脓毒症中微小RNA的功能及临床价值研究进展

彭旸 朱鹏 覃刚

脓毒症在临床上十分常见,部分脓毒症患者可并发脓毒症休克、急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)、急性肺损伤(acute lung injury,ALI)及多器官功能衰竭(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)等严重并发症,甚至在短时间导致患者病死[1,2]。全世界范围内每年有超过4百万患者因脓毒症病死,其临床发病率也呈升高趋势,同时脓毒症本身也是导致入住重症监护室(intensive care unit,ICU)患者最常见的病死原因,导致了十分严重的卫生及社会负担[3,4]。细菌、病毒等病原体感染均可导致脓毒症发生,其具体致病机制十分复杂,目前认为,过度的免疫炎症应答及炎症风暴在其中处于核心地位[5,6]。微小RNA(microRNA,miRNA)是在人体内广泛分布的不具有编码功能的RNA,miRNA通常由19～24个核苷酸组成,其功能主要依靠直接结合到特定靶基因的3’-非编码区(untranslated region,UTR)来抑制该基因翻译相应的功能蛋白,从而对机体各类病理及生理过程发挥调控作用[7,8]。大量研究数据显示,miRNA在脓毒症致病及进展中发挥着重要的调控功能,同时特异miRNA作为脓毒症的临床诊断及预后的无创生物学指标也具有一定应用价值[9]。此外,由于miRNA在脓毒症致病中的重要调控功能,也有学者尝试使用靶向miRNA的方法来治疗脓毒症,虽然研究仅停留在基础阶段,但也显示出了潜在的临床价值[10]。因此,本文对脓毒症中miRNA的调控功能及临床应用方面的研究进展进行了简要综述,以求为临床诊疗提供参考。

1 miRNA参与调节脓毒症及其并发症的致病过程

目前认为,脓毒症致病的核心机制仍是机体过度的免疫炎症应答及损害所致。作为具有广泛生物学效应的调控分子,miRNA通过特定的信号通路参与了对脓毒症及相关严重并发症致病过程的调控,在这方面也积累了大量的研究数据[11]。相关的研究方面,如Wang等[12]发现,脓毒症患者及模型小鼠的外周血浆中存在miRNA-146a-5p表达水平的显著升高,机制分析也显示,IRAK-1基因是miRNA-146a-5p的靶向调控基因,升高的miRNA-146-5p可以直接结合到IRAK-1基因的3’-UTR,从而抑制功能蛋白IRAK-1表达,并激活下游信号通路,增强IL-6等炎性因子表达并加重炎症风暴及器官损伤,同时研究还发现,脓毒症患者的血浆miRNA-146-5p水平还与乳酸及凝血功能障碍存在密切相关性,提示miRNA-146a-5p参与脓毒症相关炎性损害的重要调控功能。Chen等[13]基于磷酸酯多糖(lipopolysaccharide phosphate,LPS)(细菌细胞壁的主要成分)诱导的脓毒症模型细胞(THP-1细胞系)研究显示,THP-1细胞中存在miRNA-135a表达水平显著升高,使用生物信息学技术分析显示,MTOM1基因是miRNA-135a的靶向调控基因。在培养细胞系中加入miRNA-135a抑制剂可以显著降低miRNA-135a的表达并增强MTOM1表达,从而减弱细胞相关炎性因子TNF-α、IL-6、IL-8的生成并缓解细胞凋亡作用。提示miRNA-135a在促进脓毒症相关炎症损害及细胞凋亡中具有重要的促进作用。Fitzpatrick等[14]的研究发现,在金黄色葡萄球菌感染的血管内皮细胞中miRNA-99表达存在显著升高,机制分析显示mTOR是miRNA-99的靶向调控基因,升高miRNA-99的表达可以显著抑制mTOR的表达,并升高IL-6水平,减少IL-10的产生,促进炎性损害。相反的通过抑制miRNA-99的表达则可以发挥相反的作用。研究结果也提示了miRNA-99/mTOR信号通路在脓毒症致病中的重要调控作用。He等[15]基于细胞模型的研究显示,在脓毒症患者或LPS处理的外周单个核细胞中存在miRNA-16-5p表达显著升高,而去乙酰化酶3(SIRT3)表达则显著降低,且病情更严重的脓毒症患者miRNA-16-5p表达升高更明显。机制分析显示SIRT3是miRNA-16-5p的靶向调控基因,SIRT3本身也是控制细胞代谢及稳定线粒体的重要调控酶,大量的研究也显示其在炎性损害时的糖酵解调控中发挥重要作用,这也提示miRNA-16-5p可通过上述途径参与促进脓毒症的发生及机体损害[16]。上述研究结果均提示了特异性miRNA及其调控的信号转导通路在参与脓毒症相关炎症损害中的重要调控作用。

