所引起的睡眠问题,恢复睡眠质量。研究发现,患有原发性失眠的老年患者在睡前1 h服用5 mg的褪黑素,连续治疗8周,可以显著提高患者的睡眠质量[23]。阮志鹏等[24]报道,每日服用3 mg褪黑素能够治疗老年性睡眠障碍。

褪黑素也被应用于抑郁症和其他神经疾病的治疗当中。在重度抑郁、双相情感障碍、精神分裂症或自闭症患者中可观察到夜间褪黑素分泌减少,使用褪黑素受体激活剂(促进褪黑素与受体结合)治疗后,重度抑郁症和焦虑状况得到显著改善[25-30]。代娟等[31]报道,褪黑素和抗抑郁剂联合使用能够有效缓解患者的抑郁状况和睡眠障碍。此外,褪黑素能够辅助治疗精神疾病,减轻精神分裂症患者的病症,稳定患者情绪[32-33]。

褪黑素具有很强的抗氧化功能。褪黑素不但能清除自由基,激活内源性抗氧化酶,提高机体抗氧化能力,还可与其代谢产物形成抗氧化级联,产生自由基清除产物,通过多种机制降低机体氧化损伤[34-36]。褪黑素的抗氧化功能在维持机体正常生理功能和调节稳态方面发挥重要作用[37]。H.Khaldy等[38]报道,褪黑素与维生素C、维生素E和去甲肾上腺素等抗氧化剂相比具有更强的抗氧化能力,能有效清除自由基。研究发现,褪黑素能逆转过氧化氢(H2O2)对间充质干细胞产生的毒害作用,增加间充质干细胞中谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量,提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)活性,减少细胞炎症因子分泌,降低细胞凋亡率,提高细胞的活力,维持细胞正常生理功能[39]。褪黑素还具有抗炎和抗凋亡的特性[40]。作为一种抗炎分子,褪黑素能够抑制炎症发生,保护细胞机体免受损伤。S.M.El-Shenawy等[41]发现,褪黑素能够抑制卡拉胶诱导的炎症反应,减轻电刺激大鼠的痛感。

褪黑素是免疫系统的重要调节剂,已被证明可增强天然免疫和获得性免疫,并激活单核细胞和中性粒细胞[42-46]。作为一种免疫调节剂,褪黑素能够促进淋巴细胞增殖和Th细胞分泌白细胞介素2(interleukin-2,IL-2)和干扰素,提高机体免疫力。研究发现,多次注射褪黑素后,显著增加了松果体和大脑中巨噬细胞和小胶质细胞数量。褪黑素已被证明可以抑制自然杀伤细胞(Natural killer cell,NK)活性,使接受褪黑素治疗人群的中性粒细胞趋化反应增强[47-48]。正常小鼠和免疫抑制小鼠注射褪黑素可显著增强抗体反应,并恢复已受损的辅助性T细胞活性[49]。褪黑素可通过刺激白细胞介素2(interleukin-2,IL-2)和白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)的产生,增强细胞免疫[50]。创伤出血后服用褪黑素可以显著改善机体免疫功能,增强脾细胞增殖能力,恢复腹腔巨噬细胞释放白细胞介素1(interleukin-1,IL-1)和白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)及脾细胞释放IL-2和白细胞介素3(interleukin-3,IL-3)的能力[51]。

褪黑素的抗癌作用已在多项研究中得到证实。褪黑素的抗癌途径包括抑制肿瘤增殖、增强宿主抗癌防御机制和提升机体免疫能力等[52]。目前,褪黑素已被应用于肿瘤的辅助治疗[53]。一项研究表明,同时使用褪黑素、依托泊苷和顺铂能够提高转移性非小细胞肺癌化疗患者的生存率和生活质量[54]。徐丽等[55]报道,褪黑素能够抑制胃癌细胞的迁移。大剂量的褪黑素(10～40 mg/d)应用于肾脏、肝脏和脑实体瘤治疗,可使患者的死亡率降低34%[56]。

2 褪黑素合成的影响因素

2.1 光照影响褪黑素合成和分泌的昼夜节律

为适应每日环境变化,动物进化出24 h睡眠-觉醒周期,并表现出生理和行为的周期性变化,这一生理现象被称为昼夜节律。哺乳动物昼夜节律系统由位于下丘脑视交叉上核(SCN)的昼夜节律起搏器驱动,使动物与外界环境相互作用,通过感应外界环境变化,如光照、温度和食物变化等,调节自身生理功能,从而保证机体健康。

