漆酶催化固定百里酚处理竹材及其防霉性能研究

王 慧, 孟 尧, 张巧玲, 窦婷婷, 余海萍,SHADRICK, 陈思瑶, 孙芳利

(浙江农林大学 化学与材料工程学院，杭州 311300)

0 引言

我国是世界上竹类资源最为丰富、开发利用竹资源最早的国家，竹材广泛地应用于人们生活当中。2018 年，我国竹产品出口贸易额超过21 亿美元，其中竹制餐具、竹制日用品等和与食品和人体密切接触的竹产品占比超过50%[1]。随着世界范围内“禁塑令”的颁布，“以竹代塑”是解决“塑料污染”问题的自然解决方案[2]。然而竹材中含有丰富的淀粉、糖类和蛋白质等物质，极易受到霉菌侵染，在使用和运输过程中易发生霉变，从而限制了竹材的应用[3-4]。常规竹材的防霉药剂主要以工业防霉剂为主，如IPBC (3-碘代-2-炔丙基丁基氨基甲酸酯)、DCOIT (4,5-二氯-2-N-辛基-4-异噻唑啉-3-酮) 和百菌清等[5-6]。这些杀菌剂虽然防霉效果好，但由于毒性较大或易致敏等原因，不适用于食品接触和与人体密切接触的竹产品中[7]。

随着人们对环境保护和自身安全意识的提高，天然抗菌剂被广泛地关注和研究，主要应用在食品、药品、农药及木竹材保护等领域[8]。源于植物精油的酚类物质能够抑制多种真菌的生长，如百里酚[9-10]。同时，百里酚相继被各国食品药品监督管理局认定为安全的食品、药品添加剂[11-12]，是食品接触和与人体密切接触类竹材防霉剂较好的选择。虽然百里酚作为竹材防霉剂绿色且安全，但存在因易流失和挥发而导致的时效性较差等问题。近年来，研究人员采用抗菌剂复配、包覆和化学改性等方法，降低天然抗菌剂的流失[13]。如果能在天然抗菌剂与竹材中的主要成分间建立牢固的化学连接，则能有效解决其易挥发和流失的问题，提高天然抗菌剂对竹材的保护时效性。

真菌漆酶是一类多酚氧化酶，其底物广泛，能够直接将酚类、苯胺类和天然大分子木质素等底物催化氧化，副产物只有水[14]。漆酶对木质纤维的催化作用已被广泛用于制浆造纸、无醛胶黏剂和人造板的无胶胶合等领域[15-17]。近年来，有关漆酶催化固定木竹材抗菌剂的研究也有所报道。Bi 等[18]和Fernández-Costas 等[19]利用漆酶的催化作用，将香草醛和松木提取物固定于木材中，发现其抗流失性明显提高。Prosper 等[20]和饶瑾等[21]采用漆酶将碘化钾固着于竹材中，以提高竹材的防霉性和防腐性。Wang 等[22-23]利用漆酶的催化作用将百里酚固定在竹材中，发现其可以明显降低百里酚在竹材中的挥发和流失，深入研究发现，在漆酶催化体系中，百里酚的高用量和漆酶的高活性是提高竹材防霉性能、满足实际需求的关键因素。

因此，本研究拟采用两步法处理竹材：第1步用抗菌剂浸渍处理，第2 步用漆酶催化固定处理，这样既可增加百里酚的用量，又可保证漆酶的高催化活性。本研究借助漆酶的绿色催化作用，将百里酚高效固着于竹材中，以降低百里酚在竹材中的挥发和流失，提升竹材的防霉效果。相关处理的示意图如图1 所示。并进一步研究竹材在漆酶催化固定百里酚处理前后表面化学改变，以探明百里酚在竹材中的固着机制。

图1 漆酶催化固定百里酚处理竹材的示意图Fig.1 Schematic showing preparation of laccase-catalyzed fixation of thymol to bamboo