脓毒症通常表现为全身炎性反应,严重患者常合并重要脏器及系统的损害,最常见的损害脏器包括肾脏、肺、心脏等,常表现为AKI、ALI及急性心肌损伤等[17]。脓毒症患者一旦合并上述重要脏器及系统的损害,可能在短时间内进展为多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS),患者短期内病死率通常会显著升高[3,18]。在miRNA调控ALI相关的研究方面,如Liu等[19]基于动物模型的研究显示,注射LPS诱导的脓毒症相关ALI小鼠存在肺黏膜细胞中miRNA-1224-5p表达的显著升高,通过升高miRNA-1224-5p的表达能够显著增强模型动物的炎性反应、ROS生成及肺功能损耗。荧光素酶分析显示,miRNA-1224-5p能够直接结合到PPAR-γ的3-UTR,从而抑制PPAR-γ/AMPLα信号通路的激活,并在体内外实验中加重LPS诱导的ALI。研究结果也提示了内源性miRNA-1224-5p是调控脓毒症所致ALI的重要分子。Li等[20]基于动物模型(LPS诱导的脓毒症相关心肌损伤小鼠)也发现,模型动物的心肌细胞中miRNA-361-5p表达存在显著的升高,同时G蛋白耦联受体4(Lgr4)的表达则显著降低,使用荧光素酶实验分析显示,LGR4基因是miRNA-361-5p的靶向调控基因。LGR4翻译的Lgr4蛋白本身Wnt信号通路的上游抑制蛋白,miRNA-361-5p主要是通过调控Lgr4的表达来影响Wnt信号通路激活,从而调控脓毒症时心肌细胞的坏死和凋亡,从而参与疾病的致病。Ding等[21]的也发现,在LPS诱导的脓毒症相关AKI动物及细胞模型(HK2细胞)中均观察在miRNA-103a-3p表达的显著降低,且miRNA-103a-3p能够靶向抑制CXCL12基因的转录,从而降低CXCL12蛋白的表达。CXCL12本身属于促炎症趋化因子,是脓毒症相关肾小球及肾小管炎症损害的重要调控因子,miRNA-103a-3p则通过对CXCL12表达的影响来发挥对脓毒症相关AKI的调控。与上述研究相似的结果还有许多,均显示了特异性miRNA在脓毒症相关严重并发症中的表达异常及发挥着重要的调控机制,这也为阐述脓毒症所致多器官损害提供了重要参考[22,23]。

