基于CRISPR/Cas9技术的HCT-8细胞基因编辑系统构建

李娜,王悦欣,李孝法,王璐阳,梁冠达,李俊强,张龙现,李晓迎

(1.河南农业大学动物医学院农业农村部禽类产品质量安全控制重点实验室,河南 郑州 450046; 2.河南三高农牧股份有限公司,河南 固始 465200)

成簇的有规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)是一类重复的DNA序列,与CRISPR相关蛋白(Cas蛋白)组成了CRISPR/Cas系统,对外来入侵的核苷酸(如噬菌体和质粒DNA)产生免疫力[1]。根据所含Cas蛋白种类与降解外源核酸的机制不同,CRISPR/Cas系统被分为三大类型,即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas系统的免疫机制相当复杂,在基因组工程中没有得到应用,而Ⅱ型CRISPR/Cas系统只需要1个Cas蛋白(Cas9蛋白)即可实现对靶标基因的编辑[2]。CRISPR/Cas9系统的靶向切割需要3个组分,包括Cas9蛋白、CRISPR RNA (crRNA)和转活化crRNA(trans-activating crRNA,tracrRNA)[3]。在适应阶段,携带1个或多个CRISPR基因座的细菌和古生菌通过将外来序列(protspacers)的短片段整合到CRISPR阵列近端的宿主染色体中来应对病毒的攻击[4-5]。在表达和干扰阶段,重复间隔元件转录成前体CRISPR RNA(precursor crRNA,pre-crRNA)分子,然后酶切产生短的crRNA,与入侵病毒的互补原始间隔序列配对,Cas9蛋白与crRNA形成复合体来指导外源序列的沉默[6-11]。在Cas9蛋白结合到靶点并对靶点切割后,断裂的双键通过同源重组修复(homology directed repair,HDR)或非同源末端(non-homologous end joining,NHEJ)来进行修复[12]。

CRISPR/Cas9系统已经广泛应用于动物模型及体外细胞系的基因敲除或敲入[13-16],进行基因编辑的第一步是要将目的基因的小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)导入到表达Cas9蛋白的细胞系中。但是,Cas9蛋白是大分子,将其导入细胞是应用该系统的一大难题。研究表明,Cas9蛋白及其相关向导RNA(guide RNA,gRNA)RNA的质粒可以被整合到病毒载体中,研究人员利用这一特点开发设计了慢病毒载体系统;慢病毒载体可以将目的基因高效地整合到宿主基因组中,也是将Cas9蛋白导入到目的细胞系中最常用的方式[17]。人回盲肠癌(human ileocecal adenocarcinoma,HCT-8)细胞系是单层贴壁细胞,广泛应用于类器官培养、癌症研究和药物毒性研究[18-21],目前常用于隐孢子虫体外培养等[22-23]。本研究利用慢病毒感染的方式,构建稳定表达Cas9蛋白的HCT-8细胞系,为后续靶标基因的编辑奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

HEK293T细胞系、HCT-8细胞系均由河南农业大学农业农村部禽类产品质量安全控制重点实验室保存并提供。LentiCas9-Blast质粒、pXPR_011质粒购自Addgene公司;慢病毒pMD2.G、pSPAX2质粒由河南农业大学兽医生物技术学实验室馈赠;大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京庄盟生物有限公司;鼠源Cas9单克隆抗体购自Cell Signaling Technology公司;HRP标记山羊抗鼠二抗购自武汉三鹰生物技术有限公司;嘌呤霉素、杀稻瘟菌素、多聚赖氨酸、聚凝胺均购自北京索莱宝科技有限公司;转染试剂Lipofectamine 2000购自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 试验方法

