泽漆水提取物对猪流行性腹泻病毒的体外抑制作用研究

钟睦琪 李凯远 王 雪 刘甜甜,3 杨 明,3 郝智慧*

(1.青岛农业大学 化学与药学院,山东 青岛 266109;2.中国农业大学 动物医学院,北京 100193;3.新疆农业大学 动物医学院,乌鲁木齐 830099)

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)属于冠状病毒科α冠状病毒属,单股正链RNA病毒,全长约28 ku[1]。编码4种结构蛋白(S、E、M、N)、16种非结构蛋白(nsp1-nsp16)和1个辅助蛋白ORF3[2]。PEDV通过粪口传播并在小肠绒毛细胞中感染和复制[3],引起新生仔猪急性腹泻、呕吐、脱水和发烧等症状[4]。自上世纪70年代被发现以来,PEDV以极高的传播速度迅速席卷全球,造成严重的经济损失[5]。2010年发现的PEDV变异株可引发新生仔猪100%的发病率及80%～100%的死亡率[6-7],并且极易与其他冠状病毒(如猪传染性胃肠炎病毒)混合感染[8],口服及注射疫苗效果甚微[9],因此,迫切需要开发新药物来抵御PEDV的传播。

中药在抗病毒方面具有良好的功效。大量研究证明中药提取物可通过多种途径抑制病毒感染。Tang等[10]发现紫苏叶提取物通过灭活病毒粒子抑制SARS-CoV-2复制,与抗病毒药瑞德西韦联合使用表现加成增效作用。Cho等[11]发现淫羊藿水提取物在体内体外均具有良好的抗PEDV作用。Cao等[12]证明油茶叶水提取物可通过抑制氧化应激介导的细胞凋亡来抑制PEDV复制,油茶叶水提物在浓度≥500 μg/mL时可抑制PEDV的复制。总之,中药提取物具有良好的抗病毒功效,可通过多种途径抑制病毒感染,因此在抗PEDV方面具有广阔的研究前景。

泽漆(EuphorbiahelioscopiaL.)是大戟科一年生草本植物,广泛分布于我国除新疆、西藏以外的地区,有清热、祛痰、利尿和消肿之效[13]。以泽漆为主要成分配伍而成的泽漆汤具有清热解咳的功效,在我国被广泛使用。现代药理学研究发现,泽漆还具有抗肿瘤[14]、抗菌[15]、抗氧化[16]、杀虫[17]、抗炎等多种作用[18]。同时,研究发现泽漆还具有抗病毒活性。周广生[19]研究发现泽漆注射液具有抗新城疫病毒的作用,可显著降低感染新城疫病毒的鸡胚死亡率,抗病毒效果优于金刚烷胺。另外,泽漆水煎剂具有体外抗单纯疱疹病毒的作用[20],但是泽漆对于抗PEDV的作用尚未有相关研究,而且提取物使用的剂量越大在生产中投入的成本越高,在临床上的生物安全性越难评估。而泽漆水提物价格低廉,细胞毒性相对较高,在抗病毒研究中使用的剂量更低。因此,本研究探究了不同浓度的泽漆提取物体外抑制PEDV的作用和对PEDV复制的影响,以期挖掘泽漆在抗PEDV方面的应用潜力。

1 材料与方法

1.1 试验毒株与细胞系

猪流行性腹泻病毒(CV777株,GenBank AF353511)、非洲绿猴肾细胞(Vero CCL-81)由本研究室保存,用含1%双抗、10% FBS的高糖 DMEM 培养基,于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。

1.2 试验试剂

泽漆干燥全草由中国农业大学中兽医药创新中心提供。鼠源PEDV-N蛋白单克隆抗体购于Medgene Labs公司;鼠源GAPDH单克隆抗体购于武汉三鹰生物技术有限公司;山羊抗鼠/兔 IgG-HRP购于艾比玛特生物医药(上海)有限公司;反转录试剂盒、SYBR Green Realtime PCR Master Mix购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司;细胞增殖及毒性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)、ECL发光液购于美国MCE公司;利巴韦林(Ribavirin,Rib)、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)购于北京索莱宝科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1泽漆水提取物制备

