夏天无片对血管性痴呆模型大鼠学习记忆能力及海马神经元凋亡的影响＊

陈 乔，余海燕，李俊波，李佳丽，徐文菲，胡卓瑶

（1. 江西中医药大学中医学院 南昌 330004；2. 萍乡卫生职业学院 萍乡 337006）

血管性痴呆（Vascular Dementia，VD）是指由原发或继发性脑血管病变引起的脑组织缺血缺氧，以记忆认知减退、日常生活障碍等为主要临床表现的综合征。据世界卫生组织报道[1]，至2040 年全球痴呆患病人数预计增长到8100万，其中VD约占比20%，仅次于阿尔茨海默病（约60%），严重困扰中老年人身心健康。作为迄今唯一可以防治的痴呆类型，探寻其有效治疗途径意义重大。

中药夏天无（Corydalis Decumbentis Rhizoma，CDR）具有活血舒筋、除湿通络之功[2]，现代研究发现夏天无对抗血小板聚集作用明显[3]，同时可显著降低血液流变及流速指标，对治疗缺血性脑血管疾病疗效显著[4]。本课题组前期研究发现[5]，夏天无可减少海马神经元细胞凋亡，从而改善VD 大鼠学习记忆能力。张惠琴等[6]发现其作用机制可能是与下调VD 模型大鼠海马组织中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（caspase-3）水平有关，而对其他凋亡相关蛋白Bax 及B 淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）表达的调节作用未见报道。本课题应用夏天无片干预VD 模型大鼠，旨在进一步探讨其抑制神经元凋亡的机制。

1 材料与方法

1.1 实验药物

药品均购于江西省中医院药房，夏天无片由江西天施康公司生产，规格：0.3 g/片，每粒含原阿片碱不少于0.9 mg，批号：20010101；尼莫地平片由亚宝药业公司生产，规格：0.02 g/片，批号：170606。配制：将夏天无片经研磨后加入适量蒸馏水配置成20 mg·mL-1、40 mg·mL-1、80 mg·mL-1三种浓度的混悬液，尼莫地平片以同法配置成浓度为1 mg·mL-1的混悬液，将所有混悬液置于4℃下保存，用前加热摇匀。

1.2 动物

SPF级8周龄SD健康雄性大鼠84只，体质量180-220 g，采购于江西中医药大学实验动物中心，许可证号：SCXK(赣)2018-0003，合格证号：0002396，动物实验经江西中医药大学伦理委员会批准，批号：JZLLSC20220574。

1.3 试剂与仪器

TUNEL 荧光试剂盒（凯基生物，KGA7061）；Bcl-2抗体（安诺伦，26593-1-AP）；Bax 兔单克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，A19684）；SABC 免疫组化试剂盒（博士德，SA1022）；DAB 显色试剂盒（博士德，AR1022）；Morris 水迷宫装置（北京药物研究所）；石蜡包埋、切片机（德国 Leica）；Western blot 电泳电转装置（上海天能）；Advanced 3.2 图像软件（德国麦克奥迪公司）。

1.4 造模方法

VD大鼠模型采用改良双侧颈总动脉结扎（2-VO）法[7]制备。所有大鼠经适应性饲养1 周后，无异常，随机选取14 只划为假手术对照组。剩余大鼠术前禁食12 h，正常饮水，7%水合氯醛（0.35 g·kg-1）腹腔注射进行麻醉，经备皮、消毒后，分离一侧颈总动脉，分别结扎近心端及远心端，并从中间剪断，术后于创口处撒入阿莫西林防止伤口感染。假手术组仅分离颈总动脉，但不进行结扎。1 周后按照以上方法对另一侧颈总动脉进行处理。

1.5 分组与给药

据临床人用剂量折算大鼠用量，设为夏天无中剂量组，各组间按等比排列[8]。造模完成后采用双盲法将70 只大鼠随机均分为模型对照组、尼莫地平组（0.3 g·kg-1），夏天无高（0.8 g·kg-1）、中（0.4 g·kg-1）、低（0.2 g·kg-1）剂量组。经前期预实验后，于造模后第2天进行动物灌胃给药，每日1 次，连续40 天。假手术对照组及模型对照组灌予2 mL去离子水。

1.6 神经行为学检测

给药结束后采用Morris 水迷宫进行空间定位、定向能力检测。为让大鼠提前熟悉水迷宫环境，需在实验前1 天，让其自由游泳2 min。开始定位航行试验时，池中放入平台，观察记录大鼠找到平台所需时间（逃避潜伏期）。连续5天，每日2次。第6天进行空间探索实验，撤去平台，观察统计大鼠穿越原平台区域次数。

