基于IL-6/STAT3通路探讨参芪复方对缺血性心力衰竭大鼠Th17/Treg平衡的影响＊

史胜楠，苗 兰，李 磊，马彦雷，孟红旭，史 跃，王培利，刘建勋＊＊

（1. 中国中医科学院西苑医院/基础医学研究所/中药药理北京市重点实验室 北京 100091；2. 中国中医科学院西苑医院/国家中医心血管病医学研究中心 北京 100091）

缺血性心力衰竭（Ischemic heart failure，IHF）是由于冠状动脉病变引起管腔狭窄导致血液灌流受阻使心肌处于长期缺血状态，导致心脏结构和功能受损而表现出的一组临床综合征，是发达国家和发展中国家心血管发病率和死亡率的主要原因[1]。目前，IHF的治疗策略是在预防或减少心脏缺血负担的基础上延缓心室重构，如早期的血运重建术及神经内分泌激素抑制剂的应用[2]。这些治疗方案的不断优化在一定程度上降低了IHF的发病率，但再住院率仍居高不下，住院后的5年生存率仅为25%[3]。同时，在药物的长期使用中，电解质、体液代谢紊乱等不良反应也导致了患者依从性变差，临床远期疗效大打折扣。因此，探寻IHF新的治疗策略和靶点具有重要意义。

近年来，IHF 被认为是一种慢性免疫系统激活的状态[4]，在心脏缺血性损伤发生的早期阶段，辅助性T 细胞17（T helper cell 17，Th17）、调节性T 细胞（Regulatory cell，Treg）作为CD4+T 效应细胞亚群之一，可以共同协调死亡心肌细胞的清除，参与瘢痕肉芽组织形成，并通过分泌促血管生成、促存活和抗炎介质来调节随后的心脏修复和炎症消退[5]。然而持续的免疫细胞浸润会使得白细胞介素-6/信号转导及转录激活因子3（Interleukin-6/signal transducer and activator of transcription 3，IL-6/STAT3）信号通路异常激活，促使Th17 细胞过度分化，同时抑制Treg 细胞分化，导致Th17/Treg 细胞失衡[6]，诱导不利的心脏重塑，加速IHF的发展。因此，通过调节IL-6/STAT3 信号通路维持Th17/Treg 细胞的动态平衡可能是防治IHF 的靶点之一。

中医学认为IHF属于“胸痹”、“喘证”等范畴，其发生和发展与“气”的功能失调有关。心气与宗气亏虚，导致血瘀、痰饮、寒凝等病理产物堆积心脉，出现心悸、胸闷、喘憋等症状。疾病后期气、血、水湿、痰瘀互为因果，形成恶性循环。因此，益气是斩断不良病理产物的基础，是恢复心主血脉功能的前提。参芪复方是本课题组通过总结临床经验和文献数据挖掘，结合正交设计和剂量筛选配制而成，以人参、黄芪为主药，人参补益心肺宗气；黄芪补气升阳，利水消肿。前期基础实验已经证明参芪复方在改善IHF 大鼠心功能、减轻心肌纤维化方面具有良好药效[7]。现代药理研究表明，黄芪多糖可以提高免疫抑制模型小鼠Treg 比例，降低CD4+T 细胞数量，抑制IL-17 分泌活性[8]；人参皂苷CK 可以减少TNF-α、IL-6含量，增加Treg 细胞含量，减轻心梗小鼠心脏炎症损伤[9]。但是参芪复方对于IHF 模型大鼠IL-6/STAT3 通路及Th17/Treg 免疫平衡的影响目前还未有明确报道，本研究通过构建IHF大鼠模型，对此进行初步研讨。

1 资料与方法

1.1 药物

参芪复方由人参3 g、黄芪30 g 组成（河北百草康神药业有限公司，批号分别为：2003011、2009012）。复方制备方法如下：①分别按照人参、黄芪1:10 的原料配比称取人参、黄芪，加药材10 倍重量的水煎煮3 次，每次2 h，每次煎煮药液经过滤去渣后合并，搅拌均匀；②将步骤①所得的滤液进行真空浓缩，浓缩到以水作参考密度，60℃时相对密度为（1.05-1.10）g·cm-3的稠膏（出膏率为48%）再加入适量糊精（生药与糊精重量比为10:1），搅拌均匀，过100 目筛，取筛下物进行常规喷雾干燥，得到参芪复方。阳性对照药：福辛普利（规格10 mg，中美上海施贵宝制药有限公司，国药准字H19980197）。