2 miRNA用于脓毒症诊断及预后的临床价值

目前针对脓毒症的诊断方法主要是基于患者的临床表现,并使用如序贯性器官衰竭评分(sequential organ failure assessment,SOFA)等模型工具来确定,临床上并无十分准确的特异性生物指标来实现早期快速对脓毒症进行识别及评估[24]。作为无创性生物学指标,miRNA的检测较为简便快捷,尤其是可以在病情演变过程中进行动态重复检测,其用于脓毒症及其相关并发症的临床诊断及预后价值也逐渐得到学者的重视,相关的研究也积累了大量证据[25,26]。相关的研究方面,如Xu等[27]的研究纳入了40名脓毒症患者,检测了患者外周循环中的miRNA及炎性因子表达情况。研究结果显示,脓毒症患者外周循环中的miRNA-3663-3p表达呈存在显著升高,且miRNA-3663-3p与IL-6、IL-21、CXCL8及MCP-1的水平存在显著正相关。机制分析提示miRNA-3663-3p主要是通过靶向调节TDAG8基因的表达来参与对脓毒症时炎性因子的调控,从而参与脓毒症相关炎性因子风暴。同时研究还发现,miRNA-3663-3p单独用于诊断脓毒症的曲线下面积(area under curve,AUC)可达0.908,将miRNA-3663-3p的Cut-off值设定为0.02时,其诊断脓毒症的灵敏度及特异度均可达到100%。Zhang等[28]基于微阵列芯片筛选出脓毒症患者存在miRNA-7d-3p表达的显著升高,基于多元logistic回归分析显著miRNA-7d-3p是住院患者发生脓毒症的独立预测因子,单独使用miRNA-7d-3p诊断脓毒症的AUC可达0.696(95%CI:0.615～0.778)。同时研究者还在独立的患者队列中对上述结果进行了验证,获得了相似的临床诊断效能。Mao等[29]开展的临床研究显示,与健康对照相比,新生儿脓毒症患者血清miRNA-455-5p表达程度显著升高,且miRNA-455-5p与WBC计数、降钙素原(procalcitonin,PCT)及SOFA评分存在正相关。ROC分析显示,血清miRNA-455-5p水平单独用于诊断新生儿脓毒症的AUC可达0.895,且高表达miRNA-455-5p的患者临床预后更差,短期病死率更高(HR=3.454,95%CI:1.165～10.234)。Sankar等[30]开展的横断面研究显示,与健康对照相比,新生儿脓毒症患者存在外周循环中的miRNA-31、miRNA-21及miRNA-155表达程度显著升高,而miRNA-29a及miRNA-146a的表达程度则显著降低。其中血清miRNA-21和miRNA-29a分别单独用于诊断新生儿脓毒症的AUC分别为0.829和0.787,提示了上述指标用于脓毒症诊断的优良临床价值。此外,对脓毒症相关严重并发症的早期诊断也有助于临床开展针对性治疗,从而降低患者总体病死率。特异性miRNA在上述方面也体现了较好的临床价值,相关的研究如Ma等[31]纳入了184名脓毒症患者,结果显示,并发AKI的脓毒症患者尿液中miRNA-370-3p及miRNA-495-3p的表达显著降低,miRNA-370-3p及miRNA-495-3p分别单独诊断脓毒症相关AKI的AUC可达0.896及0.814,同时研究还发现,尿液中高表达miRNA-370-3p和miRNA-495-3p的患者住院28 d的生存率更高,提示了这两项miRNA也是脓毒症患者短期预后的独立影响因素。上述研究结果均提示了特异性miRNA用于脓毒症及其相关并发症的诊断具有较高的价值。

脓毒症具有较高的临床病死率,而miRNA作为评估脓毒症预后的无创指标,也具有较为优良的应用价值,得到了大量的研究数据支持。Geng等[32]的研究发现,与健康对照相比,脓毒症患者外周单个核细胞中miRNA-451a的表达存在显著升高,同时Th1细胞计数、Th1/Th2比值显著升高,而Th2细胞计数则显著降低。同时脓毒症患者的miRNA-451a与Th1细胞计数(P=0.002)、Th1/Th2比值(P=0.001)存在正相关,与Th2细胞计数呈负相关(P=0.005),而且miRNA-451a还与反映炎性水平的TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP等具有相关性,与SOFA及APACHE Ⅱ评分也存在相关性。多元Logistic回归分析显著,miRNA-451a(OR=1.86,95%CI:1.59～2.23)、Th1/Th2比值(OR=2.05,95%CI:1.72～2.45)是影响脓毒症患者28 d病死率的独立风险因素。Yang等[33]基于大样本脓毒症患者的临床研究显示,脓毒症患者外周循环中的miRNA-150表达存在显著升高,且住院28 d内发生病死的脓毒症患者miRNA-150升高更为显著。校正多个临床因素(年龄、PCT、血肌酐、尿素氮、糖尿病、总胆红素等)后的多因素回归分析显示,miRNA-150、SOFA评分是影响脓毒症患者28 d病死率的独立危险因素,miRNA-150及SOFA评分单独预测病死的AUC分别为0.762(95%CI:0.717～0.808)及0.735(95%CI:0.687～0.784),miRNA-150联合SOFA评分的模型预测病死的AUC为0.886(95%CI:0.857～0.916),灵敏度为86.2%,特异度为80.6%。Trung等[34]针对细菌感染所致脓毒症患者外周循环中的miRNA表达情况进行了筛查,发现了4种miRNA(miRNA-146-3p、miRNA-147b、miRNA-155及miRNA-223)在脓毒症休克及脓毒症患者之间存在差异。其中血浆miRNA-147b水平单独用于预测脓毒症休克的AUC为0.85(P<0.05),miRNA-147b联合PCT预测脓毒症休克的AUC为0.86(P<0.05)。Nour等[35]的基于儿童脓毒症患者的研究显示,在脓毒症早期患者外周血中即可出现miRNA-122及miRNA-181b表达水平的升高,而miRNA-223及miRNA-146a表达则存在显著下降。此外血清miRNA-223水平可用于预测脓毒症儿童的预后,预测患者30 d病死率的灵敏度为70%,特异度为75%。上述研究结果均提示了特异性miRNA用于脓毒症患者的预后评估具有潜在的重要价值。