1.7 取材

水迷宫实验结束后，从各组中随机抽取7 只进行灌注固定，余下大鼠采取颈椎脱臼取海马组织冷冻备用。

1.8 HE染色、TUNEL及免疫组织化学染色、

脑组织依次经4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，浸蜡，石蜡包埋后，行冠状位切片，厚4 µm，严格按照各试剂盒说明书染色步骤操作。HE 染片在400 倍光镜下观察神经元形态学变化。TUNEL 采用荧光显微镜下随机3 个视野计算阳性细胞数，取平均值作为统计指标。运用兔抗鼠Bax、Bcl-2 多克隆抗体（滴度均为1∶200）进行免疫组织化学染色，显微镜下随机3 个视野计算阳性细胞数，取平均值作为统计指标。

1.9 Western blot蛋白表达检测

各组大鼠依次进行海马组织蛋白抽提，BCA 法蛋白浓度测定，加热变性。采用SDS-PAGE 电泳，上样量为30 µg，PVDF 膜湿转1.5 h，5%脱脂奶粉封闭2 h，Bax、Bcl-2（1:1500）一抗4℃孵育过夜。羊抗兔IgG（1∶8000）二抗孵育1 h，高灵敏度化学发光显影。Image J测定灰度值，以β-actin（1∶50000）为参照计算各蛋白相对表达量。

1.1 0 统计学分析

所有实验数据采用SPSS22.0 软件统计分析，计量资料用均值±标准差（）表示，除定位航行实验采用重复测量多因素方差分析[9]外，其余数据符合正态分布选用独立样本t检验，不符合正态分布采用非参数检验，以P＜0.05认为差异具有显著性。

2 结果

2.1 夏天无片对VD模型大鼠神经行为学的影响

2.1.1 夏天无片对VD模型大鼠空间学习能力的影响

结果显示，第1 天各组大鼠平均逃避潜伏期无明显差异（P＞0.05）；与假手术对照组比较，模型组大鼠自第2 天起平均逃避潜伏期显著延长（P＜0.05 或P＜0.01）；较模型组，尼莫地平组平均逃避潜伏期明显缩短（P＜0.05 或P＜0.01），夏天无各剂量组平均逃避潜伏期明显缩短，差异具有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01），尤以夏天无高、中剂量组效果明显。见图1。

图1 各组大鼠不同时间平均逃避潜伏期的比较（n=14）

2.1.2 夏天无片对VD模型大鼠空间记忆能力的影响

与假手术组相比，模型组大鼠在90 s 内穿越平台次数减少（P＜0.01），有极显著性差异；较模型组，夏天无低剂量组与模型组差异不明显（P＞0.05），夏天无中、高剂量组穿越平台次数较于模型组明显增加（P＜0.01），尼莫地平组平均逃避潜伏期明显缩短（P＜0.05或P＜0.01），治疗组组间无明显差异。见图2。

图2 各组大鼠穿越平台次数的比较（n=14）

2.2 夏天无片对VD模型大鼠海马CA1区病理改变的影响

假手术组大鼠锥体细胞排列紧密，胞膜完整，胞浆丰富，细胞核呈紫蓝色，核仁清晰明显。模型组与假手术组比较，锥体细胞层变薄，神经元排列松散紊乱，数目明显减少，结构不同程度受损，部分细胞胞膜破裂，细胞核深染，染色质固缩甚至裂解。与模型组比较，各治疗组上述病理改变不同程度上有所改善，夏天无中、高剂量组更为明显。见图3。

图3 各组大鼠海马CA1区HE染色(×400)

2.3 夏天无片对VD模型大鼠海马CA1区神经元凋亡的影响

红色荧光即为TUNEL阳性细胞，假手术组大鼠海马CA1区未见明显凋亡细胞。模型组大鼠海马CA1区凋亡细胞数与假手术组相比显著增多（P＜0.01）；较模型组，尼莫地平组海马CA1 区凋亡细胞明显减少（P＜0.01），经夏天无片干预后，海马CA1 区神经元凋亡数量较模型组大鼠明显减少，差异具有统计学意义，其中夏天无低剂量组（P＜0.05），高、中剂量组（P＜0.01）。见图4和表1。

表1 各组大鼠海马CA1区Bax、Bcl-2阳性神经元比较（个，，n=7）

表1 各组大鼠海马CA1区Bax、Bcl-2阳性神经元比较（个，，n=7）

注：与模型组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。

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图4 各组大鼠海马CA1区TUNEL染色(×200)

2.4 夏天无片对VD 模型大鼠海马CA1 区Bax、Bcl-2阳性神经元的影响

棕黄色颗粒为Bax、Bcl-2 蛋白的阳性表达，主要分布在胞质区。与假手术相比，模型组海马CA1 区Bcl-2 阳性细胞数量增多（P＜0.01），较模型组，尼莫地平组海马CA1 区Bcl-2 阳性细胞数量增多（P＜0.05），夏天无中、高剂量组则较模型组有显著增加（P＜0.01）；模型组较假手术组Bax 阳性细胞数量增多（P＜0.01），夏天无高剂量组及尼莫地平组则较模型组显著减少（P＜0.01）。见图5、图6和表1。

