黄柏及黄柏酒炙品的薄层色谱鉴别方法的研究与改进

阮文辉,叶松华,冯夏珍,吴哲,薛润苗,罗晋萍,许信学,王晓燕*

(1.山西省药品审评中心(山西省医药与生命科学研究院),山西 太原 030006;2.山西省药品检查中心,山西 太原 030031;3.山西省食品药品检验所,山西 太原 030031;4.山西华康药业股份有限责任公司,山西 运城 044000)

黄柏为芸香科植物黄皮树(PhellodendronchinenseSchneid.)的干燥树皮,习称“川黄柏”,性苦,寒,归肾、膀胱经,清热燥湿,泻火除蒸,解毒疗疮[1-3],主产地主要有四川、贵州、湖北、云南,以四川、贵州产量最大[4],现行《中华人民共和国药典》(2020版)收载黄柏、盐黄柏和黄柏炭,未收载酒黄柏,也无薄层色谱鉴别标准。但酒黄柏在我国应用广泛,历史悠久[5-7]。黄柏的酒制初载于唐代《银海精微》[8],谓之:“酒柏”。清代《本草从新》[9]曰“生用降实火,炒黑止崩带,酒制治上,蜜制治中,盐制治下”。在常用方剂中生品多用于清热剂,如“黄柏丸”(清肠止痢)[10]、“黄连解毒汤”(泻火解毒)[11];酒制多用于清上焦热,如“还睛丸”(清热散风明目)[12]、“清上泻火汤”(清虚热散头风)[13]。

薄层色谱鉴别一直是中药材真伪快速鉴别的常用方法,具有设备要求低、操作简便、检测速度快,效率高、适用性强等优势在中药材快速鉴别中得到广泛应用[14-17]。现有的黄柏、酒黄柏薄层鉴别方法如表1所示,本课题组多次尝试采用《中国药典》(2020年版)中所载方法进行黄柏和酒黄柏的薄层色谱鉴别,发现操作繁琐,重复性较差,对实验试剂质量和人员操作要求较高,加大了黄柏和酒黄柏快速鉴别的难度。本文尝试对现行黄柏薄层色谱鉴别方法进行研究与改进,以期获得操作较为简单、检测速度快、重复性好、稳定性高的薄层色谱鉴别方法,用于黄柏、酒黄柏饮片的质量控制。

表1 文献报道黄柏、酒黄柏薄层鉴别方法

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验样品

本实验所用十五批黄柏药材和三批关黄柏购自河北安国,经山西省药检所罗晋萍主任药师鉴定分别为木兰科植物黄皮树(PhellodendronchinenseSchneid.)的干燥树皮和芸香科植物黄檗(PhellodendronamurenseRupr.)的干燥树皮,信息见表2。

表2 黄柏饮片来源及制备

1.1.2 实验仪器

XSR-205DU/AC型电子天平(瑞士METTLER);SB25-12DTD型超声波清洗器(宁波新芝);CBIO21多功能暗箱式紫外分析仪(北京赛百奥);CY型滚筒式炒药机(南京腾阳);双槽层析缸(上海垒固)。硅胶G板(批号:020190411,烟台江友);硅胶GF254板(批号:20061021,青岛海洋);微量毛细管(1 μL,批号:889892;3 μL,批号:895254,德国,HIRSCHMANN)。

1.1.3 实验试剂

盐酸小檗碱对照品(批号:110713-202015,中国食品药品检定研究院);盐酸黄柏碱对照品(批号:111895-201805,中国食品药品检定研究院);黄柏对照药材(批号:121510-201807,中国食品药品检定研究院);冀州黄酒(批号:20200806),石家庄栾城黄酒厂;甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氨水(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);三氯甲烷、甲苯、异丙醇(分析纯,天津市大茂化学试剂厂)。

1.2 实验方法

1.2.1 黄柏炮制

文献报道黄柏炮制方法多样[18-21],本文参照国家及多省份中药材炮制标准、中药饮片厂通行酒黄柏炮制规范并采信老药工的数十年酒黄柏炮制经验,采用以下酒黄柏炮制方法:取黄柏丝100 kg,加黄酒10 kg拌匀,置罐或适宜的容器内闷润60 min至酒尽,取出,炒干(品温150～170 ℃),偶有焦斑,即得。