3 靶向miRNA的治疗脓毒症的临床价值

基于特异性miRNA在脓毒症及其相关并发症中发挥着十分重要的调控作用,临床学者也逐渐关注基于靶向miRNA的治疗方法来改进对脓毒症的治疗,从而达到改善患者临床预后的目的。然而由于药物设计及安全性的原因,目前并无靶向miRNA治疗脓毒症及其并发症的药物或方法被批准应用于临床或进入临床试验,相关的研究也仅停留在细胞及动物模型层面。相关的研究方面,如Sun等[36]发现,与健康对照相比,脓毒症患者外周循环中miRNA-23a-3p的表达存在显著降低,同时高迁移率组盒1(HMGB1)、IL-6及TNF-α则显著升高。研究者同时在模型细胞(LPS处理的小鼠巨噬细胞RAW264.7)也观察到相似的结果[36]。通过增强miRNA-23a-3p(在培养细胞系中加入miRNA-23a-3p微粒)的表达可以抑制模型细胞分泌炎性细胞因子,机制分析也显示,miRNA-23a-3p的这一调控作用主要通过直接靶向结合到HMGB1的3’-UTR来抑制HMGB1表达实现。这也提示了miRNA-23a-3p具有抑制脓毒症相关炎性反应的潜在临床治疗价值。He等[37]的研究也发现,LPS诱导的THP-1细胞系存在miRNA-135a的表达升高,而MYOM1蛋白表达则显著升高。通过在细胞系中加入miRNA-135a抑制剂可以降低其靶向靶标基因 MYOM1及其编码蛋白的表达,从而有效降低IL-6、IL-8及TNF-α等炎性因子的合成,减轻细胞焦亡作用及炎症损害。上述研究提示了通过调节特异性miRNA的表达可以达到缓解脓毒症相关免疫炎症反应的效果,为临床开发治疗脓毒症的方法提供了一定参考。

随着研究的深入,在靶向miRNA治疗脓毒症相关并发症方面也取得了一些进展。一方面,特异性miRNA可能作为脓毒症相关AKI的潜在治疗靶点。相关的研究方面,如Zhang等[38]的研究也发现,在模型细胞(LPS诱导的HK-2细胞)及动物模型(CLS诱导的小鼠)均存在miRNA-181a-5p表达的显著降低,而NLRP3、NEK7、ASC、caspase-1、N-GSDMD等细胞凋亡调控因子及IL-18、IL-1β、TNF-α等炎性因子均存在表达升高。通过增强miRNA-181a-5p的表达可以抑制NEK7基因转录,从而降低NEK7蛋白调控的细胞凋亡作用及缓解脓毒症时的炎性损害。同时研究者在脓毒症相关AKI的动物模型中也验证了miRNA-181a-5p的上述作用效果,为治疗脓毒症相关AKI提供了重要参考。Zhang等[39]基于模型动物的研究发现,存在脓毒症相关AKI的大鼠外周循环中的miRNA-122表达存在显著降低,而HMBG1表达则显著升高。荧光素酶实验显示HMBG1时miRNA-122的靶向调控基因。同时研究者还在体外模型细胞中使用miRNA-22模拟物微粒来增强miRNA-122的表达,结果显示,HBZY-1细胞中的HMGB1/TLR4/NK-κB信号通路及相关炎性因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的表达可以得到显著降低,提示了miRNA-122具有控制脓毒症相关炎性风暴并减弱AKI损害的治疗价值。Wang等[40]的研究也发现,存在脓毒症相关AKI的患者miRNA-338-3p表达存在显著降低,基于LPS诱导HK-2细胞模型的研究也发现类似情况,同时IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等炎性因子则存在显著升高。通过升高模型细胞的miRNA-338-3p表达则可以降低相应炎性因子的表达,缓解LPS诱发的脓毒症相关AKI所致的损害。Yang等[41]开展的相似研究也显示,在LPS诱导的模型细胞(16HBE细胞)中存在miRNA-338-3p表达的显著降低,而OIP-AS1及ATF4蛋白则存在显著升高。机制分析显示,miRNA-338-3p可以直接靶向作用OIP-AS1基因,从而抑制其功能蛋白OIP-AS1的表达,并影响ATF4蛋白表达,从而增强模型细胞活性,并缓解炎性反应及细胞凋亡。

