免疫应答性状筛选及高免疫力奶牛的培育进展

张志鹏，王大胜，王建辉，王志彬，陈义旺，商绍彬，杨章平，杨 奕*

（1.扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州 225009；2.睢宁县畜牧兽医技术指导站，江苏徐州 221200；3.徐州永浩牧业有限公司，江苏徐州 221200；4.扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009）

奶业是关系国民健康的重要产业，奶牛疫病是制约奶业发展的关键因素之一。长期高强度的经济性状选择导致奶牛对疫病的抗性普遍下降，因此，基于适应性免疫应答性状的遗传选育是提高奶牛疾病抗性的重要策略。近年来，人们开始关注健康性状的选择，包括奶中的体细胞计数、奶牛的长寿性等，但一直没有筛选出能够反映奶牛综合抗病性的标志（性状）。免疫学技术在奶牛抗病育种领域的应用为奶牛抗病性状的选育提供了新的思路。有研究表明，适应性免疫应答性状受到遗传因素调控[1]，其中细胞和体液免疫应答都具有数量性状特征，可估计育种值，可作为候选性状用于奶牛抗病性选种，以提高其综合抗病性能[2]。本文将对这种新兴的免疫应答性状选择技术在培育抗病奶牛领域中的应用和发展进行阐述，为建立新型可定量且易于标准化测定的奶牛遗传性免疫能力选择体系、突破国外奶牛遗传性免疫应答能力选择的技术封锁、攻克高免疫力奶牛种源“卡脖子”技术，培育具有自主知识产权的本土化奶牛高免疫力新品系提供理论依据。

1 奶牛抗病性状选择研究进展

自20 世纪末以来，随着奶业发展和牛只健康等问题的日益突出，对奶牛的选育目标已经由最初产奶、产肉等生产性状逐步发展为平衡育种，抗病性状的选育也逐渐受到人们的重视。抗病性选育是主要基于品种和个体对疾病易感性的差异，通过定向选择的方法培育对特定疾病拥有较强抵抗力的奶牛新品种（系）。一般包含2 部分：一是抵抗常见病、传染病的选育，二是针对某些遗传缺陷的选育。奶牛常见疾病包括乳腺炎、瘤胃异位、繁殖疾病、代谢疾病、肢蹄病等，这些疾病的发生会导致奶牛生产性能下降，造成严重的经济损失。目前，围绕上述疾病已经开展了一些抗性选育工作。

1.1 奶牛特定疾病抗性选择

现有的研究大多集中在针对某一特定疾病的抗性选育，为此已经开发出从表型到分子选育的多种技术手段。目前奶牛乳腺炎是一个尚未解决的世界性难题，人们试图通过筛选候选基因开展奶牛乳腺炎抗性育种，Usman 等[3]研究发现，IL-17F 和IL-17A 基因中的单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP）奶牛乳腺炎的抗性有显著相关性，而这些SNP 可以在奶牛抗乳腺炎育种工作中作为有效的遗传标记。肢蹄病是奶牛养殖中的常见病、高发病，被列为牧场最重要的动物福利指标，目前针对牛肢蹄病的选育主要依赖于选择体型等间接性状或根据肢蹄病发病记录进行直接选育。Matthew Barden 等[4]以蹄病恢复情况为指标，开发了一种新的选育方法，该方法将动物分类为“易感”和“抗病”，在此基础上建立了牛蹄病选育责任量表，量表显示，唯一病变易感性的遗传率为0.25，表明蹄病恢复性状是可遗传的。因此，可通过该性状的选择性育种减少长期患有蹄病奶牛的概率，为提高牛群的蹄病抗性提供了一种有效的途径。

