小麦对Bipolaris sorokiniana 黑胚病与苗期叶枯病抗性的相关性

李海泳，李梦钰，高 闯，许 豪，殷贵鸿，董纯豪，牛吉山，李巧云

（1.河南农业大学马克思主义学院，河南 郑州 450046；2.河南农业大学国家小麦工程技术研究中心，河南 郑州450046；3.河南农业大学农学院，河南 郑州 450046）

病害严重影响小麦的产量与品质[1]，黑胚病是危害小麦籽粒的病害，其典型症状是籽粒胚部有黑∕褐色斑点，严重时病斑扩展至整个籽粒并引起籽粒皱缩[2]。小麦黑胚病除影响籽粒外观、引起小麦收购级别下降而减少麦农收入外[3]，还降低种子的发芽率、抑制小麦幼苗生长[4-5]，此外，感病籽粒中残留的真菌毒素[6-7]，也严重影响国家粮食安全与人民健康。近年来，黑胚病在世界范围内频繁发生，成为影响小麦安全生产的重要病害之一[1-2，8-9]。

推广抗病品种是应对黑胚病危害最经济有效的措施，然而小麦黑胚病抗性是数量性状[2，8-10]，症状的形成与发展受致病菌与环境的双重影响[11-12]，同一小麦品系的调查结果在不同的年度及地点间往往不稳定[8-9]。以自然条件下的黑胚率为依据筛选的抗病品系不一定真正抗病，也可能是致病菌菌源不充分或气象因子不适合导致的结果[13-14]，前人研究也表明了这一点，如LI 等[15]对自然条件下筛选的155 份抗病小麦品系[4]接种6 种不同的致病菌进行鉴定，只有3.6%、50.9%、60.0%、1.8%、47.3%、58.8%的品系分别抗麦根腐平脐蠕孢（Bipolaris sorokiniana）、链格孢（Alternaria alternata）、木贼镰刀菌（Fusarium equiseti）、嘴突凸脐蠕孢（Exserohilum rostratum）、附球菌（Epicoccum sorghinum）与Curvularia spicifera引起的黑胚病，而同期自然大田条件下，80.5%以上小麦品系表现抗病。王丝雨等[14]研究也表明，在山农4143 和宛原白1 号杂交构建的327 个重组自交系群体中，自然大田条件下75.1%的自交系表现抗病，而接种B.sorokiniana条件下，只有25.4%的自交系表现抗病。可见，只有在接菌鉴定条件下才能筛选真正抗黑胚病的种质。受发病时期的限制，小麦黑胚病的接菌鉴定只能在灌浆期进行[16]，收获脱粒后才能观察病情，耗费时间长且程序烦琐，这给小麦黑胚病抗性育种带来一定的困难，再加上实用分子标记[9-10]与优异抗病种质资源缺乏的现状[4，15]，小麦黑胚病抗性育种进展缓慢。

小麦黑胚病致病菌复杂，涉及6 个属、8 个种的真菌，其中A.alternata与B.sorokiniana是小麦黑胚病的优势病原菌[5，11，17-18]。除引起黑胚病外，B.sorokiniana还是根腐病、叶枯病、颖枯病等多种小麦病害的致病菌[19-20]。相对于B.sorokiniana引起的其他病害，叶枯病的鉴定，尤其是苗期叶枯病的鉴定比较快，而且鉴定条件可控、鉴定结果也易于观察。李巧云等[21]在前期对B.sorokiniana黑胚病与叶枯病联合鉴定方法的研究中发现，B.sorokiniana引起的叶枯病与黑胚病抗性之间存在一定的负相关现象。如果能以B.sorokiniana叶枯病的病叶面积推测黑胚率，将大大缩短黑胚病抗性鉴定时间、提高鉴定的效率。因此，为进一步分析黑胚率与叶枯病病叶面积的关系，对经接菌鉴定筛选的50个黑胚病抗性不同的小麦品系[15]进行2 a的黑胚病、叶枯病接菌鉴定，分析B.sorokiniana叶枯病与黑胚病之间的相关性，旨在为小麦育种中黑胚病抗性快速鉴定方法的建立提供依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料与种植