1.2.1 LentiCas9-Blast慢病毒的包装 HEK293T细胞接种至10 cm细胞培养皿中,接种前用0.025 g·L-1的多聚赖氨酸包被,37 ℃放置1 h,待细胞密度达70%～80%时进行转染。从培养箱中取出细胞培养皿至超净台内,将旧的培养基弃去,用PBS溶液洗涤3次,再更换为Opti-MEM培养基,采用Lipofectamine 2000进行转染。LentiCas9-Blast、pSPAX2和pMD2.G这3种质粒按照质粒质量比为4∶3∶1进行转染,总质粒与感染试剂质量比为1∶3,混匀后,室温(25 ℃)静置5 min。将已静置完的混合液逐滴缓慢加入Opti-MEM培养基中,继续培养6 h后吸去Opti-MEM培养基,加入8 mL RPMI 1640培养基(含体积分数10%胎牛血清)继续培养。培养到48 h后收集上清液,保存于4 ℃,同时加入8 mL正常培养基;培养到72 h再次收集上清液,并与48 h收集的上清液混在一起,2 000 r·min-1离心10 min,将上清液用0.45 μm的滤膜过滤,分装到1.5 mL无菌EP管中于-80 ℃保存,用于后续慢病毒转导试验。

1.2.2 目的细胞系的获取 待HCT-8细胞传至第5～6代,将培养瓶中的细胞均匀铺至6孔板中继续培养。待细胞密度达到60%～70%时,弃去旧培养基,用PBS漂洗3次,加入1.5 mL慢病毒液和1 mL含10 mg·L-1聚凝胺的RPMI 1640培养基(含体积分数10%胎牛血清)培养细胞,留1孔作空白对照。于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱培养24 h后更换培养基,继续培养48 h后更换含15 mg·L-1杀稻瘟菌素的RPMI 1640培养基(含体积分数10%胎牛血清)继续培养细胞,直至阴性对照组细胞全部死亡,采用有限稀释法对阳性细胞进行单克隆筛选并扩大培养。

1.2.3 HCT-8-Cas9单克隆细胞系的鉴定 将挑选出的HCT-8-Cas9单克隆细胞提取全基因组,根据目的基因序列(Gene ID: 61270322)设计引物对目标基因进行扩增,引物序列见表1。扩增体系如下:2×TSINGKE® Master Mix 12.5 μL,Cas9-F/R(10 μm)各1 μL,基因组DNA 2 μL,补水至25 μL;扩增条件:94 ℃预变性2 min,94 ℃变性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸l min,反应35个循环,72 ℃继续延伸7 min。在质量分数1%琼脂糖凝胶上电泳分离。另取部分细胞进行Western Blot试验,用RIPA裂解液将细胞裂解,取裂解液进行质量分数10%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析,而后转印至0.45 μm的聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride,PVDF)膜上,恒流400 mA,常温转膜30 min;将PVDF膜置于5%脱脂牛奶封闭2 h,以鼠源Cas9 MAb(1∶1 000)为一抗,4 ℃过夜孵育后用PBST洗涤3遍,以羊抗鼠IgG-HRP(1∶10 000)为二抗,室温孵育2 h,PBST洗涤3遍后在PVDF膜上滴加显色液,置于化学发光成像系统(GE AI 680)中拍照观察和图像采集,检测HCT-8细胞系中Cas9蛋白的表达情况。

表1 PCR扩增所用引物序列

1.2.4 pXPR_011慢病毒的制备及慢病毒液滴度测定 慢病毒载体pXPR_011可用于检测Cas9蛋白的活性,该质粒同时含有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)序列及针对GFP基因的gRNA序列。细胞内Cas9蛋白会在gRNA的引导下对GFP基因进行切割,因此细胞表达的GFP越少,说明Cas9蛋白的基因编辑效率越高,并可用流式细胞仪准确地对GFP阳性和阴性细胞的比例进行定量。按照1.2.1的步骤获得慢病毒质粒pXPR_011高滴度的重组慢病毒液。将HCT-8细胞系按1×104个·孔-1接种于96孔板,并将获得的慢病毒液按比例稀释进行感染(1.56、3.12、6.25、12.5、25、50、100 μL),48 h后,以未感染慢病毒液的HCT-8细胞为阴性对照,用CytoFLEX流式细胞仪分析HCT-8细胞中表达GFP的细胞比例。病毒滴度/(TU·mL-1)=(初始感染细胞数×GFP阳性细胞比例)/(病毒体积)×1 000[24-25]。