对于奶牛育种，无论是通过表型记录还是分子选育，对单一疾病进行抗性选育的效果均不明显并存在一系列问题。例如，对奶牛乳腺炎的抗性选育可能会导致产奶量的明显下降，基于现有抗乳腺炎表型选择的方法，确定的具有高乳腺炎抗性的奶牛，其产奶量显著降低[5]。对奶牛进行人工感染特定病原菌后，检测相关反应的指标也可以用于评估抗性水平，例如对布鲁氏菌感染导致的流产进行检测[6]，但存在疾病暴发的风险，因此这种方法在商业环境中并不适用。此外，有研究表明，对特定病原体的抗性并不具有对其他病原体的抗性，甚至可能发生相反的情况[7,8]。

1.2 奶牛健康性状选择

针对单一疾病进行牛的抗性选育是不可行的。为了保证牛的生产性能不受影响，并提高牛的适应性，降低疾病发生率，保证抗病育种工作的持续推进，开展健康性状的研究和应用势在必行。目前，美国健康性状分类指数中包括：乳腺炎、酮病、子宫炎、真胃变位、胎衣不下和产乳热等6 个健康性状[9]。因为许多健康性状的表型数据采集困难，所以在研究中经常将其作为整体考虑，统计特定时间内发生这类健康事件的次数。例如，澳大利亚的育种工作者将胎衣不下、子宫炎等各类繁殖疾病组合称为繁殖性能障碍类健康性状，其估计遗传力为0.01[10]。

保持肢蹄健康对奶牛场非常重要。研究表明，蹄病对奶牛的长寿性和产奶量存在显著影响[11]。以往的肢蹄性状健康选育研究大多是被包含在体型外貌性状中来开展的，牛体型外貌性状的遗传评估研究已经进行了很多年，然而，近期的研究表明，肢蹄的健康状况与体型线性评分之间无显著遗传相关性，这表明在今后的抗病育种工作中，在选育目标中单独加入肢蹄健康性状是十分必要的[12,13]。牛的肢蹄健康性状是根据其发病与否定义的一种二分类阈性状，可使用混合线性模型进行遗传参数估计。因此，为了选育肢蹄健康性状，需要经过很长时间的肢蹄疾病诊疗记录的积累，这大大影响了选育的效率。为了解决上述问题，各类检测奶牛行为的智能化检测系统被陆续开发出来，通过奶牛的行为变化来推测其肢蹄健康情况[14]。研究结果表明，奶牛肢蹄健康性状估计遗传力在0.01～0.03[15]。荷兰和北欧已经将肢蹄健康性状纳入奶牛选育指数中，其权重为3%～7%。

有关乳房健康性状的遗传选择在奶业发达国家开展的比较早，起初主要将乳房深度、前乳房附着和牛奶体细胞数等指标作为乳房健康性状的标志，以此来间接选择临床乳腺炎的抗性，但是临床乳腺炎抗性的遗传性能并不能通过上述乳房健康性状的标志来完全解释清楚[16]。因此，各个国家陆续开发了临床乳腺炎的表型数据采集系统，与牛的肢蹄健康性状相同，牛乳腺的健康性状是根据其发病与否定义的一种二分类阈性状，可使用广义线性模型和线性模型对其进行遗传参数估计[9]，广义线性模型遗传力估计结果（0.06～0.10）高于线性模型（0.01～0.03）[17]。目前，一些国家已将临床乳腺炎抗性加入了选择指数中，在法国和加拿大的奶牛选育指数中，临床乳腺炎抗性的权重分别为7.2%和6.6%[18]。

对奶牛动物福利和生产性能产生影响的健康因素很多，这些因素来源于不同发病机制的疾病，导致健康性状之间遗传相关较小。表型数据是影响健康性状遗传评估的主要因素，国外的研究人员很早便尝试直接选择健康性状，并构建了特定的数据收集方法和制度以开展相关的研究，然而健康性状（＜5%）的遗传力一般比生产性状（＞30%）低[19]，直接选择效果较差。