国家小麦工程技术研究中心遗传育种课题组（本课题组）前期依据2010—2012年连续3 a自然大田条件下的小麦黑胚率，从400 余份育种亲本及高代系材料中筛选出抗黑胚病小麦品系155 个[4]，于2016—2017 年连续2 a 对筛选的抗病品系及部分感病品系接种6 种不同黑胚病致病菌进行鉴定，筛选针对不同致病菌的抗病材料[15]。本研究所用的50份小麦品系是经前期接菌鉴定的抗、感B.sorokiniana黑胚病的材料，包括山农530070、温麦10 号、郑麦366 等6 份抗病材料，温麦8 号、山农4143、GM11-269 等轻感品系18 个，11-252（LWX)、扬麦5 号、周麦19 号等中感品系18 个，11-504（LWX)、国麦222、节燕98-7等高感品系8个[15]。

在2018—2019 年与2019—2020 年2 个小麦生长季（下文分别简写为2019 与2020），将供试50 个小麦品系种植在荥阳试验田（河南省荥阳市豫龙镇后王村）。试验采用随机区组设计，每个材料1 行，3次重复。行长1 m，行距20 cm，株距5 cm，每年10月中旬种植，人工开沟点播。浇水、施肥管理以及虫害、草害防治同当地育种田。

1.2 小麦品系黑胚病抗性的接菌鉴定

致病菌为本课题组分离鉴定的小麦黑胚病优势病原菌B.sorokiniana的强致病菌株Ta-BP33[12]。致病菌的扩繁及孢子悬浮液制作参照王丝雨等[14]的方法进行，鉴定用的孢子液浓度为5×104个∕mL。

采用孢子液喷洒+套袋保湿的技术[21]，参照XU等[11]的程序进行接菌鉴定，即开花期挂牌标记生育时期一致的穗子，花后10 d 在标记的穗子上喷洒B.sorokiniana孢子液（1.5 mL∕穗）作为B.sorokiniana接种处理（Bs），对照（CK）喷洒灭菌蒸馏水，然后用透明塑料袋保湿5 d。每品系每重复接菌鉴定5穗。

待小麦成熟时收获样品，晒干、手工脱粒后统计每个样品的病粒数（病斑直径＞1 mm）与总籽粒数，计算黑胚率（X），X=病粒数∕总粒数×100%[22]。依据黑胚率进行黑胚病6 级抗性评价，分别是免疫（I）、高抗（HR）、抗（R）、轻感（SS)、中感（MS）与高感（HS），对应的黑胚率（X）分别为X=0、X＜1.9%、2.0%≤X＜4.9%、5.0%≤X＜14.9%、15.0%≤X＜30.0% 与X≥30.0%[4，14-15]。

1.3 小麦品系苗期叶枯病病叶面积测定

参照李梦钰等[23]的方法进行，于2019年与2020年11月挑选不同小麦品系的健康籽粒，在70%乙醇中浸泡2 min后用灭菌蒸馏水冲洗4次，然后放入直径9 cm 的培养皿中（提前加2 层灭菌滤纸），每皿5个品系，每个品系15 粒种子，4 次重复。将每个培养皿加4 mL 灭菌蒸馏水后放在培养箱中，25 ℃暗培养3 d，然后去培养皿盖子，每个品系留下10 株发育一致的幼苗，在25 ℃光照11 h∕20 ℃黑暗13 h 交替条件下培养至一叶一心（5 d 左右）。将制备好的B.sorokiniana孢子悬浮液（制备方法及浓度同黑胚病抗性鉴定）用喷壶均匀地喷洒在幼苗叶片上，直至叶片上有液滴落下（约5 mL∕皿），作为B.sorokiniana接种处理（Bs），对照（CK）喷洒灭菌蒸馏水，然后罩上透明塑料罩保湿。25 ℃暗培养24 h后，25 ℃光照11 h∕25 ℃黑暗13 h 交替培养，每天早、晚2次在罩子内喷水保湿，培养皿适时补水。在接菌后10 d 调查并记录病斑面积，计算病斑面积占叶面积的百分率。

1.4 数据分析

用Excel 2000 整理数据，用SPSS 20.0 单因素方差分析中的Dunnett’s 程序进行黑胚率与病叶面积占比差异比较分析（以抗黑胚病品系山农530070为对照），用双变量相关（Bivariate correlation）方法进行黑胚率与病叶面积占比之间的相关性分析。

2 结果与分析

2.1 50个小麦品系的黑胚病发病率与叶枯病病叶面积占比

2 a 间50 个小麦品系黑胚病发病率（黑胚率）与苗期叶枯病病叶面积占比见表1。从表1 可以看出，在B.sorokiniana侵染条件下，50 个品系的黑胚率为1.7%（山农530070，2019 年）～51.4%（鹤0927，2020 年），2 a 的平均黑胚率分别为15.9%与17.4%，而对照（灭菌蒸馏水处理）在2019 年与2020 年的黑胚率分别为2.7%与1.2%，均与接菌处理黑胚率差异显著（P＜0.01，图1A）。可见，B.sorokiniana侵染明显加重了小麦黑胚病的发生。