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试材与药剂 红竹Phyllostachys iridescensC.Y.YaoetS.Y.Chen：采自安徽宣城，5 年生，去除竹青、竹黄后制成精刨竹条，规格为50 mm ×20 mm × 5 mm (长 × 宽 × 厚)。白腐菌漆酶 (BR，活性 ≥ 0.5 U/mg，上海阿拉丁试剂有限公司)，在45 ℃、pH = 4.5 时测得活性为0.66 U/mg；2,2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二胺盐 (ABTS)(纯度 ≥ 98%，上海阿拉丁试剂有限公司)；乙醇和百里酚 (分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；磷酸二氢钾 (分析纯，杭州华东医药集团有限公司)。

1.1.2 测试菌种 黑曲霉Aspergillus niger，编号为GDMCC 3.411；绿木霉Trichoderma virens，编号为GDMCC 3.140；桔青霉Penicillium citrinum，编号为GDMCC 3.458。3 种霉菌均购买于广东省微生物菌种保藏中心。

1.1.3 主要仪器 UV-2550 型紫外分光光度计 (日本Shimadzu 公司)；IR Prestige-21 型傅里叶变换红外光谱仪 (日本Shimadzu 公司)；X 射线光电子能谱仪 (美国Thermo Scientific 公司)；SU8000 型冷场发射扫描电镜 (日本Hitachi 公司)；OCA50AF型接触角测试仪 (德国Dataphysics 公司)。

1.2 漆酶催化固定百里酚

将供试竹材浸入质量分数为3%的百里酚乙醇溶液中，先在 -0.1 MPa下真空处理15 min，再在0.8 MPa 下加压处理30 min。取出竹块用滤纸吸干表面液体，称重，按公式 (1) 计算竹块中百里酚的载药量 (R)。

其中：m1和m2分别是试块浸渍处理前、后的质量，单位为g；c是处理液中百里酚的质量浓度，单位为g/0.1 kg；L、W和H分别代表竹块的长、宽和厚，单位均为mm。

浸渍后的竹块先气干6 h，然后置于真空干燥箱内，在40 ℃下干燥24 h。将一定量的漆酶和ABTS 溶于pH = 4.5、浓度为0.1 mol/L 的磷酸缓冲溶液中，配制成漆酶质量浓度为0.5 mg/mL 和ABTS 浓度0.5 mmol/L 的催化反应液。将浸渍过百里酚的竹块放入该溶液中进行真空加压浸渍 (浸渍条件同上)。浸渍结束后，置于40 ℃水浴下继续搅拌反应24 h，于40 ℃真空箱内干燥3 d。只经溶剂 (先乙醇后缓冲溶液) 加压浸渍的竹材，标记为Control；仅由3%的百里酚乙醇溶液处理的试样标记为Thymol；由3%百里酚乙醇溶液和漆酶共同处理的竹材标记为Thymol + Laccase；未经任何处理的空白竹材定义为Blank。每个处理组的重复竹块试样为6 个。

1.3 分析测试方法

1.3.1 防霉性能检测 将绿木霉、黑曲霉和桔青霉分别接种于竹材试块上[9]，按照GB/T 18261—2013《防霉剂对木材霉菌及变色菌防治效力的试验方法》的相关规定测定处理后的竹材对3 种霉菌的防霉性能。定期观察和记录竹块上霉菌感染面积和生长情况，确定被害值等级。被害值越低，防霉效果越好。试块霉变的分级标准见表1。

表1 试块霉变的分级标准Table 1 Classes of the infection value of the tested bamboo blocks

根据公式 (2) 计算处理竹材对霉菌的防治效力。

其中：E为防治效力，%，Dt为药剂处理试块的平均被害值；D0为未处理对照试块的平均被害值。

1.3.2 流失处理 为进一步了解漆酶催化百里酚在竹材中的固定效果，将竹材进行流失处理，并以试块流失处理前后对3 种竹材霉菌的防霉效果来表征漆酶催化固定的效果。流失处理过程参照美国木材防腐协会标准AWPA E11—2007《Standard Method of Determining the Leachability of Wood Preservatives》进行，每组6 个重复试样。取处理好的竹材试块置于500 mL 烧杯中，加入180 mL蒸馏水浸没试块。每隔6、24、48 h 更换一次蒸馏水，共计14 d。流失处理后的竹材试块按照1.3.1节中的方法进行防霉性能的测定。