2 免疫应答性状选择技术原理与应用现状

免疫应答是指免疫系统识别和清除入侵的病原微生物以及机体内突变的细胞和衰老、死亡细胞的整个过程，可分为固有免疫和适应性免疫两大类。固有免疫又称先天性免疫，适应性免疫又称获得性免疫。目前对于奶牛而言，针对固有免疫性状的测定尚无标准方法，尽管已经有学者开始关注血液中的中性粒细胞数量等性状，但是选择的具有高中性粒细胞的奶牛的抗病性能并不理想。相反，适应性免疫已被证明受遗传影响较大，相应的细胞及体液免疫应答性状测定方法已被成功开发并应用在了种公牛的选种选育工作中。本文探讨的免疫应答性状选择技术主要指能在奶牛育种和生产上应用的适应性免疫性状测定技术。

2.1 免疫应答性状选择技术原理

免疫应答性状选择技术是加拿大圭尔夫大学等研究人员开发的一种测定奶牛细胞及体液免疫应答性状的方法，根据该方法将奶牛的免疫力定义为“高、中、低”三个不同的水平，以此来对奶牛的综合抗病性能进行选择。其原理是对奶牛注射模式抗原后，检测奶牛的免疫应答反应程度，以此来衡量细胞和体液免疫应答性状水平。细胞免疫应答性状的检测方法是手动测量VI 型超敏反应引起的皮褶厚度，该方法的原理是：在模式抗原刺激奶牛产生细胞免疫应答后，再用相同的抗原进行皮试，可诱导迟发型超敏反应。激活的T 细胞会释放多种细胞因子，产生以单个细胞浸润为主的局部炎症反应，阳性反应表现为局部红肿和硬结，通过阳性反应的强度可以确定细胞免疫的水平。体液免疫应答性状检测是通过间接酶联免疫吸附检测（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）来测定奶牛血清中的特异性抗体滴度，该方法的原理是：在模式抗原刺激奶牛产生体液免疫应答后，B 细胞会分泌抗原特异性抗体来保护机体，将该模式抗原包被96 孔酶标板，并通过间接ELISA 测定该抗原免疫后的奶牛血清中的特异性抗体滴度。目前，相关方法已被申请国际专利保护，并被加拿大先马士育种公司应用于种公牛的选择，以开发具有高免疫力遗传物质的冻精产品。

2.2 免疫应答性状选择技术应用及优化

研究人员对加拿大荷斯坦牛的细胞及体液免疫应答水平分别进行了遗传分析，发现这些性状的遗传力在0.16～0.41[20]，处于中等水平，说明性状比较稳定，具有良好的抗病育种应用价值。已有研究表明，在犊牛中，抗鸡蛋清溶菌酶和抗人红细胞抗原抗体水平的遗传率分别为0.48 和0.31[21]。而另外一项包括了42 个不同品种牛的研究报告指出，细胞和体液免疫应答性状的遗传力分别为0.19 和0.16[20]。因此，研究这些性状与产奶、繁殖和健康等因素之间的遗传关系，对提高动物健康状况、适应性和繁殖能力具有重要意义。国外奶牛育种公司筛选了具有高免疫反应的种公牛，并利用其精液进行配种，以提高牛群的疾病抗性。根据国内牛群中的研究：在犊牛阶段，高免疫反应水平公牛后代的消化道疾病发病率比普通公牛的后代下降了30.11%；在成母牛阶段，高免疫反应水平公牛后代的乳房炎发病率相比普通公牛的后代降低了45.66%（表1）[22]。

表1 不同免疫应答水平公牛后代各类疾病的发病情况[21]

本课题组总结国内外相关研究内容，深度解析了已经被申请专利的现有免疫应答性状测定技术，并优化了现有技术的免疫方案（图1）。将原有的1 次模式抗原免疫增加至2 次，并在免疫后的第21 天进行免疫应答性状的检测。优化后的方案兼容了免疫记忆效应，可在最大程度上反应被测动物的免疫应答能力，并考虑了免疫应答性状值的变化幅度，进而使测得的各项数据更加准确。