图5 各组大鼠海马CA1区Bcl-2免疫组化染色(×400)

图6 各组大鼠海马CA1区Bax免疫组化染色(×400)

2.5 夏天无片对VD 模型大鼠海马Bax、Bcl-2 蛋白表达的影响

Western blot 实验结果显示，模型组大鼠海马Bcl-2/Bax 水平降低，与假手术组比较具有显著性差异（P＜0.01）；夏天无各剂量组及尼莫地平组相较于模型组Bcl-2/Bax水平显著升高（P＜0.05或P＜0.01）。见图7。

图7 各组大鼠海马Bcl-2/Bax水平（n=7）

3 讨论

VD 高发人群为中老年，伴有不同程度智力及认知功能障碍表现。中医将其归属于“痴呆”、“呆病”等范畴。清代王清任有言：“灵机记性不在心，在脑。高年无记性者，髓海渐空也。”痴呆病位在脑，髓空为其基本病机。脑为髓海，元神之府，脑荣则灵机而有生气。精血同源，精赖血得以生，精充则化髓有源，脑有所养。中医所谓“久病必虚，久病必瘀”。

中国药典载夏天无具有活血通络之功，用于血管性痴呆治疗，符合中医“淤血去则新血生”的观点。夏天无片由单味中药夏天无制成，生物碱类是夏天无的主要化学成分。现代药理学证明，夏天无具有镇痛、提高记忆力等多种作用。近年来，对于夏天无的作用研究越来越重视，夏天无对血管性痴呆学习记忆障碍有一定改善作用。本实验通过夏天无片干预VD 发现，随时间推移各剂量组能不同程度上改善模型大鼠的学习记忆能力，对于其病理改变也不同程度上有所改善，再次验证了夏天无片防治VD的疗效。

海马是大脑中与认知与记忆功能相关的关键脑区之一。研究发现[10]，海马通过经典的三突触通路对脑内信息进行编码储存，CA1 区作为突触通路的主要输出端，参与记忆形成的整个过程。电生理实验表明[11]，CA1区锥体细胞对包括缺血缺氧、应激等刺激的反应更加敏感。阻断脑血流时，CA1 区微循环血容量减少，且明显低于海马体其它分区。可见，海马CA1区可作为衡量药物对缺血性血管性痴呆疗效的一个主要观察区。所以，本课题组从神经元凋亡角度，选择海马CA1 区为观察对象，进一步探讨了夏天无对神经元保护的可能作用机制。

凋亡是细胞自发的程序性死亡，生物内环境稳态的维持有赖于体内凋亡相关基因表达的动态平衡。Bcl-2、Bax 是与细胞凋亡有关的调控蛋白，其中Bcl-2是抑制细胞凋亡的调控蛋白，Bax 是促进细胞凋亡的调控蛋白。研究表明，Bcl-2和Bax表达水平的高低与细胞凋亡直接相关，Bcl-2与Bax的比值决定细胞的存活能力。Bcl-2 蛋白表达水平升高时，抑制细胞凋亡；Bax 蛋白表达水平升高时，促进细胞凋亡[12]。本实验结果证明，脑缺血缺氧可引起细胞凋亡，经夏天无片干预治疗后，VD 大鼠海马CA1 区神经元凋亡数量可有效减少。本课题组进一步采用免疫组化和蛋白印迹生物学实验从定位、定性、定量等方面对Bax、Bcl-2蛋白水平进行检测。实验结果表明，VD 模型大鼠相较于假手术组，海马CA1 区神经元凋亡数目增多，Bcl-2、Bax阳性神经元皆增多，Bcl-2/Bax水平降低，证实了2-VO 造模方法引起脑组织缺血缺氧最终可诱导海马神经元的凋亡，造成记忆认知能力损害。夏天无片则可明显提高Bcl-2/Bax 水平，增加Bcl-2 阳性神经元而减少Bax 阳性神经元的表达，减弱海马CA1 区神经元凋亡效应，抑制海马神经元凋亡，从而起到防治血管性痴呆的疗效。

综上，夏天无片有效治疗血管性痴呆的机制可能是通过提高海马Bcl-2/Bax 水平，发挥抗凋亡效应，进而减少细胞程序性死亡，达到神经元保护作用。但本研究仅从Bax，Bcl-2 基因角度阐明了凋亡的浅层机理，而对有关夏天无片抑制神经元凋亡的具体作用通路并未涉及，以期后续实验作深入探讨。