1.3.3 竹材中百里酚挥发率测定 百里酚直接用于竹材防霉处理时存在易挥发的问题。本研究采用冷阱-紫外分光光度计联用的方法测试百里酚经漆酶催化处理前后的挥发情况。取相同质量的处理竹材，劈成细条状，放入二口烧瓶内，将水浴锅温度设置为40 ℃，通过加热和抽真空的方式加速竹材中百里酚的挥发，挥发出的百里酚经冷阱的低温环境 (-21 ℃) 冷凝收集，测试时间持续4 h。测试结束后，向冷阱中少量多次加入无水乙醇进行冲洗，最终定容至50 mL，并用紫外分光光度计标准曲线法对收集到的百里酚进行定量，根据公式 (3) 计算不同处理竹材中百里酚的挥发率(VR，%)。

其中：m3为冷阱中收集到的百里酚的量，g；m4为测试竹材中百里酚的量，g，根据载药量计算得出。

以体积分数为3% 的百里酚乙醇溶液单独处理的竹材作为对照。用紫外分光光度计法测定的百里酚浓度-吸光度标准曲线为y= 0.012x- 0.018；R2= 0.999。

1.3.4 处理竹材的红外光谱和表面X 射线光电子能谱仪 (XPS)分析 为研究漆酶催化后百里酚与竹材的相互作用机制，采用傅里叶变换红外光谱仪测试各处理竹材的全反射红外光谱，扫描范围4000～500 cm-1，扫描次数16 次，分辨率0.09 cm-1。

采用XPS 分析竹材表面化学成分变化，以单色化 A1 Kα 射线 (1486.6 eV) 为靶材，在真空度小于 5 × 10-7Pa 的分析室中对试样进行扫描，扫描步长0.1 eV，扫描范围0～1100 eV。

1.3.5 处理竹材形貌分析 将待测竹材试样绝干，用离子溅射仪镀金后，采用冷场发射扫描电镜观察竹材表面，电压 5 kV。

1.3.6 疏水性能测试 采用接触角测试仪测试竹材试样的静态接触角。去离子水滴的体积固定为5 μL，测试时间为5 s，同一样品取6 个不同的测试点测试，同一种处理方式6 个平行试样，最终结果取其平均值。以未经任何处理的竹材 (Blank)和只经溶剂 (先乙醇后缓冲溶液) 加压浸渍的竹材试块 (Control) 作为对照。

2 结果与分析

2.1 漆酶催化百里酚处理竹材的防霉效果

供试竹块对3 种霉菌的防霉效力测定结果见表2，防霉效果见图2。由图2 可知，对照处理竹材 (Control) 试样均在培养的第3 天开始发生霉变，并迅速发展为整个试样表面完全霉变，对3种霉菌的防霉效力均为0。然而，经百里酚单独处理竹材 (Thymol) 表面出现霉变的时间延后，仅有黑曲霉处理组在培养的第8 天有霉菌孢子附着在试样表面，但没有明显的繁殖和蔓延，在30 d的测试时间内，只有小于1/4 的竹块面积被黑曲霉侵染，被害值等级为1，说明用百里酚处理竹材，明显提升了竹材的防霉效果。对比Thymol 和Thymol + Laccase 的两组处理试块，最终防霉效力没有出现明显的差别 (表2)，只是Thymol + Laccase处理组竹块表面出现桔青霉和黑曲霉侵染的时间比百里酚单独处理组要早，这可能是由于在漆酶催化处理操作过程中，因少量的百里酚流失或者挥发造成的。

表2 不同处理竹材对3 种霉菌的防霉效果Table 2 Anti-mildew effect of bamboo with different treatment on three kinds of molds