图1 免疫应答性状测定的免疫方案

本课题组现已采用上述优化后的免疫应答性状测定方法，测定了千余头中国荷斯坦成年母牛并获得了一批高、中、低免牛。目前，正在通过单细胞测序和多参数流式细胞术深度挖掘“高免牛”和“低免牛”的新型生物标志物，并采用细胞与分子免疫学方法，通过比较免疫学分析，鉴定奶牛天然免疫能力选择指标或组合，建立新型可定量且易于标准化测定的奶牛遗传性免疫能力选择体系。本研究旨在突破国外奶牛遗传性免疫应答能力选择技术的封锁，攻克高免疫力奶牛种源“卡脖子”技术，并为培育具有自主知识产权的本土化奶牛高免疫力新品系提供理论依据和试验支撑。

除此之外，根据免疫应答性状的分类，对牛进行高免、中免和低免的群体划分，有利于免疫应答性状在生产实践中的应用推广。如图2 所示，先前的研究使用“四分位数”将不同免疫应答性状表型的牛划分为高免、中免和低免牛。该方法避免了因均值和标准差不同所导致的高免、低免牛数量的差异，与生产实际更加吻合。此外，育种值分类已独立用于高免牛和低免牛的筛选[23]，且研究表明，其与表型分类的结果相一致。Bateman 等[24,25]人利用适应性免疫应答性状的育种值选择高免疫反应性和低免疫反应性的猪，研究结果显示，在第1 个世代中高免疫反应的育种值为0.23，低免疫反应的育种值为-0.17，经过8 代选择后，高免疫反应性的育种值达到0.47，而低免疫反应性的育种值为-0.08。上述表型和育种值分类均考虑到了动物的遗传因素，但从商业推广层面来看，使用表型分类更实际，因此目前主要使用表型分类来鉴定奶牛的适应性免疫应答性状水平。

图2 奶牛免疫应答性状表型分类

Heriazon 等[2]研究表明，细胞和体液免疫应答性状表型之间呈负相关。在抗原刺激后，B 细胞分泌抗体并发挥体液免疫功能，而T 细胞则分化为细胞毒性T 淋巴细胞及其他功能亚群并发挥细胞免疫效应。在胸腺依赖性抗原（TD 抗原）的识别和清除过程中，B 细胞在提呈抗原后，需要Th 细胞的辅助才能产生抗体；然而对于非胸腺依赖性抗原（TI 抗原），则无需Th 细胞辅助即可刺激机体产生抗体[26]。因此，体液免疫和细胞免疫虽然效应机制不同，但却是彼此关联、相互调控的。基于其他动物的研究表明，利用“高体液免疫应答”这一标准筛选出的小鼠和鸡，对胞外病原体的感染表现出高抗性，但对胞内病原体易感[27]。因此，在商业应用中，为了培育出综合抗病能力强的 “高免牛新品系”，建议对细胞和体液免疫应答性状同时进行测试，并以此定义高免、中免和低免牛。同时，需要对每个免疫应答性状的表型或育种值进行合理的加权，进而创建一个平衡的指数，以实现两个性状的同步遗传改良，并保持或改进育种指数中包含的其他性状（例如生产性状等）。

现有研究表明，与牛群中的普通奶牛相比，具有卓越适应性免疫应答反应的奶牛能够更好地消除病原菌，并更快地恢复免疫稳态，进而防止乳腺炎等奶牛常见炎症类疾病的发生[28-30]。一项关于适应性免疫应答性状对奶牛乳腺炎发病率影响的研究表明，细胞及体液免疫应答性状与体细胞评分、乳腺炎发病率显著相关。除此之外，免疫性状还可能与生产性状之间存在相互作用关系。在猪中的研究表明，适应性免疫应答性状的遗传选择加快了猪的出栏速度[24]；而在牛中的研究表明，提高产量的遗传选择增加了疾病的易感性[31]。因此，将免疫应答性状纳入育种选择指标是非常具有经济价值的，并且还可以避免在选择其他性状（如产量）时，对免疫应答性状的选择可能产生的负面反应。

