国产与进口两种商品化NBB培养基检测啤酒有害菌的效果比较

李艳艳 刘小燕 赵琳娜 白继超 崔生辉 徐中清

摘 要：目的：比较国产和进口NBB培养基对啤酒有害菌的检测效果。方法：将干酪乳杆菌、短乳杆菌、四联球菌、戊糖片球菌、乳酸乳球菌乳脂亚种、植物乳杆菌植物亚种6株乳酸菌接种到NBB-B和NBB-A培养基中，28 ℃厌氧培养24～72 h，测定OD值，观察培养基变色、菌落生长状态等。同时，用不同浓度麦芽啤酒配制NBB培养基，确定配制培养基用啤酒的最适麦芽度。结果：6株乳酸菌在国产和进口NBB-B培养基中灵敏度和指示特征无明显差异。戊糖片球菌在国产NBB-A培养基培养48 h变色情况略差于进口NBB-A，培养72 h后，与进口NBB-A培养基无差异。通过不同麦芽度比对试验，采用10°P啤酒配制的NBB培养基菌株生长情况最好。结论：国产与进口NBB培养基在灵敏度、指示能力、菌落生长等方面无明显差异，国产NBB培养基可用于国内啤酒生产企业检测啤酒有害菌。

关键词：NBB培养基；啤酒有害菌；麦芽度；乳酸菌

Abstract： Objective： To compare the detection effect of domestic and imported NBB culture media on harmful bacteria in beer. Method： Six strains of lactic acid bacteria， including Lactobacillus casei， Lactobacillus brevis， Micrococcustetragenus， Pediococcuspentosaceus， Lactococcus lactis subsp. cremoris， and Lactobacillus plantarum subsp. plantarum， were inoculated into NBB-B and NBB-A media. They were anaerobic cultured at 28 ℃ for 24～72 h， and their OD values were measured. The discoloration of the media and the growth status of the colonies were observed. At the same time， prepare NBB culture medium with different concentrations of malt beer to determine the optimal malt content of the beer used for preparing the culture medium. Result： There was no significant difference in sensitivity and indicator characteristics between the 6 strains of lactic acid bacteria in domestic and imported NBB-B culture media. After 48 hours of cultivation on domestic NBB-A medium， the appearance of Pediococcuspentosaceus turned slightly worse than that on imported NBB-A. After 72 hours of cultivation， there was no difference compared to imported NBB-A medium. Through the comparison experiment of different malt degrees， the NBB culture medium prepared with 10°P beer showed the best growth performance. Conclusion： There is no significant difference in sensitivity， indicator ability， and colony growth between domestic and imported NBB culture media. Domestic NBB culture media can be used for detecting harmful beer bacteria in domestic beer production enterprises.

Keywords： NBB culture medium; harmful bacteria in beer; malt degree; lactic acid bacteria

啤酒是一種以麦芽为原料，经酵母发酵酿制而成的低酒精度酿造酒。啤酒酿造是一个比较复杂的过程，在生产过程中难免会被有害菌污染。这些有害微生物在啤酒中生长繁殖，会影响啤酒的质量和风味，严重时会造成巨大的经济损失。啤酒中有害菌按照生理学分类，主要分为细菌、野生酵母和霉菌[1]；按照对啤酒的有害程度可分为专性啤酒有害菌、潜在啤酒有害菌、间接啤酒有害菌、指示性微生物和潜伏微生物5个等级，其中专性啤酒有害菌对啤酒质量稳定性的影响最大，包括乳酸杆菌、四联球菌、果胶杆菌和酿酒酵母等。

啤酒厂十分重视对啤酒有害菌的检测，主要采用传统平板计数法检测，使用的培养基主要有VLB-S7、ABD、MRS和NBB等，其中NBB培养基是一种能生长啤酒有害菌和多种野生酵母的选择性和鉴别性培养基[2]。成品化NBB培养基的主要产品有NBB-A（NBB固体培养基）、NBB-B（NBB液体培养基）、NBB-C（NBB浓缩液体培养基）3种。NBB培养基添加了啤酒液体，为污染微生物的生长提供了相似的生长环境，NBB含有的半胱氨酸盐酸盐可以降低培养基的氧化还原电位，有利于乳酸菌的生长。NBB-A和NBB-B中含有酸性指示剂，如果细菌产酸，培养基的颜色将由红色变成黄色；NBB-C不含指示剂，为浓缩液体培养基，适用于已发现的所有啤酒有害菌的检测，是目前啤酒厂使用最多的培养基[3]。但目前NBB培养基依赖进口，价格较昂贵，供货周期较长，增加了啤酒生产在检测过程中的成本。目前国产商品化NBB培养基并不多，本研究将国产的啤酒有害细菌培养基与进口品牌NBB-B培养基进行比对验证，旨在为国内啤酒生产企业进行培养基选择时提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）ABX0009、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）ABX0010、四联球菌（Micrococcustetragenus）ABX0011、戊糖片球菌（Pediococcuspentosaceus）ABX0013、乳酸乳球菌乳脂亚种（Lactococcus lactis subsp. cremoris）ABX0012、植物乳杆菌植物亚种（Lactobacillus plantarum subsp. plantarum）ABX0015，由北京奥博星生物技術有限责任公司保存提供；NBB-B培养基（批号20210326）、琼脂粉（批号0145）、MRS培养基（批号20210326），北京奥博星生物技术有限责任公司；NBB-B培养基（批号：0005399414），德国德乐；10°P啤酒，燕京；12°P啤酒，德国进口；14.5°P啤酒，美国进口；厌氧袋，日本三菱。