准确称量泽漆药材20 g,粉碎后过60目筛,泽漆细粉与蒸馏水按照料液1∶9混合,浸泡30 min。加热回流3次,每次2 h,浓缩为50 mL提取液(0.400 g/mL)。经冷冻干燥,获得5.283 g水提物冻干粉末。精确称量20 mg冻干粉末用10 mL蒸馏水溶解配置为2 000 μg/mL的母液,经0.22 μm滤膜过滤后于-20 ℃保存。

1.3.2泽漆水提取物对细胞的毒性测定

Vero细胞接种于96孔细胞培养板,密度为5×104个/mL。细胞置于CO2培养箱内培养24 h后加入不同浓度(125、250、500、1 000和2 000 μg/mL)的泽漆水提物,分别在12、24和36 h时添加CCK-8试剂,继续孵育1 h后测定450 nm处的吸光度并计算各组细胞存活率,并依据GB/T 16886—5中细胞毒性的判定标准(细胞活力<空白组70%),判定泽漆水提物有无细胞毒性。

1.3.3RT-qPCR法检测泽漆水提物对PEDV-NmRNA表达量的影响

Vero细胞接种于6孔细胞培养板,密度为2.5×105个/mL。将不同浓度的泽漆水提物(62.5、125、250和500 μg/mL)与PEDV(MOI=0.01)在37 ℃下共同孵育2 h,弃去病毒药物混合液,加入泽漆水提取物继续孵育至24 h。使用Trizol试剂提取Vero细胞中的RNA,并用Nanodrop检测其质量浓度。使用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA,以cDNA为模板进行荧光定量PCR反应,引物序列如表1所示。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequence of RT-qPCR

反应条件:2×Taq Pro Universal SYBER qPCR Master Mix 10 μL,上下游引物各0.4 μL,cDNA 2 μL,DEPC水补齐总体系为20 μL。反应条件为 95 ℃预变性30 s,95 ℃持续变性10 s,60 ℃退火延伸 30 s,共40个循环。

1.3.4泽漆水提物对PEDV病毒滴度的影响

Vero细胞接种于96孔细胞培养板,密度为5×104个/mL。药物与病毒处理方法同1.3.3,24 h后收集细胞上清液。将细胞上清液依次10倍稀释为10-1～10-88个梯度后加入96孔板内(每孔100 μL),37 ℃孵育72 h后通过间接免疫荧光观察PEDV感染情况,病毒滴度由Reed-Muench法计算得出。

1.3.5Western Blot检测泽漆水提物对PEDV-N蛋白表达的影响

Vero细胞接种于6孔细胞培养板,密度为2.5×105个/mL。药物与病毒处理方法同1.3.3,细胞使用Western IP裂解液裂解30 min后于12 000 r/min离心15 min。上清液与Protein Loading Buffer混匀,在95 ℃金属浴变性10 min后获得蛋白样品。蛋白质用10% SDS-PAGE分离,将聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白湿转于PVDF膜上,使用5% 脱脂牛奶在37 ℃下孵育1.5 h。TBST清洗3次后,分别与鼠源PEDV-N蛋白单克隆抗体(1∶1 000)、鼠源GAPDH单克隆抗体(1∶8 000)4 ℃过夜孵育。TBST清洗3次,再加入IgG-HRP(1∶5 000)常温孵育1 h。使用ECL发光液检测蛋白免疫印迹反应并通过Image J软件进行灰度值分析。

1.3.6间接免疫荧光法检测泽漆水提物对PEDV病毒感染的影响

Vero细胞接种于24孔细胞培养板,密度为1.5×105个/mL。药物与病毒处理方法同1.3.3,细胞于4%多聚甲醛溶液中固定15 min,PBS清洗3次。使用0.3% Triton X-100对细胞处理10 min,并于3%牛血清白蛋白溶液中常温封闭1 h。细胞在2%明胶稀释的1∶1 000的鼠源PEDV-N蛋白单克隆抗体中4 ℃孵育过夜,PBST清洗3次后与山羊抗鼠IgG-FITC在37 ℃孵育1 h。在PBST中洗涤3次后,使用DAPI染色5 min后于荧光显微镜下观察。

