鞘氨醇单胞菌的微囊化高密度培养优化

王明成，刘道奇，刘超英，柴迎慧

（黄淮学院生物与食品工程学院，河南驻马店 463000）

鞘氨醇单胞菌（Sphingononas sp.）是变形细菌中的α-4 亚类，属于革兰氏阴性细菌，是20 世纪末从假单胞菌中新分离的一类新属[1]。该菌在环境修复、农业发展、畜禽养殖中具有极大的应用潜力[2,3]。前期研究发现，麻鸡盲肠中分离的鞘氨醇单胞菌能有效降低养殖场氨气含量[4]，并且能显著提高鸡的生长性能、鸡肉和蛋的品质[5]。因此，鞘氨醇单胞菌也被认为是重要的微生物菌剂之一。

目前，为提高微生物菌体浓度，通常采用分批培养、补料分批培养、半连续发酵来提高菌体密度[6,7]。分批发酵培养过程中会受到代谢产物的抑制，补料分批发酵是间歇或连续补料的分批培养方法，可以有效缓解有害代谢产物的积累，克服营养物质的不足，延长次级代谢产物的生产时间，最终达到微生物高密度培养增大菌体密度的效果。段学辉等[8]研究发现，分批补料明显加快了酒精酵母菌的生长并获得了较高的细胞浓度。鞘氨醇单胞菌在以上培养条件下的细菌密度通常较低。

微胶囊是一类容许小分子物质在胶囊内自由出入以及代谢产物自由分泌，并可阻止外部生物大分子进入的材料[9]。液芯胶囊易于输送物质，细胞生长均匀，密度高，可用于乳酸菌、酵母菌的增殖和培养[9,10]。将菌液与无水氯化钙、羧甲基纤维素钠的混合物滴入海藻酸钠溶液中，并用壳聚糖溶液成膜形成液芯微胶囊[7]，与补料分批培养方法相结合，来增加菌体密度。因此，本研究为增加鞘氨醇单胞菌的细胞密度首先对其发酵的培养基和发酵条件进行优化，然后使用最佳培养基进行微胶囊的高密度发酵，以提高鞘氨醇单胞菌的产量。

1 材料与方法

1.1 菌种、培养基与试剂

黄淮学院生物与食品工程学院微生物实验室低温保存的鞘氨醇单胞菌（Sphingononas sp.）。LB 培养基用于菌种活化、发酵种子液培养以及活菌数检测。

羧甲基纤维素钠购自郑州派尼化学试剂厂；壳聚糖、乳糖、葡萄糖购自天津市大茂化学试剂厂；牛肉浸粉购自杭州百思生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

双人单面超净工作台（SW-CJ-2FD）购自苏州苏洁净化设备有限公司；电子分析天平（AR2140）购自梅特勒托利仪器（上海）有限公司；可见分光光度计（722）购自青岛聚创环保集团有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种活化

将实验室保存的鞘氨醇单胞菌在超净工作台中接种到LB 液体培养基中，28℃、180r/min 培养活化。

1.3.2 生长曲线测定

将以上活化好的菌液以2%的接种量转接至LB 培养基中，28℃、180r/min 培养48h。每2h取样，检测菌体吸光度（OD600），并绘制鞘氨醇单胞菌的生长曲线。

1.3.3 单因素优化

首先进行单因素优化：分别考察不同碳源种类及含量、不同氮源种类及含量、温度、磷酸二氢钾（KH2PO4）、pH 值和菌液接种量对鞘氨醇单胞菌细胞密度的影响。

培养基的单因素优化：以LB 为基础培养基，考察不同碳源（乳糖、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖和果糖）、不同氮源、不同KH2PO4浓度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 g/L）对鞘氨醇单胞菌细胞密度的影响，确定最适碳源、氮源以及最适的KH2PO4使用浓度。

培养条件的单因素优化：分别设置温度（25、28、30、35、37℃）、初始pH 值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）、接种量（1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%），在28℃、180r/min 摇床培养48h，来确定最适温度、初始pH 值和接种量。

然后，在单因素实验的基础上筛选出影响显著的组分因子，以初始pH 值和温度为考察因素，以菌体OD 值为考察指标，采用SPSS AU 正交试验设计系统进行正交试验设计。

1.3.4 微胶囊制备

将活化好的菌种接种到液体培养基中，在最适条件下培养至对数期，25℃、2500r/min 离心15min，弃上清。在收集的菌体中加入5mL 生理盐水将菌体重悬，随后与45mL 4%（w/v）CaCl2和2%的羧甲基纤维素钠混合溶液混合均匀。然后，用规格10mL 的一次性注射器或滴管滴入1.2%海藻酸钠溶液，立即收集预胶囊并用无菌水冲洗，再放入0.1%的壳聚糖溶液中静置30min，使微胶囊成膜[9]。最后用无菌水冲洗表面残留的壳聚糖溶液，得到微胶囊[11]。