图2 不同处理竹材对黑曲霉 (a 和b)、绿木霉 (c 和d) 和桔青霉 (e 和f) 的防霉效果及霉菌生长记录Fig.2 Anti-mildew effect and mold growth records of bamboo with different treatment against Aspergillus niger (a and b),Trichoderma virens (c and d) and Penicillium citrinum (e and f)

2.2 漆酶催化固定百里酚的效果

表3 和图3 展示了竹材经过挥发和流失处理后对3 种霉菌的防霉效果。从图3 可知，对照组竹材 (Control) 是最先发生霉变的，在测试的第12 天已经完全霉变。然而Thymol + Laccase 在30 d的测试期内表现出了优异的防霉效果，在第20 天时表面开始被霉菌感染，平均霉变等级为0.17，对3 种霉菌的防霉效力均大于95%，说明经漆酶催化处理以后，百里酚很好地固定在了竹材中，不受外界淋洗的影响，可持续发挥防霉作用。而百里酚单独处理组 (Thymol) 的防霉效力低于漆酶催化百里酚处理组 (Thymol + Laccase)，尤其是对黑曲霉和桔青霉，分别在第8 天和15 天出现了霉变现象，最终防霉效力分别为87.5%和79.2%，防霉效果相对降低，主要原因是百里酚单独处理竹材经过流失处理，其中起防霉作用的百里酚部分流失，造成抗菌成分含量降低，对桔青霉生长抑制作用也减弱。同时对比表3 和表2 发现，百里酚单独处理竹材在经过14 d 的流失试验后，对黑曲霉和桔青霉的防霉效力也相对降低，主要是由于百里酚的流失造成的。在以往的研究中，以百里酚等天然抗菌剂作为木、竹材的保护剂时普遍存在保护时效低的问题。从本研究结果可以看出：流失是百里酚作为竹材抗菌剂保护时效低的一个原因，因为百里酚单独处理竹材在经过流失处理后，防霉效果相对降低；另一个重要的原因可能是百里酚在竹材中容易挥发。

表3 不同处理竹材流失处理后对3 种霉菌的防霉效果Table 3 Anti-mildew effect of bamboo with different treatment on three kinds of molds after loss treatment

图3 经流失处理后不同处理竹材对黑曲霉 (a 和b)、绿木霉 (c 和d) 和桔青霉 (e 和f) 的防霉效果及霉菌生长记录Fig.3 Anti-mildew effect and mold growth records of bamboo with different treatment against Aspergillus niger (a and b),Trichoderma virens (c and d) and Penicillium citrinum (e and f) after loss treatment

进一步采用冷阱-紫外分光光度计法对各处理竹材中百里酚的挥发性进行了研究。由表4 可知，Thymol 处理组中，百里酚极易挥发，经过4 h的加速挥发处理，百里酚的挥发率高达17.03%。而经过漆酶固定处理后，Thymol + Laccase 处理竹材中百里酚的挥发率明显降低，仅为6.75%。该挥发率测定结果与流失处理后各处理竹材的防霉效果一致，由于漆酶的催化固定作用，使处理竹材在经过流失处理后仍表现出优异的防霉效果和较低的百里酚挥发率。由此证明，漆酶催化固定百里酚处理竹材是一种有潜力的长效防霉方式，可以很好地将百里酚固定于竹材中。

表4 不同处理竹材中百里酚的挥发性Table 4 Volatility of thymol in different treatment materials

2.3 处理竹材红外分析

与单独用百里酚处理的竹材相比，漆酶催化百里酚改性竹材降低了百里酚挥发率，提高了竹材的防霉效率，这可能是漆酶作用下百里酚与竹材发生了化学反应。关于竹材改性处理前后的化学键类型或官能团变化的信息通过FT-IR 进行了表征。如图4 所示，在2962～2866 cm-1处为甲基和亚甲基的C-H 拉伸振动相对应的吸收带，Thymol +Laccase 的强度略有增加，可能是由于新引入的百里酚中含有较多的甲基造成的。代表竹材木质素苯环骨架结构的特征峰 (1591～1418 cm-1) 各处峰强都有细微变化，说明在漆酶作用下竹材木质素苯环周围环境发生了变化。1237 cm-1和1025 cm-1处通常被认为是醚键 (C-O) 的特征峰，Thymol +Laccase 处理竹材的这两处峰发生了较为明显的变化，尤其是1025 cm-1处。有文献报道称，漆酶可以催化酚类物质形成苯氧自由基及其他电子转移共振结构，自由基之间很容易发生偶合成键[24]。结合以上分析及文献报道，推测在漆酶的催化作用下，百里酚与竹材木质素发生了化学反应，百里酚接枝于竹材木质素上，且很可能以醚键的方式成键。进一步通过处理竹材表面XPS 分析漆酶作用下竹材与百里酚间发生的化学反应。