1.3.7泽漆水提物预防给药对PEDV-N表达的影响

将不同浓度的泽漆水提物(125、250和500 μg/mL)和阳性药物Ribavirin(80 μg/mL)在37 ℃条件下与Vero细胞共孵育2 h,弃掉药液。Vero细胞接种PEDV(MOI=0.01)37 ℃孵育2 h,弃掉病毒液,补充病毒维持液37 ℃下孵育至24 h,收集蛋白进行Western Blot检测。

1.3.8泽漆水提物对PEDV复制周期各个阶段PEDV-N表达的影响

1.3.8.1泽漆水提物对PEDV吸附阶段PEDV-N表达的影响

将不同浓度的泽漆水提物(125、250和500 μg/mL)和阳性药物Ribavirin(80 μg/mL)分别与PEDV(MOI=0.01)混合后感染细胞,在4 ℃孵育1 h,弃掉病毒药物混合液,补充病毒维持液37 ℃孵育24 h,收集蛋白进行Western Blot检测。

1.3.8.2泽漆水提物对PEDV入侵阶段PEDV-N表达的影响

Vero细胞接种PEDV(MOI=0.01)在4 ℃孵育2 h,2 h后弃掉病毒液,预冷PBS清洗3次。Vero细胞与泽漆水提物、阳性药物Ribavirin(80 μg/mL)37 ℃孵育2 h,2 h后弃掉药液,补充病毒维持液在37 ℃条件下孵育至24 h,收集蛋白进行Western Blot检测。

1.3.8.3泽漆水提物对PEDV复制增殖阶段PEDV-N表达的影响

Vero细胞接种PEDV(MOI=0.01)在37 ℃孵育2 h,2 h后弃掉病毒液,PBS清洗3次。Vero细胞与泽漆水提物、阳性药物Ribavirin(80 μg/mL)在37 ℃条件下孵育至24 h,收集蛋白进行Western Blot检测。

1.4 统计方法

试验结果以“平均值±标准方差”方式表示。使用Excel 2021、GraphPad Prism 8.0进行绘图及统计分析。通过One-way ANOVA分析显著性差异,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

2 结果与分析

2.1 泽漆水提取物对细胞毒性分析

如图1所示,当泽漆水提取物与Vero细胞共孵育12和24 h时,浓度≤1 000 μg/mL,Vero细胞的存活率均大于85%,浓度为2 000 μg/mL会显著降低Vero细胞的存活率(P<0.001);泽漆水提物与Vero细胞共孵育36 h时,浓度≤500 μg/mL,Vero细胞的存活率>90%,浓度≥1 000 μg/mL会显著降低Vero细胞的存活率(P<0.01)。结果表明,泽漆水提物的浓度≤500 μg/mL时,无细胞毒性。

**和***分别代表与浓度为0 μg/mL的空白组相比差异显著和极显著(P<0.01,P<0.001)。** and *** represent significant differences and extremly significant differences compared to the blank group, respectively (P<0.01, P<0.001).图1 泽漆水提物在12、24和36 h对细胞毒性的影响Fig.1 Cytotoxicity of aqueous extract from Euphorbia helioscopia L. to Vero at 12, 24 and 36 h

2.2 泽漆水提取物对PEDV-N mRNA转录水平及病毒滴度的影响

RT-qPCR检测表明泽漆水提物对PEDV-NmRNA的转录具有显著抑制作用(图2(a))(P<0.001),当泽漆水提物浓度为62.5 μg/mL时,其抑制率达96.17%。病毒滴度检测进一步证明了泽漆水提物以剂量依赖的方式抑制PEDV感染(图2(b)),当泽漆水提物浓度为500 μg/mL时,可将病毒滴度降低3～4个数量级。结果表明,泽漆水提取物以剂量依赖的方式抑制PEDV感染。