1.3.5 微胶囊后高密度培养

将制备好的鞘氨醇单胞菌的微胶囊，按照3%的接种量加入优化后的培养基中于30℃、pH 6.0、180r/min 培养48h。然后，在无菌条件下将液芯微囊滤出，转移到新鲜的LB 液体培养基中继续培养。采用以上方法连续培养5 次后，将液芯微囊滤出，用无菌水洗涤液芯微囊外残留的菌体。然后，采取化学法将液芯微囊破碎，最后使用平板稀释涂布法检测每克液芯微囊内的菌体数量。

1.3.6 活菌总数测定

囊内活菌计数：取培养结束的完整胶囊，将微胶囊与破囊液按照1∶10 的比例混合，剧烈振荡使其破碎完全。然后，将其稀释进行平板涂布活菌计数，单位为CFU/g。

破囊液：0.06mol/L 的柠檬酸三钠（Na3C6H5O7·2H2O）和0.2mol/L 的碳酸氢钠（NaHCO3）混合溶液。

培养基菌液活菌计数与制作微胶囊并进行高密度培养的过程各设置3 组平行试验，计数取3组菌落数平均值作为最后菌落计数结果。

1.3.7 微胶囊的切面观察

取培养完整的胶囊切片，放出囊内菌液，在体视显微镜下观察其囊壁及孔隙。

1.4 数据分析

试验数据使用SAS V8 分析显著性差异，正交设计助手Ⅱ设计正交试验，GraphPad Prism 绘制图表。

2 结果与讨论

2.1 鞘氨醇单胞菌的生长曲线

由图1 可知，鞘氨醇单胞菌生长曲线，在0～6h 生长缓慢为延滞期，6～38h 快速增长进入对数生长期，38h 后菌体密度达到最高且不再增加，进入稳定期，因此以38h 的菌液为最佳培养时间，进行下一步研究所用。

图1 鞘氨醇单胞菌的生长曲线

2.2 单因素实验结果

2.2.1 碳源种类对鞘氨醇单胞菌生长的影响

由图2 可知，以蔗糖为碳源时OD600最高，OD600为0.659，其次是葡萄糖、乳糖、果糖、麦芽糖。因此，选择蔗糖为最适碳源。

图2 不同碳源种类对鞘氨醇单胞菌生长的影响

2.2.2 不同蔗糖浓度对鞘氨醇单胞菌生长的影响

由图3 可知，当蔗糖浓度为10～40g/L 时，菌体的OD600呈现先升高后降低的趋势。当蔗糖浓度为25g/L 时，OD600最高（0.772），比20g/L蔗糖时的OD600（0.646）提高19.5%。继续增加蔗糖浓度，OD600呈现逐渐下降的趋势，可能是高浓度的蔗糖使鞘氨醇单胞菌细胞膜内外的渗透压不平衡，抑制了细胞的生长。因此，选择25 g/L蔗糖浓度为鞘氨醇单胞菌为最适碳源含量。

图3 不同蔗糖添加量对鞘氨醇单胞菌生长的影响

2.2.3 氮源种类对鞘氨醇单胞菌生长的影响

由图4 可知，鞘氨醇单胞菌对有机氮源（牛肉膏、蛋白胨和酵母浸粉）均有较高的利用率，其中酵母浸粉的促生长效果略微优于其余2 种，菌体OD600达到0.772，但对无机氮源（尿素和硫酸铵）利用率较差。因此，选择酵母浸粉为最适氮源。

图4 不同氮源种类对鞘氨醇单胞菌生长的影响

2.2.4 不同氮源浓度下鞘氨醇单胞菌的生长情况

由图5 可知，酵母浸粉浓度对菌体OD600的影响，整体上表现为先升高后降低，在20～30g/L 添加量范围内，菌体OD600几乎相当，最大OD600为0.715，当浓度继续增加至30g/L 以上后，菌体OD600反而明显降低，可能是过高的氮源浓度对菌的生长产生抑制作用。考虑到实际中的应用成本，选择20g/L 酵母浸粉浓度为鞘氨醇单胞菌为最适碳源含量。

图5 不同酵母浸粉添加量对鞘氨醇单胞菌生长的影响

2.2.5 不同浓度KH2PO4条件下鞘氨醇单胞菌的生长情况

由图6 可知，KH2PO4浓度为0.5～3.5g/L 时，菌体OD600表现为先升高后降低。在0.5～2.0g/L时，菌体OD600显著升高，最大OD600为0.92。当KH2PO4浓度继续增加后，菌体OD600缓慢降低，可能是过高的KH2PO4浓度产生渗透胁迫作用，对菌的生长产生抑制作用。再结合实际中的生产应用，选择2.0g/L KH2PO4进行下一步试验。