在多种生理、心理及分子调控过程中都能观察到日常节律,如体温、心率、睡眠、情绪、基因表达和褪黑素的分泌等。其中褪黑素的自然分泌遵循昼夜节律,表现为夜间合成分泌最高,而白天较低。褪黑素的合成由生物钟控制,视网膜将接收到的光信号转化为神经信号,通过视网膜下丘脑束(RHT)传送到SCN,SCN经神经元输出途径将神经信号传送到松果体,由松果体将神经信息转换为内分泌信息输出,神经末梢释放去甲肾上腺素(NE)与松果体膜上的β-肾上腺素能受体结合,增加cAMP水平,影响AANAT的活性,调控褪黑素生成[57-58]。合成的褪黑素通过主动或被动释放的方式进入脑脊液或者血液,经体液循环,到达全身各处,发挥生理功能。通过这一途径,将褪黑素内源性昼夜节律与环境的明暗周期同步,使得褪黑素的分泌表现出和明暗周期相一致的相位变化。

2.1.1 光照波长对褪黑素分泌的影响

光照是影响褪黑素分泌的关键因素,根据一天中光周期、光照波长和光照强度的不同而影响其分泌[59]。其中光色对褪黑素分泌的影响最为显著。光色又称为光照波长,不同波长的光对应不同的颜色。蓝光的波长范围在430～450 nm,黄光的波长在570～600 nm,红光的波长在630～760 nm。一般来说,与短波长光相比,长波长光穿透效率更高。因此,不同波长的光对动物的影响不同。研究报道,受到蓝色LED灯光照射的奶牛,褪黑素分泌受到抑制;而与蓝色LED灯光相比,黄色LED灯光能够提高奶牛夜间褪黑素水平[60]。研究者研究了5种不同波长的光(光色)对唾液腺褪黑素分泌的影响,结果表明,短波长光对褪黑素分泌具有抑制作用。波长470 nm的蓝光、波长497 nm的蓝绿光和波长525 nm的绿光均能显著抑制褪黑素分泌,其中波长为497 nm的蓝绿光能够抑制近81%的夜间唾液腺褪黑素分泌,同时引起褪黑素达到峰值的相位发生延迟。然而,波长595 nm的琥珀色光和波长为660 nm的红光不会抑制褪黑素的分泌[61]。M.J.Bayarri等[62]研究不同光色和光照强度对欧洲鲈鱼眼部和血清褪黑素分泌的影响,发现610～687 nm的红光在6.0 W/cm2辐照度下能够显著提高鲈鱼眼部褪黑素浓度,对血清褪黑素浓度没有显著影响;434～477 nm的蓝光在6.0 W/cm2辐照度下降低了血清褪黑素浓度。S.A.Rahman等[63]研究发现,相较于蓝光和红光,绿光更能提高肉鸡视网膜和松果体内AANAT基因mRNA相对表达量,促进褪黑素的分泌。研究表明,450～460 nm波长的光对钟基因的表达和褪黑素的分泌没有影响,而470～480 nm波长的光能够促进二者的表达。

2.1.2 光周期对褪黑素分泌的影响

光照周期是指一天中白天和夜晚的相对长度。实际生产中,常根据不同的生产需要调整动物的光照周期,根据一天内明暗的长短将光周期分为长光周期(LDPP)、短光周期(SDPP)、持续光照期(LL)和持续黑暗期(DD)等。除了光色影响褪黑素分泌外,光周期也在影响褪黑素分泌中发挥着一定的作用。研究表明,延长光周期至16 h能显著提升牛奶中褪黑素含量,使褪黑素含量由19.36 pg/mL提升至28.20 pg/mL[64]。不同光周期对红嘴林鹑血液褪黑素浓度影响的研究表明,随着光照时间的增加,血液褪黑素浓度表现降低的趋势[65]。S.P.Karaganis等[66]发现,体外培养的松果体细胞中的褪黑素合成受到光周期的影响。L.Bai等[67]发现,不同光周期条件下松果体钟基因Cper2和褪黑素合成酶基因AANAT的表达表现出不同的相位变化。