1.2 仪器与设备

DHP培养箱，天津中环试验仪器厂；S20 pH计、XS205DU电子天平，瑞士梅特勒；YX-280D手提式灭菌器，合肥华泰医疗设备有限公司；UV-1800紫外分光光度计，岛津仪器（苏州）有限公司；SY2D超净工作台，江苏博莱尔净化设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌液制备方法

（1）菌种活化。将保存于-80 ℃条件下的菌种取出，用接种环取一环接种于MRS培养基中，36 ℃厌氧培养72 h，再取单菌落划线于MRS培养基，36 ℃厌氧培养72 h，二代新鲜培养物备用。

（2）菌液稀释。用无菌棉签取MRS平板二代新鲜培养物于无菌生理盐水中，制成菌悬液，OD值为1.0～1.5，再分别用生理盐水稀释至接种水平为20～200 CFU/100 μL的工作菌悬液。

1.3.2 培养基配制方法

（1）不同麦芽度啤酒配制NBB-B培养基。按照进口和国产NBB-B培养基配方说明分别称取配制500 mL培养基用量干粉于250 mL去离子水中，加热煮沸溶解，再分别加入250 mL经脱气的10°P、12°P和14.5°P不同麦芽度的啤酒，调整pH值为5.8±0.2，分装10 mL/支，121 ℃高压灭菌15 min，备用。

（2）NBB-B培养基配制方法。按照进口和国产NBB-B培养基配方说明分别称取配制500 mL培养基用量干粉于250 mL去离子水中，加热煮沸溶解，再加入250 mL经脱气的10°P啤酒，调整pH值为5.8±0.2，分装10 mL/支，121 ℃高压灭菌15 min，备用。

（3）NBB-A培养基配制方法。按照进口和国产NBB-B培养基配方说明分别称取配制500 mL培养基用量干粉于250 mL去离子水中，加入琼脂粉7.5 g，加热煮沸溶解，再加入250 mL经脱气的10°P啤酒，调整pH值为5.8±0.2，121 ℃高压灭菌15 min，冷至50 ℃时无菌环境下制备平板，备用。

1.3.3 微生物生长效果检验方法

（1）不同麦芽度啤酒配制培养基微生物生长效果对比。取100 μL工作菌悬液接种至10 mL 10°P、12°P和14.5°P不同麦芽度啤酒配制的培养基中，每株菌接种2支并取1支作为空白对照，28 ℃厌氧培养72 h，培养过程中观察菌株在培养基中的生长浊度及颜色变化。

（2）国产和进口NBB-B培养基菌株培养效果对比实验。取100 μL工作菌悬液接种至10 mL NBB-B培养基中，每株菌接种2支并取1支作为空白对照，28 ℃厌氧培养72 h，培养过程中每24 h观察不同菌种在各培养基中的生长浊度及颜色变化，并检测菌液OD620值。

（3）国产和进口NBB-A培养基菌株培养效果对比实验。取100 μL工作菌悬液涂布于国产和进口NBB-A培养基中，每株菌涂布2块并取1块作为空白对照，同时用MRS琼脂培养基进行计数。28 ℃厌氧培养72 h，培养过程中观察检测平板的颜色变化情况和菌落形态。

2 结果与分析

2.1 不同麦芽度啤酒对NBB-B培养基的影响

将6株乳酸菌分别接种于3种麦芽度啤酒配制的国产和进口NBB-B培养基中，28 ℃厌氧培养72 h，观察菌液浓度和培养基颜色。由表1可知，6株乳酸菌在10°P啤酒配制的国产和进口NBB-B培养基中生长特征和灵敏度均无差异；短乳杆菌在12°P啤酒配制的进口NBB-B培养基不变色，戊糖片球菌在12°P啤酒配制的国产和进口NBB-B培养基中均微变黄色，其他4株乳酸菌在12°P啤酒配制的国产和进口NBB-B培养基中生长浓度均无明显差异；但在14.5°P啤酒配制的国产和进口NBB-B培养基中除戊糖片球菌在国产培养基中微变黄色，其他菌株在培养基中生长均不变色，四联球菌在两种培养基中均不生长，短乳杆菌在进口NBB-B培养基中生长浊度低，乳酸乳球菌乳脂亚种在两种培养基中生长浊度低。

麦芽度浓度越高培养基灵敏度越差，麦芽度浓度增高对四联球菌和乳酸乳球菌乳脂亚种菌株的生长存在抑制作用，戊糖片球菌培养基变色差。结果显示采用麦芽度为10°P啤酒配制培养基效果较好。