图2 泽漆水提物对PEDV-N mRNA转录水平(a)及病毒滴度(b)的影响Fig.2 Effects of aqueous extract from Euphorbia helioscopia L. onPEDV-N mRNA transcription level (a) and virus titer (b)

2.3 泽漆水提取物在PEDV感染12、24和36 h时对PEDV-N表达的影响

蛋白免疫印迹(图3)及间接免疫荧光(图4)结果表明,在12、24和36 h时,不同浓度的泽漆水提物均能显著抑制PEDV-N蛋白的表达(P<0.05)。当泽漆水提物浓度≤250 μg/mL时,对PEDV-N蛋白的抑制随时间的增加而降低。当泽漆水提物浓度为500 μg/mL时,36 h内均能有效抑制PEDV-N蛋白的表达。结果表明,泽漆水提物可长效抑制PEDV感染。

(a)PEDV-N蛋白在12、24和36 h的表达;(b)12、24和36 h PEDV-N蛋白定量分析。(a) PEDV-N protein expression at 12, 24 and 36 h; (b) Quantitative analysis of PEDV-N protein at 12, 24 and 36 h.图3 Western Blot检测不同浓度泽漆水提物对PEDV-N蛋白表达影响Fig.3 Effects of aqueous extract from Euphorbia helioscopia L. with different concentrations on PEDV-N protein expression were determined by Western Blot

图4 间接免疫荧光检测不同浓度泽漆水提物在12、24 和36 h对PEDV-N蛋白表达影响Fig.4 Effects of aqueous extract from Euphorbia helioscopia L. at 12, 24 and 36 h with different concentrations on PEDV-N protein expression were determined by IFA

2.4 泽漆水提取物预防给药对PEDV-N表达的影响

由图5可知,泽漆水提物预处理不能抑制PEDV-N蛋白的表达(P>0.05),因此泽漆水提物无预防PEDV感染的作用。

图5 Western Blot检测泽漆水提物预防给药对PEDV-N蛋白表达影响(a)及其定量分析(b)Fig.5 Effects of preventive administration of aqueous extract from Euphorbia helioscopia L. on PEDV-N protein expression was determined by Western Blot (a) and its quantitative analysis (b)

2.5 泽漆水提取物在PEDV复制周期的各个阶段对PEDV-N表达的影响

由图6(a)可知,在病毒吸附阶段,泽漆水提取物可显著抑制PEDV-N蛋白表达(P<0.001),而阳性药物Ribavirin对PEDV-N蛋白的表达无显著影响(P>0.05)。在病毒复制增殖阶段,泽漆水提物和Ribavirin均可有效抑制PEDV-N蛋白表达(P<0.001)(图6(c))。在病毒的入侵阶段,泽漆水提物和Ribavirin对 PEDV均无显著抑制作用(P>0.05)(图6(b))。因此,泽漆水提物影响PEDV生命周期中的吸附和复制增殖阶段。

