家蚕Gloverin 2 克隆、高效表达及其抗核型多角体病毒感染作用研究

唐芬芬，杨伟克，张祖芸，李 娜，刘 娜，谢 昆

（1.红河学院生物科学与农学学院，云南 蒙自 661100；2.云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661100）

家蚕（Bombyx mori）是我国主要的经济昆虫，在农业生产中具有重要地位。由家蚕核型多角体病毒（BmNPV）引发的血液型脓病严重时甚至造成蚕茧颗粒无收[1-2]。对于BmNPV 的防控主要是在饲养环境进行消毒，无有效防控药物，家蚕抗BmNPV 免疫机制也未完全解析[3-7]。BmNPV 严重制约蚕业发展。抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs）作为一类重要的免疫效应因子，在昆虫抵御微生物的侵染中发挥着重要的作用，其抗菌活性及机制已被报道，具有相对分子量小、受热稳定、水溶性强、抗菌谱广等特点[8]。前人研究表明，抗菌肽具有抗病毒活性[9]，关于抗菌肽抗病毒的机制可分为4 种：通过免疫系统调节、抑制病毒基因表达和蛋白质合成、抑制病毒组装及直接裂解病毒囊膜[10]。如蜂毒肽能抑制小鼠逆转录病毒、烟草花叶病毒和单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus，HSV）的复制[11-12]，这表明蜂毒肽具有抗病毒活性，其抗病毒机制类似于抗菌机制，是通过与病毒囊膜直接作用使其裂解从而抑制病毒增殖的。从爪蟾中分离出来的Magainin 家族蛋白能有效抑制动物体内HSV 病毒；在体外试验中，直接将抗菌肽与HSV 孵育，它们表现出更强的抑制效果。在昆虫抗病毒免疫反应中，抗菌肽也是潜在的抗病毒因子[13-14]。

在家蚕基因组中注释了七大抗菌肽的基因家族，Cecropin、Moricin、Attacin、Enbocin、Gloverin、Defensin 和Lebocin，编码抗菌肽的基因均以基因家族的形式存在[15-16]。家蚕抗菌肽的抗菌活性及机制已被报道[17]，而关于家蚕抗菌肽的抗病毒特性及机制研究较少。Gloverin 是鳞翅目昆虫特有的抗菌肽之一，富含甘氨酸，不含半胱氨酸，抗革兰氏阴性菌、真菌和病毒。在家蚕中Gloverin 有4 个基因成员（Gloverin 1-4），YI 等[18]对其结构与活性进行了深入研究。KAWAOKA 等[19]研究表明，通过向家蚕注射大肠杆菌（Escherichia coli），能引起Gloverin 在中肠强烈免疫应答。研究还发现，家蚕Cecropin、Moricin、Gloverin 基因家族成员中显示主基因成员对微生物诱导的表达活性和抗菌活性最强的特征，其中Gloverin 2为Gloverin 家族主基因[20]。随后，WANG 等[21]对Gloverin 2的抗菌机制进行研究发现，在家蚕丝腺中过表达Glovrin 2 能提高家蚕抗菌能力和蚕丝性能[22]。而关于Gloverin 抗病毒研究的报道较少[23]，Gloverin抗BmNPV效果及机制未见报道。为此，探究抗菌肽抗BmNPV 的作用及机制，旨在为研究家蚕抗病育种提供参考，同时可为昆虫抗菌肽的有效利用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试家蚕品种为箐松×皓月，BmNPV 为T3 株，均由红河学院昆虫生理生化与资源开发研究室提供。家蚕饲养至3龄，挑选发育一致的幼虫进行试验。

质粒小量提取试剂盒、DNA 胶回收试剂盒为Axygen 公司产品；BCA 蛋白质定量试剂盒、RNAiso Plus、pMD-19T 载体均购自宝生物工程（大连）有限公司；T4 DNA 连接酶、限制性核酸内切酶、DNA Marker、RT-PCR 试剂盒、大肠杆菌DH5α 和BL21（DE3）感受态细胞、蛋白质Marker、Ni-IDA 亲和层析柱等均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 BmGloverin 2基因的克隆与重组表达载体的构建和检测

根据家蚕GenBank 公布的BmGloverin 2的mRNA 序列（AB190864.1），利用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物，含NdeⅠ和XhoⅠ位点，序列为F：5′-CATATGGAAGTTTACGGACCTTCTGAT-3′，R：5′-CTCGAGCTCTAGG CGGTACTAACC-3′（下划线分别为NdeⅠ和XhoⅠ限制性内切酶位点）。用Trizol 试剂提取经BmNPV 诱导的3 龄3 日家蚕中肠总RNA，反转录为cDNA，并以此为模板扩增除信号肽部分（1—18 aa）的BmGloverin 2目的片段，将PCR目的产物连接到pMD-19T 载体，转化到大肠杆菌DH5α后，阳性克隆经PCR 鉴定并测序。然后，将正确的重组质粒pMD-19T-BmGloverin 2和pET28a（+）载体经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，构建重组表达质粒。