图4 竹材改性前后的红外光谱图Fig.4 FT-IR spectra of bamboo before and after modification

2.4 处理竹材表面元素分析

应用 XPS 测试分析竹材表面C、H 和O 元素变化也可以提供百里酚和竹子之间发生接枝反应的证据。从表5 中可以得出，未经过处理的竹材(Blank)表面C 元素含量在66.83%，而经过漆酶催化百里酚处理 (Thymol + Laccase) 之后，C 元素含量增加为68.27%，这主要是因为处理后百里酚留在了竹材表面。百里酚 (C10H14O) 具有80%碳含量，高于竹材表面碳含量。所以用百里酚处理竹材会造成竹材表面碳元素和C/O 比的增加，C/O 比从2.01 增加至2.15。而对比Thymol 和Thymol + Laccase 处理组，Thymol + Laccase 处理组碳元素增加的更多，可能是由于漆酶的催化作用使百里酚更多地保留在了竹材中，而Thymol 处理组由于百里酚与竹材之间缺乏牢固的连接，百里酚在竹材中只是以物理吸附状态存在，在后续的烘干和保存处理过程中很容易流失。

表5 竹材改性处理前后的表面元素含量变化Table 5 Changes of surface element content of bamboo before and after modification

进一步采用C1s、O1s 高分辨谱分峰拟合对竹材表面C、O 元素来源进行追溯，结果见图5。其中C1s 总峰被分成3 个小峰(C1、C2、C3)，其中C1 代表与碳原子以单键或与氢原子连接的碳原子(-C*－C/－C*－H)，C2 代表与一个氧原子以单键连接的碳原子(+C*－OH/+C*－O－C)，C3 代表与两个氧原子分别以单键连接或与一个氧原子以双键连接的碳原子(-C*＝O/－O－C*－O)[25]；O1s 被分成两个小峰(O1、O2)，其中O1 代表与以双键连接的氧原子(-R＝O)，O2 代表以单键连接的氧原子(-R－O-)。

图5 竹材改性前后的高分辨率C1s 和O1s 光谱Fig.5 High-resolution C1s and O1s spectra of bamboo before and after modification

对C 和O 元素分峰拟合后的结果见表6。从中可以发现，Thymol + Laccase 处理组竹材中C1 相对含量显著增加，这表明竹材表面的C-C 键和C-H 键数量增多。说明经过漆酶催化Thymol改性后，Thymol 与竹材发生了某种键合连接，使得Thymol 保留在竹材表面，从而导致C1 相对含量的增加。研究表明，漆酶作用于木质素类酚结构的主要方式包括 -C*－OH/-C*－O－C 结构间的连接以及向 -C* = O 结构的转变[26]。因此，在T h y m o l + L a c c a s e 处理组的竹材中，代表-C*－O- 单键结构的C2 和O2 相对含量降低，代表 -C*＝O 结构的O1 相对含量增加。理论上，接枝反应会导致C2 含量增加，然而实际上C2 含量降低，这可能是因为漆酶对竹材木质素的氧化作用大于漆酶催化Thymol 与竹材的接枝反应。此外，在Thymol + Laccase 处理组的竹材中百里酚的引入也会导致竹材元素相对含量发生变化。百里酚单独处理组 (Thymol) 的竹材元素含量也发生了一定变化，这主要是因为残留在竹材内部的Thymol 的影响。综合以上结果，再结合图4 中FT-IR 结果醚键特征峰的变化，可以推断，漆酶催化下Thymol 与竹材的连接主要以醚键方式存在。