2.1.3 光照强度对褪黑素分泌的影响

光照强度是指单位时间内单位面积上所接受到的可见光通量,用勒克斯(lx)表示。光照强度又被称为照度,反映光照的强弱和事物表面积对照明程度接受的高低。许多研究报道,光照强度影响动物的生长性能和行为。光照强度也会影响褪黑素的分泌。白天较强的光照强度能够减少夜间光照所引起的褪黑素分泌抑制,T.Kozaki等[68]让受试者在白天(09:00—12:00)暴露于不同的光照条件下(10,100,300,900,2 700 lx)和夜间(01:00—02:30)暴露在300 lx的强光下发现,白天处于100,300 lx光照条件下、夜间受到强光照射后受试者唾液中褪黑素浓度显著下降;而白天处于900,2 700 lx光照条件下,夜间光照前后唾液中褪黑素浓度没有显著差异。V.Kumar等[69]报道,白天光照强度会影响夜间褪黑素分泌,将鸟类从黑暗环境转到明亮环境褪黑素变化显著,而将鸟类从明亮环境转到黑暗环境下时褪黑素没有显著变化。一项探究不同光照强度对睡眠障碍病人褪黑素分泌影响的研究发现,暴露在400 lx光照强度下病人昼夜节律的维持优于暴露在高光照强度下的病人[70]。

2.2 温度对褪黑素分泌的影响

季节变化影响脊椎动物褪黑素分泌,科学家普遍认为是由于不同季节的光周期变化影响了松果体的功能。然而,季节变化也包括温度变化,尽管温度变化调控褪黑素分泌的现象在动物身上没有系统观测到,但有研究表明温度是影响褪黑素分泌的一个环境因素。L.G.Nisembaum等[71]研究温度升高对大西洋鲑鱼血浆褪黑素含量的影响发现,随着温度升高夜间褪黑素分泌增加。X.Xu等[72]研究发现,环境温度升高对褪黑素分泌的影响有限。相反,低温是诱发仓鼠分泌褪黑素的主要因素。低温可以上调褪黑素合成酶基因AANAT和ASMT的表达,促进褪黑素合成。A.R.Tilden等[73]发现,温度影响褪黑素分泌的振幅,在10 ℃、12L∶12D明暗周期环境下菱形水蛇血清褪黑素浓度低于25 ℃光周期环境下,而暗周期血清褪黑素浓度没有变化。M.Iigo等[74]报道,当金鱼在3—4月处在温度5,15,25 ℃、明暗周期12L∶12D时,黑暗中期金鱼的褪黑激素水平呈温度依赖性增加,表明金鱼血浆褪黑素受到温度的调节。

3 天然高褪黑素奶生产技术研究进展

3.1 芬兰天然高褪黑素奶生产技术

2001年芬兰率先发表了一种生产富含褪黑素牛奶方法的发明专利,通过光控技术手段生产天然高褪黑素牛奶的方法逐渐走进研究人员的视野[75]。

为了生产天然高褪黑素牛奶,技术人员提出通过改变自然状态下的明暗周期调控一天之中的黑暗持续时间,改变奶牛的日常节律,使其处于长度基本不变的暗周期和光周期中,并且通过在黑暗期结束之前收集牛奶的方法来获得天然高褪黑素牛奶。该方法提出的光照制度:光周期长度在13～22 h,暗周期光照长度在2～11 h;光周期光照强度在150 lx以上,光照强度在250 lx以上为最优光照强度;暗周期光照强度在40 lx以下,小于10 lx为最优光照强度。每日早晨挤奶时间保持在黑暗期结束之前,挤奶时允许奶牛暴露在光源下的时间为30 min,进入奶牛眼睛的最大光线不超过40 lx,通过上述方法进行操作可以确保牛奶中褪黑素浓度保持在较高水平。即在生产实践中夜晚23:00至次日07:00之间牛舍内的光照强度保持在10 lx,06:30之前完成挤奶工作。遵循上述程序进行标准化褪黑素牛奶生产,可使牛奶中的褪黑素浓度保持在20 pg/mL以上。

3.2 英国天然高褪黑素奶生产技术

英国于2002年发布了一项有关提高牛奶中天然褪黑素含量的专利[76],通过该方法生产的牛奶褪黑素含量为15～30 pg/mL。该专利要求控制一天内的明暗周期,将一天分为光周期和暗周期,光周期时间控制在14～16 h,暗周期时间控制在8～10 h;同时调控光照强度,光周期平均光照强度在1 000 lx以上,暗周期平均光照强度不超过50 lx;保证一天中至少完成2次挤奶,其中一次挤奶在暗周期结束前完成,并要求将暗周期收集与其他时间段内收集牛奶分别储存、加工。