1.3 BmGlvoverin 2蛋白的表达与纯化

将pET28a（+）-BmGloverin 2转化至表达菌株大肠杆菌BL21（DE3）细胞，经检测的阳性菌落在37 ℃下接种于含氨苄青霉素（100 µg∕mL）的LB 培养基中，培养至OD600=0.6～0.8，然后用0.5 mmol∕L IPTG在37 ℃下诱导蛋白质表达6 h，通过在4 ℃下6 000×g离心20 min 收集菌体并重新悬浮于PBS（pH 值7.4），超声破碎，收集上清液和沉淀并用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。以优化后的条件扩大培养，按上述相同条件超声破碎并收集上清用于纯化目的蛋白。抗菌肽BmGlvoverin 2 重组蛋白的纯化按Ni-IDA 说明书进行，对纯化后的目的蛋白进行SDS-PAGE 鉴定，大量纯化样品进行透析，用PEG20000浓缩，经0.45µm滤膜过滤后，BCA蛋白质定量试剂盒测定重组蛋白浓度，于-80 ℃储存备用。

1.4 BmGlvoverin 2抑菌活性检测

为检测BmGloverin 2 重组蛋白是否具有活性，对革兰氏阴性菌大肠杆菌DH5α的抗菌活性进行检测。采用琼脂板孔穴扩散法。挑取供测菌单菌落，转接于5 mL LB 液体培养基中，250 r∕min、30 ℃培养至OD 值为0.5～0.6。取20µL 的菌液注入到无菌的9 cm 培养皿中，加入经熔化后冷却到50～60 ℃的LB固体培养基，振荡混匀，冷却。用直径2.7 mm 的打孔器打孔，每孔注入25 µL 质量浓度为100 µg∕mL的经纯化的重组蛋白溶液，以无菌水和2.5 µL 10 mg∕mL 硫酸卡那霉素分别作为阴性和阳性对照，待蛋白质溶液完全吸收后，倒置培养，37 ℃培养12 h，每组3个重复，观察并测量抑菌圈直径。

1.5 BmGloverin 2 对BmNPV 感染家蚕的影响试验

参照李伟灿等[24]的方法，略有改动。取500µL质量浓度为50 µg∕mL 的重组蛋白溶液，与纯化的500 µL BmNPV（4×105PIB∕mL）混合，室温放置4 h后，均匀涂于切好的三角桑叶单叶面上，室温晾干后，投喂已停止喂食12 h 的3 龄家蚕。同时，取1 mL 浓度为2×105PIB∕mL BmNPV 病毒液和无菌水，以相同方法饲喂家蚕，作为对照。以上处理每组30 头家蚕，各设3 个重复。处理后，在室温下正常饲养，每天投喂3 次桑叶，观察记录家蚕死亡情况，并对死亡家蚕进行镜检确认是否病毒感染导致。

1.6 数据处理

数据用Excel 进行分析并绘图，利用软件SPSS 20.0 进行独立样本T检验，分别比较BmGlolverin 2蛋白和BmNPV 混合液处理组与BmNPV 对照组感染家蚕后不同时间点家蚕存活率的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 BmGloverin 2基因的扩增结果

以经BmNPV 诱导的3 龄3 日家蚕中肠cDNA 为模板，通过PCR 技术扩增出去除信号肽部分（1—18 aa）的BmGloverin 2目的片段，取8 µL PCR 产物进行1.5%琼脂糖电泳，结果显示，扩增得到单一的条带，大小约为465 bp（图1），与目的基因大小相符。将PCR 目的产物克隆到pMD-19T 载体，并经测序表明序列一致。

图1 家蚕抗菌肽BmGloverin 2基因的RT-PCR扩增结果Fig.1 The RT-PCR amplification of antibacterial peptide gene BmGloverin 2 from B.mori

2.2 重组表达载体pET28a（+）-BmGloverin 2的鉴定

将BmGloverin2基因片段（不含信号肽序列）插入表达载体pET28a（+），选择酶切位点NdeⅠ、XhoⅠ构建重组表达载体pET28a（+）-BmGloverin 2，经酶切鉴定（图2），呈现2 条带，大小分别为5 900、465 bp，符合预测，表明目的基因片段插入表达载体中。

图2 重组质粒pET28a（+）-BmGloverin 2酶切鉴定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pET28a（+）-BmGloverin 2 by enzyme digestion