1.2.5 HCT-8-Cas9单克隆细胞系基因编辑效率检测 将HCT-8和HCT-8-Cas9单克隆细胞系按1×105个·孔-1接种于6孔板,并用pXPR_011慢病毒液以MOI=0.8分别进行感染,以确保每个细胞都被1个pXPR_011慢病毒颗粒感染,48 h后更换含2 mg·L-1嘌呤霉素的RPMI 1640培养基,之后2 d更换1次含2 mg·L-1嘌呤霉素RPMI 1640培养基,同时观察GFP的表达情况。未处理的HCT-8细胞系作为阴性对照,感染慢病毒液的HCT-8细胞系作为阳性对照,筛选7 d后,用CytoFLEX流式细胞仪对上述试验组进行分析,用SPSS 24.0对基因编辑效率进行计算及统计学分析,以平均数±标准差表示。

1.2.6 HCT-8-Cas9单克隆细胞系细胞活性验证 将Cas9蛋白表达量较高的HCT-8-Cas9_2、HCT-8-Cas9_4单克隆细胞系以及HCT-8细胞系分别以1×104个·孔-1接种于96孔板,每组设置6个重复,培养24 h后更换为10 μL CCK-8试剂和90 μL含体积分数10% 胎牛血清RPMI 1640培养基的混合液,继续培养2 h后用酶标仪检测吸光度在450 nm时的数值,并用Graph Pad Prism 9进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 HCT-8-Cas9单克隆细胞系的筛选

将HCT-8-Cas9细胞接种到96孔板中,采用有限稀释法使每孔接种1个细胞,培养7 d,在显微镜下观察每孔中细胞生长情况,共筛选出8株单克隆细胞系,从中选取能成功表达Cas9蛋白的6株进行扩大培养,分别命名为HCT-8-Cas9_1、HCT-8-Cas9_2、HCT-8-Cas9_3、HCT-8-Cas9_4、HCT-8-Cas9_5、HCT-8-Cas9_6。

2.2 PCR试验检测Cas9基因的整合情况

收集筛选的6株单克隆细胞系,分别取少量细胞提取基因组,用Cas9-F、Cas9-R引物进行PCR扩增以检测目的基因的整合情况。如图1所示,扩增基因大小为738 bp,6株单克隆细胞系均可以扩增出与预期大小相符的基因片段,表明Cas9基因已成功整合到HCT-8细胞基因组上。

M:Marker;1:HCT-8-Cas9_1;2:HCT-8-Cas9_2;3:HCT-8-Cas9_3;4:HCT-8-Cas9_4;5:HCT-8-Cas9_5;6:HCT-8-Cas9_6;7:对照;8:HCT-8细胞;9:H2O。

2.3 Western Blot试验检测Cas9蛋白表达情况

用RIPA裂解缓冲液提取HCT-8-Cas9单克隆细胞总蛋白,并以HCT-8细胞裂解液为对照。Western Blot结果显示,HCT-8-Cas9_2和HCT-8-Cas9_4细胞系的Cas9蛋白表达水平较高(图2),表明这2个细胞系比较适合后续HCT-8细胞系Cas9蛋白基因编辑效率的检测。

1:HCT-8-Cas9_1;2:HCT-8-Cas9_2;3:HCT-8-Cas9_3;4:HCT-8-Cas9_4;5:HCT-8-Cas9_5;6:HCT-8-Cas9_6.

2.4 pXPR_011慢病毒滴度的测定结果

将稀释的pXPR_011慢病毒液分别感染1×104个HCT-8细胞系,48 h后,以未感染慢病毒液的HCT-8细胞为对照,分析HCT-8细胞中表达绿色荧光蛋白细胞比例。如图3所示,用25 μL慢病毒液进行感染时,表达绿色荧光蛋白的细胞比例20.1%。在此基础上计算该慢病毒液滴度为4.02×105TU·mL-1,用于后续感染复数(multiplicity of infection,MOI)的计算。