图1 接种Bipolaris sorokiniana条件下50个小麦品系的平均黑胚率（A）与病叶面积占比（B）Fig.1 Means of black point incidence and percentage of diseased leaf area among 50 wheat cultivars/lines under artificial inoculation with B.sorokiniana

表1 50个小麦品系的Bipolaris sorokiniana黑胚率与病叶面积占比Tab.1 Black point incidence and percentage of diseased leaf area caused by B.sorokiniana among 50 wheat cultivars/lines

在B.sorokiniana侵染条件下，50 个小麦品系苗期叶枯病病叶面积占比为15.1%（鹤0927，2020年）～96.5%（温麦10 号，2020 年），2 a 的平均病叶面积占比分别为52.0%与52.7%。对照条件下，50 个供试品系2 a 的平均病叶面积占比分别为3.6%与3.4%，均与接菌处理的病叶面积占比差异显著（P＜0.01，图1B）。可见，B.sorokiniana侵染加重了小麦叶枯病的发生。

2.2 供试小麦品系的黑胚病抗性评价

按照6 级分类法对50 个小麦品系进行黑胚病抗性评价（表2），无论在接菌条件还是在对照条件下，50个小麦品系中没有对黑胚病免疫的。在接菌条件下，2019 年的抗病与感病品系分别有6 个与44个，分别占供试品系的12.0%与88.0%；2020 年抗病与感病品系分别有5 个与45 个，分别占10.0%与90.0%；2 a均表现为抗病的品系只有3个，分别是山农5300709、温麦10号、11-253（LWX)。在对照条件下，94.0%以上的品系表现抗病，只有1 个品系2 a均表现为轻感黑胚病。

表2 50个小麦品系Bipolaris sorokiniana黑胚病抗性评价结果Tab.2 Resistance evaluation of 50 wheat cultivars（lines）to black point caused by B.sorokiniana

2.3 小麦黑胚率与叶枯病病叶面积占比的相关性分析

将2 a 的黑胚率分别与苗期叶枯病叶面积占比进行相关性分析（表3），在B.sorokiniana侵染条件下，2019 年与2020 年黑胚率呈显著正相关（P＜0.01），相关系数r=0.909；2 a的叶枯病病叶面积占比也呈显著正相关（P＜0.01，r=0.921），表明试验结果在不同年度间的重复性较好。

表3 小麦黑胚率与叶枯病病叶面积占比的相关性分析Tab.3 Correlation analysis between black point incidence and percentage of diseased leaf area of leaf blight in wheat

在接种B.sorokiniana条件下，不同年度的黑胚率与病叶面积占比均呈现显著的负相关关系（P＜0.01），相关系数为-0.914～-0.845，以2020 年黑胚率与病叶面积占比的相关系数最高。

2.4 小麦品系黑胚病抗性预测与接菌鉴定结果的一致性分析

进一步以相关系数最高的2020 年小麦黑胚率与叶枯病病叶面积占比进行回归分析，回归方程为y=-0.585x+48.444（y与x分别是黑胚率与叶枯病病叶面积占比，图2），以此回归方程对50 个供试小麦品系进行黑胚病抗性预测，其抗感评价结果与接种B.sorokiniana鉴定评价结果一致的品系为45 个，预测准确率为90.0%（表4）。

图2 2020年接种Bipolaris sorokiniana小麦叶枯病病叶面积占比与黑胚率的回归分析Fig.2 Regression analysis between black point incidence and percentage of diseased leaf area of leaf blight under inoculation condition with B.sorokiniana in 2020

表4 小麦品系黑胚病抗性接菌（B.sorokiniana）鉴定结果与抗性预测结果比较Tab.4 Comparison between resistance evaluation resucts under inoculation with B.sorokiniana and resistance prediction results

3 结论与讨论

小麦黑胚病抗性由多基因控制，黑胚率广义遗传力在0.50～0.78 变动[4，8，12]。真菌是小麦黑胚病的病因[11，18]，但黑胚病的流行受环境因素尤其是灌浆期温度、湿度等气象因子的影响[12，24-26]。引起黑胚病的真菌种类复杂，其中A.alternata与B.sorokiniana是小麦黑胚病的优势病原菌[11，18，22]，许多学者的研究结果表明，B.sorokiniana的致病性强于A.alternata等其他致病菌[11，18，25]，以B.sorokiniana为致病菌开展研究对黑胚病抗性改良及其防治有重要意义。