2.3 BmGloverin 2重组蛋白的表达与纯化

目的蛋白融合载体含His 标签，即构建的表达载体表达6×His-BmGloverin 2，后续利用His标签进行蛋白质检测和纯化。经过多次优化条件后，利用SDS-PAGE 检测融合蛋白，发现0.5 mmol∕L IPTG 在37 ℃诱导6 h，目的蛋白在上清和沉淀中均高效表达，大小约19.1 ku，与预期目标大小相符（图3）。BmGloverin 2 可溶性重组蛋白经亲和层析纯化，仅检出1 条明显的约19.1 ku 蛋白质条带（图4），表明目的蛋白纯化结果良好。

图3 SDS-PAGE分析BmGloverin 2重组蛋白表达Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant BmGloverin 2

图4 SDS-PAGE分析纯化的BmGloverin 2重组蛋白Fig.4 SDS-PAGE analysis of purified recombinant BmGloverin 2

2.4 BmGloverin 2重组蛋白生物活性检测

用纯化的25 µL 质量浓度为100 µg∕mL BmGloverin 2 重组蛋白进行抑菌试验，分别以无菌水和硫酸卡那霉素溶液为阴性对照和阳性对照。37 ℃培养12 h后观察抑菌圈的形成，并测量抑菌圈直径。结果表明，BmGloverin 2 重组蛋白对大肠杆菌DH5α 具有抑制作用（图5a），抑菌直径达6 mm（图5b）。说明表达纯化的BmGloverin 2重组蛋白具有生物活性，可用于后续试验。

图5 BmGloverin 2重组蛋白对大肠杆菌DH5α的抑菌效果Fig.5 Bacteriostatic effect of recombinant BmGloverin 2 protein on E.coli DH5α

2.5 BmGloverin 2重组蛋白对BmNPV感染家蚕的影响

对家蚕3 龄幼虫喂食重组蛋白和BmNPV 混合液处理组与喂食BmNPV 对照组进行累计存活率比较。结果显示（图6），家蚕喂食BmNPV 后24 h 开始死亡，72～96 h 是家蚕死亡的高峰期。在96 h 后，喂食重组蛋白和BmNPV 混合液的处理组累计存活率与喂食BmNPV 对照组的存活率相比差异显著（P＜0.05）。而在168 h，喂食重组蛋白和BmNPV 混合液的处理组累计存活率与直接喂食BmNPV 的对照组相比高7.78个百分点，但差异不显著（P＞0.05）。以上结果表明，喂食混合液中添加的BmGloverin 2重组蛋白在病毒感染初期有明显降低病毒感染的作用。

图6 喂食BmNPV和重组蛋白混合液对家蚕3龄幼虫存活率的影响Fig.6 Effects of feeding BmNPV and recombinant protein mixture on the survival rate of the 3 rd instar larvae of Bombyx mori

3 结论与讨论

Gloverin 是一种富含甘氨酸的抗菌肽，主要存在于鳞翅目昆虫，具有抗细菌、真菌和病毒的活性。BmGloverin 2属于Gloverin 家族，不仅具有抗革兰氏阳性、阴性菌和真菌活性，且对苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa californicamultiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV）具有抗病毒活性[25]。本研究中，为了获得具有生物活性的BmGloverin 2，并研究其可能的抗病毒相关功能，选择pET28a（+）载体作为BmGloverin 2基因的表达载体，将目的基因插入pET28（+）载体上的NdeⅠ酶和XhoⅠ酶之间的多克隆位点，使BmGloverin 2 蛋白带有1 个His-tag，便于利用His-tag 进行亲和层析分离纯化。最终，通过分离纯化获得重组蛋白BmGloverin 2，并通过抑菌活性检测表明其具有生物活性。

Gloverin 在其他昆虫的抗病毒免疫中发挥重要作用，如Gloverin 可通过破坏AcMNPV 的囊膜，使其内容物释放，从而抑制病毒增殖[25]；在亚洲舞毒蛾（Lymantria dispar）中沉默Gloverin基因，LdMNPV 在感染后48 h和72 h的DNA 复制水平显著升高，表明LdGloverin 可以抑制LdMNPV 的DNA 复制[26]。结合前期qRT-PCR 检测BmNPV 诱导BmGloverin 2 上调表达的结果[27]，提示BmGloverin 2 可能在家蚕防御BmNPV感染中发挥重要作用。于是，在虫体水平检测BmGloverin 2 对BmNPV 侵染家蚕的影响。结果显示，在BmNPV 和BmGloverin 2混合处理后喂食家蚕3龄幼虫可以降低BmNPV 对幼虫的感染率，且在96 h 显著提高存活率。这说明BmGloverin 2 在家蚕抵抗BmNPV中很可能发挥着重要作用。

前人研究表明，抗菌肽之间通过协同作用消除外来微生物的感染[28]。本研究中，只探讨了单一BmGloverin 2 对BmNPV 感染幼虫的影响，有一定的局限性。是否BmGloverin 2会与其他抗菌肽协同作用防御BmNPV 有待进一步研究。本研究为制定家蚕抗病毒策略提供了新的方向，为更好地利用抗菌肽奠定基础。