3 讨论与结论

猪流行性腹泻病毒引发的大量仔猪死亡已在全球形成了巨大的防疫危机和经济损失,然而目前仍不能很好地防御PEDV对养殖业的侵袭。泽漆是我国的传统草药,其提取物中富含芦丁、槲皮素等多种生物活性成分。芦丁是双黄连、连花清瘟等抗病毒中药复方的主要成分[21],槲皮素可通过结合PEDV 3CLpro蛋白酶来抑制PEDV复制[22]。基于泽漆中芦丁、槲皮素等化合物的抗病毒作用,推测泽漆水提物具有抗PEDV的潜力。本研究首先通过CCK-8法证明了泽漆水提物在浓度≤500 μg/mL时无细胞毒性,之后通过RT-qPCR和病毒滴度检测证明了泽漆水提物以剂量依赖的方式显著降低PEDV-NmRNA的转录水平,同时降低了病毒滴度。然后探究了泽漆水提物抗PEDV的时间依赖关系,证明泽漆水提物在12、24和36 h均能显著抑制PEDV-N蛋白的表达。随感染时间的延长,泽漆水提物抑制PEDV的能力略有减弱,在12 h内抑制效果最佳。高浓度(500 μg/mL)的泽漆水提物在病毒感染36 h时仍能有效抑制PEDV-N蛋白的表达,说明泽漆水提物具有长效抗PEDV感染的作用。上述研究结果表明泽漆水提物具备抗PEDV的能力。近年来,传统中药在抗PEDV的活性被广泛挖掘,王亭亭[23]的研究表明,黄芪多糖提取物在最高浓度400 μg/mL时能使PEDV病毒滴度下降1～2个数量级,而泽漆水提物在浓度为250 μg/mL时即可使病毒滴度下降1～2个数量级,在最高浓度500 μg/mL时令PEDV病毒滴度削减3～4个数量级。Liu等[24]研究表明,马齿苋提取物在浓度为25 mg/mL时显著降低PEDV 总RNA水平,抑制率达92.73%,而泽漆水提物在最低浓度为62.5 μg/mL时抑制率为96.17%,具有更高抑制活性。因此,泽漆水提物具有较好的抗病毒活性。

PEDV的生命周期是从病毒表面的S蛋白与细胞表面的受体结合开始的[25-26]。病毒通过膜融合或受体细胞的吞噬进入细胞并释放其基因组,之后以“不连续转录”的机制参与PEDV基因组复制和结构蛋白mRNA的合成,不连续基因组被翻译为PEDV的4个结构蛋白和1个辅助蛋白[27-28]。最后,PEDV在内质网完成装配,经高尔基体释放出胞外。因此,抗病毒药物的开发可聚焦于如何阻断PEDV正常生命周期的进程。已有大量研究表明中药提取物可作用PEDV生命周期的一个或多个阶段来降低病毒蛋白的表达,抑制病毒感染。如Lee等[29]通过乙醇提取法获取的银杏外种皮多糖可通过抑制病毒吸附和入侵这2个途径来抑制PEDV感染,Xu等[30]通过水提法获取的芦荟水提取物则可以通过抑制病毒复制这一途径来抑制PEDV感染。本研究以RNA聚合酶抑制剂Ribavirin为阳性对照药物,探究泽漆水提物对PEDV生命周期的影响。Western Blot结果表明,在PEDV感染前,使用泽漆水提物预处理Vero细胞不能降低PEDV-N蛋白的表达量,说明泽漆水提物无预防PEDV感染的作用。在PEDV生命周期的吸附和复制增殖阶段,泽漆水提物显著降低了PEDV-N蛋白的表达水平,这表明泽漆水提物是通过阻断PEDV对Vero细胞的吸附和病毒自身基因组的复制增殖发挥了抗病毒效果,其在PEDV入侵阶段无效。泽漆水提物抗PEDV的机制可能是阻断了病毒粒子与Vero细胞表面某种受体的结合从而使病毒无法正常吸附到细胞表面。同时,泽漆水提物对PEDV基因组复制也有一定抑制作用,但具体影响了哪种复制酶的活性或哪条通路尚未探究,这也成为后期研究的重点。泽漆水提物复杂的化合物组成为抗PEDV提供了多条途径,有效增强了抗PEDV的效果。其复杂的化学组成也增加了提取有效成分的难度,泽漆水提物中抑制PEDV有效成分的分离将是接下来面临的挑战。

综上所述,泽漆水提物对PEDV具有良好的体外抑制作用,主要通过抑制病毒吸附和复制增殖2个阶段实现抗病毒作用,因而具备抗PEDV的潜在应用价值。泽漆作为民间常见的中草药,价格低廉,深入挖掘其抗病毒活性在实际生产生活中具有深远意义。本研究对泽漆水提物的抗病毒作用进行了机理分析,为进一步探究泽漆水提物抗病毒机制奠定了基础,但具体何种化学成分主导了抗病毒效果尚不明确,这将是今后研究的方向。