图3 pXPR_011慢病毒液滴度测定流式细胞仪分析结果

2.5 HCT-8-Cas9单克隆细胞系基因编辑效率检测结果

将获得的pXPR_011重组慢病毒液以MOI=0.8的剂量分别感染HCT-8和HCT-8-Cas9细胞系,7 d后,利用流式细胞仪CytoFLEX对样本进行分析。如表2所示,HCT-8-Cas9_4细胞系表达的GFP较少,加入25 μL慢病毒液时,表达绿色荧光蛋白的细胞占20.1%,Cas9基因编辑效率为48.82%,显著高于其他5株HCT-8-Cas9细胞系(p<0.05),这表明HCT-8-Cas9_4单克隆细胞系在后续的敲除中可以发挥更为高效作用。

表2 HCT-8-Cas9单克隆细胞系基因编辑效率结果

2.6 稳定表达Cas9蛋白的HCT-8细胞系的细胞活性

采用CCK-8试剂检测HCT-8-Cas9_2、HCT-8-Cas9_4细胞系的活性。如图4所示,HCT-8-Cas9_2及HCT-8-Cas9_4的细胞活性与HCT-8细胞相比均无显著差异(p>0.05),表明稳定表达Cas9蛋白对HCT-8细胞的活性无显著影响,且能在HCT-8细胞中稳定表达。

ns表示无显著差异(p>0.05)。

3 结论与讨论

基因编辑技术能够对基因组DNA进行精准修饰,近年来得到迅猛发展。目前,只有3种技术可用于靶向基因编辑,即锌指核酸酶 (zinc-finger nucleases,ZFN)、转录激活样效应因子核酸酶 (transcription activator-like effector nucleases,TALEN)及CRISPR/Cas9技术[26-27]。相较于其他2种基因编辑技术,CRISPR/Cas9技术只需要设计和目标核酸对应的RNA序列,便可对哺乳动物等细胞基因组进行精准修饰,具有高效、简便且便宜等特点,因此被广泛应用于筛选和鉴定功能基因[28]。在CRISPR/Cas9技术出现之前,RNA干扰(RNAi)技术被应用于功能基因的筛查[29-31]。但该技术不能完全抑制基因表达而导致假阳性[32-33],影响对基因功能的正确判断。CRISPR/Cas9技术能够在基因组中进行编辑,既能避免RNA干扰技术抑制不彻底的情况,也能在不同物种和不同细胞中进行,具有其他技术手段不可比拟的优势[34]。SHALEM等[35]首次在人体细胞内成功用CRISPR/Cas9系统完成了基因编辑。该发现给CRISPR/Cas系统带来了巨大变革。

HCT-8细胞应用广泛且易于培养,是类器官培养、高通量筛选、药物毒性研究和寄生虫培养等重要载体。本研究建立HCT-8细胞系的CRISPR/Cas9基因编辑系统,对于保证后续靶标基因的高效敲除,以及筛选具有高切割效率的HCT-8-Cas9单克隆细胞系至关重要。为了保证单克隆细胞系来源于同一细胞克隆,采用有限稀释法分选,共筛选出8株HCT-8-Cas9单克隆细胞系,但有2株没有检测到Cas9蛋白的表达,因此从中选取6株能稳定表达Cas9蛋白的细胞系进行扩大培养。为了验证所挑选细胞系的基因编辑效率,以MOI=0.8的pXPR_011慢病毒液感染单克隆细胞系,并通过流式细胞仪进行检测,结果表明HCT-8-Cas9_4的基因编辑效率在第7 d达到48.82%,与张纪文等[36]和覃鸿妮等[37]所构建的CRISPR/Cas9基因编辑细胞系相比效率偏低,可能与基因插入位点及细胞系类型有关。下一步可通过对单克隆细胞系二次单克隆化进一步提高其编辑效率。对HCT-8-Cas9单克隆细胞系活性进行检测,结果显示HCT-8-Cas9_2和HCT-8-Cas9_4与HCT-8细胞活性均无显著差别。这表明,HCT-8-Cas9_4为本试验获取的最优单克隆细胞系,能稳定表达Cas9蛋白,并具有良好的基因编辑效率,为后续靶标基因的编辑奠定基础。