1.2.2 样品溶液的制备及检视

取药材粉末 0.1 g,加甲醇5 mL,超声提取(功率250 W,频率40 kHz)30 min,滤过,滤液用甲醇补足5 mL,作为供试品溶液。另取黄柏对照药材0.1 g,同法制成对照药材溶液。再另取盐酸小檗碱和盐酸黄柏碱对照品,加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液,作为对照品溶液,用毛细管点样1～9 μL,展开、取出、晾干,置紫外灯(365 nm)下检视。

2 结果与分析

2.1 薄层色谱鉴别条件考察

2.1.1 薄层色谱鉴别提取溶剂考察

本实验考察了提取溶剂分别为甲醇、乙醇、乙酸乙酯对酒黄柏1的提取效果的比较,见图1。甲醇提取液荧光点的大小和强度最高,荧光点均匀且聚集,明显高于乙醇和乙酸乙酯,甲醇作为提取溶剂利于提升检测系统的灵敏度。

供试品溶液:1.甲醇;2.乙醇;3.乙酸乙酯;4.盐酸黄柏碱对照品;5.盐酸小檗碱对照品;点样量:3 μL

2.1.2 薄层色谱鉴别展开系统考察

实验对四种展开体系进行了考察,结果显示,展开剂Ⅳ:乙酸乙酯-甲醇-三氯甲烷-氨水-三乙胺(V乙酸乙酯∶V甲醇∶V三氯甲烷∶V氨水∶V三乙胺=6∶2∶2∶1∶1)的荧光点集中清晰、不易漂移,且检测精度较高,重复性较好。除出现了小檗碱的亮黄色荧光,还出现了蓝色荧光和绿色荧光,见图2。初步估计薄层色谱图中绿色荧光点为黄柏酮类物质,蓝色荧光点为木兰花碱类物质的荧光所致,有待后续研究。

展开剂I:V(甲苯)∶V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)∶V(异丙醇)∶V(水)=6∶3∶2∶1.5∶0.3;展开剂II:V(三氯甲烷)∶V(甲醇)∶V(水)=30∶15∶4;展开剂III:V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)∶V(三氯甲烷)∶V(氨水)∶V(三乙胺)=6∶2∶2∶1∶1;供试品溶液:1.黄柏1;2.酒黄柏1;3.酒黄柏7;4.酒黄柏13;5.黄柏对照药材;6.小檗碱对照品

2.1.3 薄层色谱鉴别提取方法考察

考察了回流和超声两种方法。超声和回流提取效果无明显差异,而且采用超声提取法黄柏药材中的标志性物质小檗碱(C20H18NO4)的提取率更高,所以后续试验优选超声提取法进行样品溶液的制备。

2.1.4 薄层色谱鉴别展距考察

实验考察了不同展距对展开效果的影响。结果显示展距为7 cm时效果较好,拖尾现象少,随着层析时间的延长,展距的加大,耗时、费板且溶剂前沿和荧光点容易产生漂移,对薄层板的加工要求和硅胶颗粒均匀度要求变高。

2.1.5 薄层色谱鉴别点样量考察

点样量1～2 μL时,荧光点集中,边界清晰,拖尾少,能够达到薄层色谱鉴别的要求。

2.2 薄层色谱鉴别专属性考察

本方法的专属性进行考察见图3。

供试品溶液:1.黄柏1;2.酒黄柏1;3.黄柏对照药材;4. 盐酸黄柏碱对照品;5.盐酸小檗碱对照品;点样量:3 μL

盐酸小檗碱有荧光斑点,黄柏对照药材、黄柏、酒黄柏饮片在与盐酸小檗碱对照品相同的位置有相同的荧光斑点,盐酸黄柏碱无荧光斑点,且无其他干扰斑点。表明该方法专属性良好。