图6 不同KH2PO4 添加量对鞘氨醇单胞菌生长的影响

2.2.6 不同接种量条件下鞘氨醇单胞菌的生长情况

以LB 为基础培养基，接种量大小对鞘氨醇单胞菌生长的影响如图7 所示。当接种量为1.0%～3.0%时，菌体OD600逐渐增加，当接种量达到3.0%时鞘氨醇单胞菌的OD600达到较大值，为0.673。随着接种量的继续增加，菌体OD600反而下降。接种量在3.0%～5.0%对鞘氨醇单胞菌生长的影响无差异，且考虑到菌种活性和代谢产物积累问题，接种量过大时生长条件受限，选取3%为实验所用接种量。

图7 不同接种量对鞘氨醇单胞菌生长的影响

2.2.7 不同pH 值条件下鞘氨醇单胞菌的生长情况

初始pH 值对菌体生长的影响如图8 所示。pH 值在3.0～5.0 范围内，鞘氨醇单胞菌生长情况较差，在pH 值为6.0 时OD600（0.783）达到最大。继续增加pH 时，鞘氨醇单胞菌的生长明显被抑制。因此，选用培养液初始pH 6.0 为最佳培养液pH 值。

图8 不同初始pH 对鞘氨醇单胞菌的影响

2.2.8 不同温度对鞘氨醇单胞菌生长的影响

由图9 可知，当温度为25～37℃时，菌体的OD600呈现先增加后降低的趋势。当培养温度为30℃时，鞘氨醇单胞菌的OD600达到最大，为1.011，且差异显著。因此，选择30℃为最适培养温度。

图9 不同培养温度对鞘氨醇单胞菌生长的影响

2.3 正交试验结果

利用统计学分析方法，根据单因素试验结果确定对鞘氨醇单胞菌生长情况显著影响的因素：温度和培养液初始pH 值，结合SPSS AU 正交试验设计系统，采用2 因素4 水平L16(42)正交设计方法，来确定最佳培养基配方和培养条件，正交试验设计表如表1 所示。

表1 正交试验二因素四水平设计表L16 (42)

由表2 可知，对鞘氨醇单胞菌的生长有显著影响的因素为：温度和培养液pH，且最佳培养温度为30℃，培养液初始pH 为6.0。且由以上研究分析结果可知，鞘氨醇单胞菌的最适培养基是：蔗糖 20.0g，酵母浸粉 25.0g，NaCl 10.0g，KH2PO42.0g，接种量为3%，蒸馏水1000mL。

表2 正交试验分析结果

2.4 微胶囊后高密度培养结果

2.4.1 鞘氨醇单胞菌微胶囊的切面观察结果

取培养完整的胶囊切片，倒出囊内菌液，在体视显微镜下观察其囊壁及孔隙，如图10 所示。胶囊囊壁较薄，孔隙较明显，通透性良好，微胶囊高密度培养效果较好，说明液芯微包囊可以对菌体起到较好的保护作用。

图10 微囊切面10×1.7

2.4.2 验证试验

基于以上优化的最佳培养基配方和培养条件，采用微囊化发酵鞘氨醇单胞菌，连续培养5次，其细胞密度的变化见图11。鞘氨醇单胞菌微囊化后在第1～4 批的培养过程中细胞密度逐渐增加，达到5.17×109CFU/mL。当连续培养到第5代时细胞密度略有降低，可能是培养次数过多菌体老化所致，故确定培养代数为4 代。而游离条件下鞘氨醇单胞菌细胞密度只在1～2 培养批次时逐渐增加，达到最高的1.42×109CFU/mL，之后所有培养批次中均无变化。

图11 鞘氨醇单胞菌微囊化后连续培养过程中囊内细胞密度的变化

2.4.3 活菌计数结果

由表3 可知，鞘氨醇单胞菌在高密度液体培养条件下的活菌总数是原培养基正常培养下的8.07 倍，而微囊化高密度培养下的活菌总数是高密度液体培养下的3.64 倍，是原培养基正常培养条件下的29.4 倍。

表3 不同培养条件下活菌计数结果

3 结论

本研究通过单因素试验探究碳源种类及含量、氮源种类及含量、温度、pH 值和接种量七个因素对鞘氨醇单胞菌生长的影响，随后采用正交试验（2 因素4 水平）确定最佳培养温度和培养条件为：蔗糖20.0g/L，酵母浸粉25.0g/L，NaCl 10.0g/L，KH2PO42.0g/L，pH 6.0，培养温度为30℃，pH 为6.0，接种量为2%。鞘氨醇单胞菌在高密度液体培养条件下得到的菌落总数达到1.42×109CFU/mL，是初始培养基正常培养条件下的8.07 倍。随后，运用液芯微胶囊法包埋技术制备微囊化鞘氨醇单胞菌，将培养完整的胶囊制切片在体视显微镜下观察可知，胶囊囊壁较薄，孔隙较明显，通透性良好。微囊化鞘氨醇单胞菌在最适条件下培养5 代，菌落总数达到5.17×109CFU/mL，是高密度液体培养条件下活菌数量的3.64 倍，是原培养基正常培养的29.4 倍。菌体密度得到大幅度提升，显著提高了鞘氨醇单胞菌的产量。