表6 竹材改性处理前后的C1s 和O1s 峰的亚峰面积Table 6 Subpeak area of C1s and O1s peak before and after bamboo modification

2.5 处理竹材形貌变化及接触角变化

2.5.1 处理竹材表面形貌分析 各处理竹材的横切面与纵切面微观形貌如图6 所示。可以看出，竹材经百里酚单独处理后 (Thymol)，微观形貌并没有发生明显的变化，竹材的表面与对照 (Control)一样，平整且光滑，这主要是因为百里酚为小分子物质，配制成乙醇溶液浸渍于竹材中，其渗透性较好。而经过漆酶催化处理的竹材 (Thymol +Laccase)，表面出现大量小的薄片及颗粒，这些物质可能是漆酶催化竹材和百里酚的反应产物。

图6 不同处理竹材的微观形貌Fig.6 Micro-morphology of bamboo with different treatment

2.5.2 处理竹材水滴接触角分析 从流失处理后竹材的防霉性能和竹材中百里酚的挥发率可知，经漆酶的催化作用，百里酚被有效地固定在竹材中，提升了竹材的防霉性能及百里酚的抗挥发性。考虑到百里酚是一种亲酯性物质，因此采用静态水接触角分析来进一步探索漆酶催化百里酚在竹材上的固着性，结果如图7 所示。由图7可知，竹材经过反应溶剂 (乙醇和缓冲溶液) 处理以后，接触角并未发生很明显变化，但经百里酚处理后，表面疏水性增强，接触角从35°增加到97°，说明不管是百里酚单独处理 (Thymol)，还是漆酶催化百里酚处理 (Thymol + Laccase)，都增加了竹材的疏水性，这主要是由于百里酚是酯溶性物质。对比Thymol 处理组与Thymol + Laccase 处理组，后者的接触角增加更为明显，接触角大于90°，更加疏水，分析原因：一方面是由于竹材经漆酶催化固定百里酚处理后，百里酚被固定于竹材中，不会因后续的各种处理、烘干、放置等过程而大量挥发和流失；另一方面是由于竹材经漆酶和百里酚共同处理后，可能消耗竹材木质素中亲水性的酚羟基，使处理竹材疏水性增强。众所周知，竹材霉菌等微生物生长繁殖的必备条件之一是充足的水分，所以当竹材经漆酶催化百里酚处理后，疏水性的增加有利于竹材防霉[22]。

图7 不同处理竹材5 s 内的静态水接触角变化Fig.7 Contact angle value of different treatment bamboo within 5 s

3 结论

以天然抗菌剂百里酚单独处理竹材存在流失和挥发，其对竹材的保护时效短，效率低。采用漆酶催化固定一步法处理，存在漆酶活性与百里酚难以兼顾，处理竹材防霉性能难以满足实际需求。本研究采用天然抗菌剂加压浸渍和漆酶催化反应两步法处理竹材，可高效地将百里酚固定于竹材中，赋予竹材安全、长效防霉性能，挥发率降低10.28%，漆酶催化固定百里酚处理竹材流失前后均表现出优异的防霉效果。漆酶催化固定百里酚处理竹材的化学变化表明，在漆酶的催化作用下，百里酚可能以醚键的方式与木质素结合。本研究提供了一种优化的竹材绿色酶催化的防霉方法，但酶促处理条件和竹材处理方式很大程度上决定了竹材的防霉性能，可继续优化；同时，百里酚载药量较高，后续仍需要进一步筛选活性更高的天然防霉物质。研究漆酶催化作用下百里酚在竹材中的固着机理，对酶促处理竹材的性能提升有很多启发，值得深入研究。

致谢 (Acknowledgement)：感谢研究生王婕在前期对研究方法的探索，同时在百里酚挥发率测定方面和数据分析过程中提出的宝贵修改意见；感谢研究生樊志威在论文撰写和后期修改过程中提供的意见和帮助！