另一方面,如ALI、心肌损伤、凝血功能紊乱等均是脓毒症相关的严重并发症,而基于靶向特异性miRNA的治疗方面也为探索控制脓毒症相关严重并发症的新方法提供了重要参考。如Shen等[42]的最新研究发现,在脓毒症相关ALI及LPS诱导的人肺微血管内皮细胞(HPVECS)培养系中,miRNA-374a-5p的表达程度均存在显著下调,通过在细胞培养系中加入miRNA-374a-5p模拟物微粒来增高其表达,可有效的恢复细胞活力,同时抑制细胞凋亡及炎性因子的产生,从而缓解脓毒症所致的ALI。荧光素酶实验显示锌指E-box结合同型盒子1 (ZEB1)是miRNA-374a-5p的靶向调控基因,增高的miRNA-374a-5p可以靶向抑制ZEB1表达,从而减弱下游p38/MAPK信号通路的激活,来实现上述作用效果。心肌损伤是败血症的常见并发症。Yan等[43]基于脓毒症相关心肌损伤细胞模型(LPS诱导AC16细胞)的研究显示,模型细胞中miRNA-214-3p表达存在显著下降,而caspase-3、Bax、肌球蛋白-6,、肌球蛋白-7、心房钠肽等反应心肌细胞损害及凋亡的蛋白则存在显著升高。通过在模型细胞中增高miRNA-214-3p的表达则可以降低上述因子的表达,从而缓解LPS处理的心肌炎性损害机制分析显示,miRNA-214-3p主要是通过靶向抑制组织蛋白酶B(CTSB)基因的表达,从而发挥上述功能作用。这也为临床治疗脓毒症 相关心肌损害提供了参考。相似的如Liu等[44]基于细胞模型(LPS诱导的H9C2细胞,模拟脓毒症相关心肌细胞)的研究研究发现,H9C2细胞存在活力降低及miRNA-702-3p表达降低,通过在培养系中加入miRNA-702-3p模拟物微粒,可以显著降低TNF-α、IL-6、IL-1β的表达,从而抑制炎性反应及增强细胞活力。荧光素酶实验分析显示miRNA-702-3p的靶标基因为NOD1。这也为治疗脓毒症相关心肌损害提供了新的治疗方法。Hu等[45]的研究发现,在LPS诱导的细胞模型中,miRNA-539-5p的表达存在显著降低,通过增强miRNA-539-5p的表达水平可以显著抑制细胞炎性反应及凋亡,同时增强细胞活力和增殖能力,荧光素酶实验显示,白介素1受体相关激酶3(IRAK3)是miRNA-539-5p的靶向调控基因,miRNA-539-5p的这种调控功能主要通过影响IRAK3的表达来实现。Shen等[46]的研究也发现,与呼吸道感染患者相关,发生脓毒症的患者(n=34)外周循环中的miRNA-186-5p表达存在显著降低,而烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)水平则显著升高。研究者在动物模型(盲肠结扎穿刺的小鼠)中也发现了上述现象,此外通过注射miRNA-186-5p微粒的方法来增高miRNA-186-5p的表达则可以降低PT及PAI-1,同时增高PLT计数及纤维蛋白原浓度,从而达到改善脓毒症小鼠凝血功能紊乱的效果。机制分析显示,miRNA-186-5p的这一功能主要是通过靶向调节NAMPT的表达,从而抑制NF-κB信号通路激活来实现。这也为治疗脓毒症相关凝血功能紊乱提供了重要参考。

4 问题及展望

综上所述,在脓毒症及其相关严重并发症中,特异性miRNA发挥着十分重要的调控功能,尤其是参与对脓毒症时炎性应答调控。特异性miRNA作为脓毒症诊断及预后评估等的指标具有无创、便捷的优点,相关的研究方面也积累了很多临床证据。基于动物或细胞模型的研究显示靶向特定miRNA的治疗方法可以缓解脓毒症时的炎性损伤,但是这种分子靶向治疗方法距离临床实际应用还有许多困难需要克服。下步的研究仍需深入探讨miRNA在脓毒症复杂致病机制中的功能作用,从而为筛选临床诊断评估指标及探索安全有效的分子靶向治疗方法提供参考。