2.3 薄层色谱鉴别耐用性考察

对不同厂家生产的高效薄层板和普通薄层板进行考察发现,样品在普通板和高效板上均可获得很好的分离,荧光点集中,且边界清晰,而高效板的效果更优,更利于后续的薄层扫描定量。在温度对薄层鉴别影响的考察中发现4和21 ℃条件下,小檗碱荧光点大小稳定,相对集中,边界清晰且展距相当,在40 ℃条件下,展距有所增长,但影响较小,荧光点有较明显变化,荧光点面积约为4 ℃时的两倍,但边界清晰,对黄柏和酒黄柏的薄层色谱鉴别未产生影响。

2.4 样品的薄层色谱检测

2.4.1 用《中国药典》方法鉴别十五批黄柏饮片

按2020年版《中国药典》薄层色谱方法进行十五批黄柏饮片薄层鉴别,经过多次试验才得到较清晰的图谱,见图4。供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。但斑点有明显的漂移,显色不清晰,较分散。

提取溶剂:1%醋酸-甲醇溶液;提取方法:超声处理;硅胶G板:烟台市江友硅胶开发有限公司;展开剂:V(三氯甲烷)∶V(甲醇)∶V(水)=30∶15∶4;展距:10 cm;供试品溶液:1～15:黄柏1～15;16.黄柏对照药材;17.黄柏碱对照品;18.小檗碱对照品;点样量:3 μL;检视:稀碘化铋钾喷涂显色

2.4.2 薄层鉴别十五批黄柏饮片

按本文方法层析、晾干、检视,结果见图5,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的亮黄色荧光斑点,斑点集中、均匀,边界清晰,溶剂前沿和荧光点无明显漂移。

供试品溶液:1～15.黄柏1～15;16.黄柏对照药材;17. 小檗碱对照品;18.黄柏碱对照品

2.4.3 薄层鉴别十五批酒黄柏饮片

同法试验、检视,图6显示在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的亮黄色荧光斑点,斑点集中、均匀,边界清晰,溶剂前沿和荧光点无明显漂移。

供试品溶液:1～15:酒黄柏1～15;16. 小檗碱对照品;17. 黄柏对照药材;18.黄柏碱对照品

2.4.4 薄层鉴别黄柏与关黄柏

同法对关黄柏和黄柏进行试验、检视。结果如图7所示,关黄柏薄层色谱图为上下两个亮黄色荧光点,上面的亮黄色荧光点为小檗碱,下面的亮黄色荧光点极有可能为巴马丁,有待后续研究,本薄层色谱鉴别方法可以快速鉴别黄柏与关黄柏。

供试品溶液:1.黄柏1;2.黄柏对照药材;3～5.关黄柏1～3;6.小檗碱对照品

3 结论与讨论

针对《中国药典》(2020版)收载的黄柏药材鉴别方法,本方法进行了如下改进:1)样品粉末取样量由0.2 g减少至0.1 g,本方法精度增加;2)提取溶剂由1%醋酸-甲醇溶液变更为甲醇,用量由40 mL减少为5 mL,溶剂用量大幅减少,且省去溶剂配置环节;3)《中国药典》(2020版)收载黄柏药材鉴别方法以三氯甲烷-甲醇-水(V三氯甲烷∶V甲醇∶V水=30∶15∶4)的下层溶液为展开剂,置氨蒸汽饱和的展开缸内,展开,步骤复杂而且斑点极易漂移,造成检视判断困难。改进后本方法展开剂为乙酸乙酯-甲醇-三氯甲烷-氨水-三乙胺(V乙酸乙酯∶V甲醇∶V三氯甲烷∶V氨水∶V三乙胺=6∶2∶2∶1∶1),不需要分层展开剂,展开剂现用现配,斑点集中、边界清晰、稳定无漂移;4)《中国药典》(2020版)收载方法操作时需要将薄层板置氨蒸汽中饱和的展开剂中展开,展开结束后需喷以稀碘化铋钾试液显色后检视,操作复杂,本方法置展开剂中展开结束后,直接在365 nm下检视,方便直观;5)本方法还可作为黄柏与关黄柏的快速薄层色谱鉴别之用,斑点分离清晰稳定。