3 免疫应答性状选择技术发展趋势

免疫应答性状在牛的育种工作中属于一个新性状，目前仅在加拿大、美国等奶业发达国家推广试用。任何一个新性状在育种中的应用都是在不断的实践中逐渐走向成熟的。通常，随着行业新需求的产生，研究人员会关注一些新的性状，并且开展相关的试验来收集新性状的数据，进而逐步构建出新性状的评价方法和体系。通过经济重要性分析法来确定各性状在选择指标中的权重，并收集更大规模的数据来逐步开展该性状的大规模评价和育种。在该性状的选育过程中，可以观察和测试选育效果，并实时调整相应的选育策略和方法。由此可见，针对任何一个性状的选种选育工作都不是一朝一夕的，需要大量时间积累相关数据，所以选种选育工作要求具备一定的预见性。综上所述，总结奶业发达国家的育种经验，并在中国的牛群中进行相关研究是非常有意义的。

3.1 免疫应答性状选择技术的新突破

加拿大先马士公司率先将免疫应答性状选择技术应用在种公牛的选育工作中，并开发出了“免疫大师”冻精产品，相关技术已申请国际专利，该冻精产品推向市场后获得了广泛的好评。虽然该技术已经被应用于种公牛的抗病选择，但仍存在很多不足之处。例如，现有的技术需要对牛进行保定，工作量巨大，并且测定过程以人工测量为主，存在一定误差，因此目前仅用于极少的高经济价值的种公牛选择，无法广泛应用于其他种公牛和后备母牛。除此之外，目前关于免疫应答性状的相关研究大多集中在表型分析方面，缺乏关于其遗传机制的研究，在一定程度上阻碍了该技术的推广。因此，研究者们一直在对相关方法不断进行完善。

中国市场的奶牛冻精需求量巨大，目前很多牧场已经开始使用“免疫大师”冻精产品。因此，对免疫应答性状进行研究，挖掘新型生物标志物，尤其是开发新型的、具有我国自主知识产权的免疫应答性状测定技术十分重要。和美国、加拿大、荷兰等国家相比，中国在奶牛育种领域的研究还相对落后，对奶牛免疫性状选育的相关工作更是乏善可陈。通过深入解析奶牛免疫应答性状的遗传机制，进而挖掘新型免疫应答性状标志，建立新型免疫应答性状测定技术体系，可实现在该领域的“弯道超车”。对此，本课题组在国内外率先进行了不同免疫应答性状中国荷斯坦牛外周血单个核细胞的单细胞转录组测序工作，首次对牛T、B 细胞进行了多亚群的Marker 基因鉴定和细胞注释，并绘制了中国荷斯坦牛T、B细胞转录组图谱，揭示了不同免疫应答性状中国荷斯坦牛外周血免疫细胞的异质性。在此基础上，创新性地建立了用于中国荷斯坦牛T、B 细胞表型及功能分析的七色流式细胞术方案，并利用该方案首次对不同免疫应答性状奶牛的细胞及体液免疫应答进行了系统而全面的分析，揭示了中国荷斯坦牛适应性免疫应答过程中各T、B 细胞亚群的动态变化及应答机制。本课题组已成功挖掘了可用于评价牛适应性免疫应答能力的T、B 细胞亚群生物标志，并基于新型生物标志开发出一套高效、便捷、标准化的适应性免疫应答水平测定方法。利用以上方法在1000 余头中国荷斯坦牛中进行了初步试用，选育出的“高免牛”综合抗病性能显著提高。目前本课题组正在逐步扩大该方法的应用范围，进行中国荷斯坦牛“高免新品系”的培育工作。