使用该方法生产天然褪黑素含量较高的牛奶,需要应尽可能使暗周期范围与自然日节律一致,如不能满足,也可以在一天内和任何阶段进行;当光周期光照强度不能达到1 000 lx时,应采取补充人工光源的方法。日常挤奶在晚上21:00至次日05:00进行最好,暗周期结束前的挤奶时间最好在05:00左右;若一天内进行2次挤奶,非暗周期挤奶时间可以选在19:00左右;若一天内进行3次挤奶,非暗周期挤奶时间可以选在13:00,暗周期挤奶时间在21:00和05:00。

3.3 德国天然高褪黑素奶生产技术

德国于2009年公布了一种生产高褪黑素含量牛奶和乳制品的方法[77]。该方法将雌性哺乳动物的日周期分为光周期和暗周期,并将光周期分为两个阶段,一种光照状态下的白天阶段和不同光照状态下的夜间阶段。第一阶段(白天阶段)使哺乳动物暴露在含有一定比例蓝光的光照条件下,此阶段主要目的是抑制褪黑素的分泌;在第二阶段(夜晚阶段)使用至少一种发射波长在500 nm以上的光源,要求该光源能够发射红光、橙光、黄光或者是它们的混合光,并使哺乳动物接受至少2 h以上该光源的照射。此阶段通过施加光控制,最大限度解除褪黑素分泌所受到抑制的状况,从而提高牛奶褪黑素的浓度。

白天阶段补充光源应选用类似太阳光(290～770 nm)的全光谱(375～725 nm),在白天最大限度地抑制褪黑素分泌;夜间优先选择黄色、橙色、琥珀色或者红色的光源照射至少1 h,照射6 h以上效果更佳;夜间不需要完全的黑暗,尽量使用不含有蓝光成分的光照明。按照上述流程操作,在暗周期结束前完成一次挤奶操作,缩短暗周期的时间,可提高牛奶中的褪黑素含量。例如,暗周期延长光照时间到16 h,优选大于18 h的光照时间,能够使褪黑素在暗周期分泌达到高峰。正常牛奶中褪黑素含量为1.5～3.0 pg/mL,按照此方法生产,能够使牛奶中褪黑素含量提高至少2倍,甚至高达10倍。按照上述方法收集到的牛奶以正常方式进行加工,同样能够获得较高褪黑素浓度的乳制品。例如,使用该方法加工出的奶粉中褪黑素含量可达200 pg/mL以上。

3.4 中国天然高褪黑素奶生产技术

2012年我国公布了一种获得高褪黑素含量原料乳的方法。该方法将奶牛饲养阶段分为光照期、黑暗期和挤奶期。光照期使用540～600 lx光照强度的灯光,于每天的03:00—15:00进行照明;黑暗期每隔1～2 h使用240～300 lx光照强度的蓝绿光(420～480 nm)光照15～30 min,其余时间将灯光的光照强度控制在在20～40 lx之间。在02:30—03:00挤奶,使用240～300 lx光照强度的蓝绿光(420～480 nm)进行光照。应用上述方法能够促进黑暗期褪黑素分泌。黑暗期采用蓝绿光间歇式照明的方式,能够反复刺激视网膜神经节细胞,加快褪黑素分泌。

应用此方法能够获得较高浓度的褪黑素原料乳,提高原料乳乳糖含量。使原料乳褪黑素含量达到50～71 pg/mL,乳糖含量达到44～56 pg/mL,可以有效解决原料乳褪黑素和乳糖含量低的问题。

4 展 望

褪黑素具备抗氧化、抗炎症、控制节律和调节机体免疫力等多种生理功能。大量研究表明,常量服用褪黑素无不良反应及毒性作用。基于褪黑素强大的生物功能和安全性,可推广应用于畜牧业生产,如抗奶牛乳房炎、降低牛奶中体细胞数量、提高奶牛泌乳量等,能够有效改善动物生产性能。同时,天然高褪黑素功能食品市场前景广阔,可进一步提高养殖业经济效益。因此,深入挖掘褪黑素合成调控分子机制,可为褪黑素功能性食品开发提供理论基础。