在本研究中，B.sorokiniana侵染引起了严重的黑胚病，接菌鉴定的黑胚率显著高于对照，2 a 的抗性鉴定结果重复性较好（相关系数为0.909），供试50个小麦品系的黑胚率差异显著，其抗性鉴定结果与LI 等[15]报道的抗性鉴定结果基本一致，如6 个抗病品系在本研究中2 a 均抗病的有3 个，其他3 个为1 年抗、1 年轻感（轻感时黑胚率为5.1%～5.6%，略高于5.0%的感病标准）；8 个高感品系的鉴定结果全部为高感。供试50个小麦品系88%以上表现感病。小麦品系间黑胚病抗性差异较大且抗病品种少，这与前人的研究结果一致[4，9，13，16]。

在自然大田条件下表现抗病的很多品系，在接菌鉴定时往往感病[14-15]，本课题组前期对依据自然大田条件下黑胚率筛选的155个抗病品系进行接菌鉴定，只有6 个品系抗B.sorokiniana黑胚病[15]，因此仅仅依据自然条件下的黑胚率筛选抗病品系，结果是不太可靠的，要筛选真正的抗病品系，需要进行多年多点的接菌鉴定。然而，小麦黑胚病的接菌鉴定烦琐、耗时，这在很大程度上制约着高产、抗黑胚病小麦的育种进程。建立黑胚病抗性的快速鉴定方法有助于推进黑胚病抗性改良进程。作为小麦黑胚病的优势病原菌，B.sorokiniana除引起黑胚病外，还是根腐病、叶枯病等多种小麦病害的致病菌[19-20，27]。与黑胚病的接菌鉴定相比，小麦叶枯病的鉴定尤其是苗期的室内鉴定比较简单、快速、条件可控，且不受生育时期的限制。如果可以用叶枯病的病叶面积推测黑胚病的发病率，将有助于提高黑胚病抗性育种中大量材料的筛选效率。

本研究结果表明，小麦B.sorokiniana黑胚率与苗期叶枯病的病叶面积占比存在显著的负相关关系，以相关系数最高的2020年病叶面积占比与黑胚率的数据建立回归方程，预测50个小麦品系的黑胚病抗性，与大田鉴定结果的一致性达到90.0%，为通过苗期叶枯病的病叶面积推测黑胚率提供了依据。在小麦等作物中，同一种致病菌引起多种病害的情况较为常见，如禾谷镰刀菌能引起小麦根腐病与赤霉病[28-29]，B.sorokiniana可以引起根腐、叶枯、黑胚病等[27，30]。小麦对B.sorokiniana引起的不同病害的抗病机制可能不同，目前定位到的抗B.sorokiniana叶枯病位点有90 个[30]、抗黑胚病位点有126 个[10]，根据抗病位点的物理位置，2 种病害约70%抗性相关位点都不一致，可能意味着2 种病害的抗病机制不一致，另外，因为2 种病害的发病部位、症状形成时期差异较大，即使抗病基因相同，可能还存在其表达的时空特异性问题，究竟为什么B.sorokiniana叶枯病抗性与黑胚病抗性呈现负相关关系，需要进一步研究。

小麦苗期B.sorokiniana叶枯病抗性的室内鉴定条件易于控制、试验时间短，这为小麦抗黑胚病育种中大量育种后代的抗性鉴定提供了一种快速简便的鉴定方法。当然，以苗期叶枯面积推测黑胚病抗性会存在一定的误差，10.0%品系推测的抗性结果与接菌鉴定的抗性结果不一致，所以该预测方法仅适用于大量育种材料的初步筛选，且由叶枯面积推测的抗病品系必须再经过接菌鉴定确认。另外，小麦对不同致病菌的抗性机制也不一致，如CONNER 等[16]对7 个小麦品种A.alternata与B.sorokiniana黑胚病抗性的接菌鉴定中，同一品种2 种菌引起的黑胚率差异显著，所有抗病材料对A.alternata的抗性都强于感病对照品种，但仅3 个品种对B.sorokiniana黑胚病抗性强于感病对照。LI等[22]研究结果也显示，小麦对不同黑胚病致病菌A.alternata、B.sorokiniana、F.equiseti等的抗性不相关。所以，其他菌引起的黑胚病发生率与B.sorokiniana叶枯病病叶面积是否有这种相关性，有待进一步研究。