2.2 国产和进口NBB-B培养基菌株生长对比实验结果

6株乳酸菌接种至国产和进口NBB-B培养基中，28 ℃厌氧培养24 h，均可见菌株微弱生长，但培养基颜色均未发生变色；培养36 h，培养基均明显浑浊，肉汤均由红色变微黄色；培养至48 h，菌株均生长良好，培养基均变黄色。

根据6株乳酸菌在国产和进口NBB-B培养基中不同生长时间菌液OD620值绘制曲线，图1结果显示，在培养24 h、36 h、48 h后，短乳杆菌和乳酸乳球菌乳脂亚种在国产培养基中OD620值均高于进口培养基，其他4株菌无明显差异。

2.3 国产和进口NBB-A培养基菌株生长对比实验结果

6株乳酸菌接种至国产和进口NBB-A培养基中，28 ℃厌氧培养48 h，戊糖片球菌在国产和进口培养基中菌落生长数量无差异，在国产NBB-A平板中菌落周围培养基变黄，平板上有少量红色区域；在进口培养基中菌落周围培养基变黄，平板上红色区域多。其他5株乳酸菌在国产和进口培养基中菌落圆润、生长丰满，均为乳白色菌落，培养基全部变黄，详见图2。培养72 h，6株乳酸菌在国产和进口NBB-A培养基中菌落生长数量和形态均无明显差异，培养基全部变黄，菌落计数结果详见表2。

3 讨论

啤酒生产过程中微生物污染会严重影响产品质量，造成产品变质[4]。啤酒中有害菌会影响啤酒质量稳定性，其中乳酸杆菌、四联球菌对啤酒的危害最大，能使啤酒产生浑浊和异味，它们能耐受啤酒中特殊的条件，在低pH值、厌氧、含有一定量的酒精、缺乏一定量营养物质和低温的环境下仍能在啤酒中很好地生长[5]。研究发现，啤酒中必然有害菌中短乳杆菌出现概率约为40%，干酪乳杆菌出现概率约为3%，片球菌出现概率约为17%[6]；有研究从工艺啤酒中分离出23株啤酒腐败菌，经鉴定为15株短乳杆菌、3株植物乳杆菌、1株副布氏乳杆菌、2株副干酪乳杆菌和2株达氏片球菌[7-8]。本研究使用干酪乳杆菌、短乳杆菌、四联球菌、戊糖片球菌、乳酸乳球菌乳脂亚种和植物乳杆菌植物亚种6种啤酒中必然有害菌对国产和进口NBB进行验证，结果显示6种乳酸菌在国产和进口NBB培养基中均能生长良好。

NBB配制说明中使用水和啤酒按照1∶1比例配制NBB-B培养基。有研究发现啤酒浓度越高，对啤酒有害菌的抑制能力越强[9]。本次验证实验采用10°P、12°P、14.5°P 3种麦芽度啤酒配制NBB-B培养基，結果显示6株乳酸菌在10°P麦芽啤酒配制的国产和进口NBB-B培养基中生长灵敏度和特征无明显差异；戊糖片球菌在12°P麦芽啤酒配制的国产和进口培养基中变色均差，生长浓度无差异；短乳杆菌在12°P麦芽啤酒配制的国产培养基中变黄色，在进口培养基中不变色，生长浓度无差异；在14.5°P麦芽啤酒配制的国产和进口NBB-B培养基中除戊糖片球菌在国产培养基中微变黄色，其他菌株在培养基中生长均不变色，四联球菌在两种培养基中均不生长，短乳杆菌在进口NBB-B培养基中生长浊度低，乳酸乳球菌乳脂亚种在两种培养基中生长浊度低。由此可见，麦芽度浓度越高培养基灵敏度越差，浓度增高对四联球菌和乳酸乳球菌乳脂亚种菌株的生长存在抑制作用，戊糖片球菌培养基变色差。本研究采用麦芽度为10°P的啤酒配制的培养基效果较好。

啤酒工厂用于啤酒有害菌检测的培养基主要有R-R培养基、NBB系列培养基以及MRS培养基[10]。R-R培养基主要选择性检测乳酸菌和片球菌，对巨球菌不能检出[11]；MRS培养基主要选择性检测乳酸菌和片球菌；NBB系列培养基检测范围较广，基本可以检测所有啤酒有害菌[12]。国内学者比较了乳酸短杆菌、四联球菌、醋化醋酸杆菌在NBB、MRS、Raka-Ray、VLB-S7、番茄汁培养基、自配培养基A和自配培养基UBA上的生长情况，结果显示NBB对乳酸杆菌的检测效果最好[13-14]。本研究选用国产NBB与进口NBB进行了比较，结果显示6株乳酸菌在国产NBB培养基中生长72 h灵敏度和菌落特征与进口NBB培养基无明显差异。

4 结论

通过不同麦芽度比对试验，采用10°P啤酒配制的NBB培养基菌株生长情况最好。6株乳酸菌在国产和进口NBB-B培养基中生长灵敏度和指示特征无明显差异，在国产NBB-A培养基与进口NBB-A培养基培养72 h菌落生长特征无明显差异。目前NBB培养基依赖进口，价格较昂贵，供货周期较长，国产NBB培养基可供于国内啤酒生产企业，降低检测成本。

参考文献

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