3.2 与其他育种技术的联合应用

免疫应答性状选择技术与其他先进抗病育种技术的结合是未来的发展趋势，基因组选择为改善免疫应答性状提供了一种具有应用前景的工具。由于免疫应答表型的测量工作相对繁琐，基因组学检测可能是一种更好的解决方案，通过使用有关动物遗传学的可用数据，挖掘与高、低免疫应答相关的遗传效应，将免疫反应性状纳入基因组育种指数，以改善畜群健康状况并降低乳腺炎等疾病的发病率。

除此之外，随着分子生物学技术的发展，其在动物遗传育种领域的应用频率日益增加，单细胞测序技术的诞生也为动物遗传育种相关研究提供了新的技术方法。单细胞测序技术是指对单细胞的基因组进行高通量测序分析，目前该项技术在不同家畜的育种工作中均有应用。在猪的研究中，通过对猪的胚胎细胞进行单细胞转录组测序，构建了猪早期胚胎的转录组图谱，发现了很多新的基因[32]，相关结果丰富了猪的遗传资源，对改善猪的重要性状具有重要的意义；在牛的研究中，通过对牛的性腺细胞进行单细胞转录组测序，系统性分析了牛的原始生殖细胞的遗传特征，发现牛的生殖细胞系与人类相似[33]。本课题组在该领域也有所探索，利用单细胞转录组测序技术深入分析了不同免疫应答性状的中国荷斯坦牛外周血免疫细胞的异质性，通过对这些细胞亚群的差异基因筛选及功能富集分析，初步揭示了“高免牛”和“低免牛”表现出的免疫力差异遗传机制，为建立新型可定量、易于标准化测定的奶牛遗传性免疫能力选择方法提供了初步的理论依据和试验支撑。

4 小结

长期高强度的生产性能选育降低了奶牛的抗病性能，疾病的频发给养牛业造成了巨大的经济损失，抗生素的使用带来了潜在的食品安全和公共卫生问题。因此，通过抗病育种提升奶牛综合抗病能力，是改善奶牛健康、降低疾病发生的重要途径。传统的特定疾病抗性选择和健康性状选择周期长、进展小，并且存在生产性能降低和“一病消、多病长”的风险。因此，挖掘能够反映奶牛综合抗病能力，并且易于测定应用的抗病性状或标志是奶牛育种工作中迫切需要解决的重大科学问题。

畜禽免疫学相关研究和新技术的发展为解决上述问题提供了新思路。动物的抗病性能主要取决于自身的免疫系统，适应性免疫应答作为机体抵御感染的“最后一道防线”，具有高效性、特异性和记忆性。细胞和抗体介导的适应性免疫应答分别主要针对胞内和胞外病原体，它们与天然免疫系统分工协作并相互配合。动物的一般抗病性，可以理解为健康性或广谱抗病性。因此，如果同时对细胞和体液免疫性状进行选择，那么对于任何病原体，机体都会拥有良好的自我保护能力，进而实现一般抗病性的遗传改良。细胞和体液免疫性状已被证明具有数量性状特征，是提高奶牛一般抗病性更好的候选性状，可用于奶牛抗病性选种，根据该表型性状筛选的奶牛具有较低的传染性和代谢性疾病的发生率、对疫苗更好的响应和更高的乳品质。然而现有的性状测定方法周期长、操作程序复杂、成本高、技术要求高，目前世界上仅应用于少量种公牛的选择，未来还需要对上述测定方法不断进行优化简化，以便适用于更大群体的后备青年牛和成母牛的选种选育工作。同时，对相关性状与疾病深入关联机制的研究也可能成为一个新的研究热点。建立新型可定量、易于标准化测定的奶牛遗传性免疫能力选择指标以及选择方法，早期识别和选择具有高水平先天免疫应答能力的青年牛，提高奶牛健康水平，培育具有自主知识产权的优质、高产、适应性强的本土化奶牛高免疫力新品系，将是奶牛育种领域的重要趋势。