1.2 动物

雄性SPF 级SD 大鼠60 只，购自北京斯贝福生物技术有限公司，体质量（190±10）g，许可证号SCXK（京）2019-0010，饲养于中国中医科学院西苑医院实验动物中心，温度（25±2）℃，湿度（50%±6%），光照12 h，昼夜交替，自由进食饮水，适应性饲养7天后实验。本实验通过了中国中医科学院西苑医院伦理委员会审批，伦理批件号为2019XLC016-2。

1.3 试剂

ELISA 试剂盒：IL-17A（美国abbkine，货号：KET9005）、IL-6、TNF-α（美国raybio，货号：ELRTNFa-1、ELR-1L6-1）、IL-10（中国酶免，货号：MM-0195R1）；一抗FOXP3、RORγt（美国proteintech，货号：22228-1-AP、13205-AP）；一抗IL-6、STAT3、STAT3（phospho S727）（英国abcam，货号：ab9324、ab68153、ab32143）；流式抗体CD4-PerCP、CD3-FITC、IL-17-PE、CD25-PE、FoxP3-APC（美国eBioscien，货号：46-0040-82、11-0030-82、12-7177-81、12-0390-82、17-5773-82）；RPMI-1640 完全培养基（含10% FBS）（武汉普诺赛生命科技有限公司，货号：PM150110B）、Leukocyte Activation Cocktail（美国BD，货号：550583）、破膜固定缓冲液套件（德国Thermo Fisher，货号：00-5523-00）。

1.4 仪器

Vevo2100 型高分辨率超声影像系统（加拿大Vissual Sonics）；酶标仪/酶联免疫分析仪（美国博腾Epoch2）；电泳仪、小垂直电泳槽、凝胶成像仪（美国博乐1645050、1658001、DOC XR+）；FACS 流式细胞仪（美国BD FACS Canto Plus）；37℃，5% CO2孵箱（德国Thermo Fisher）。

1.5 方法

1.5.1 动物造模及分组

大鼠术前1 天禁食水，采用结扎冠脉左前降支制备心梗后心衰模型[9]，麻醉大鼠后将其四肢仰卧位固定至鼠板，左胸部脱毛，行气管插管，接入小动物呼吸机；随后沿左侧第4 肋间开胸，钝性分离肌肉，扩胸器撑开肋骨暴露心脏，剪开心包，在肺动脉圆锥和左心耳交界1-2 mm 处无创缝线穿线，结扎冠状动脉前降支作为模型组，假手术组只穿线不接扎；以结扎部位以下心肌变白，搏动减弱且心电图出现ST段弓背向上明显抬高为成功标志；缝合，在伤口处涂抹青霉素。待大鼠苏醒后取出气管插管，送至动物房，恢复正常饮食饮水。造模成功大鼠按照随机数字表法分为模型组、参芪复方低、中、高剂量组、福辛普利组各10只，假手术组10只。

1.5.2 给药

全省而言，陕西延安、渭南、咸阳、宝鸡、铜川、榆林六个苹果主产区苹果全部遭受倒春寒冻害，这次低温冻害降温幅度大、持续时间长，为50年不遇的极端灾害性天气，冻害期间正值苹果花期，导致全省大范围果树遭受冻害，对果品产量、质量造成了多年来极为罕见的严重影响。

根据课题组临床试验用药剂量按照体表面积换算法[10]得出大鼠的给药剂量，参芪复方低、中、高剂量分别为1.66、3.33、4.99 g·kg-1，福辛普利片1.05 mg·kg-1。各给药组连续灌胃5 周，每日1 次，假手术组和模型组给予等量生理盐水灌胃。

1.5.3 HE染色观察心肌组织形态学改变

心超检测后，开胸取出大鼠心脏，用冰浴生理盐水冲洗，切取部分左室前壁心肌组织固定于4%多聚甲醛溶液中，经不同浓度的乙醇溶液逐级脱水，二甲苯中透明，石蜡缸浸蜡，倒入模具，进行包埋切片；将切片依次放入二甲苯、无水乙醇中梯度脱蜡；苏木素浸染6 min，自来水洗2 min，1%盐酸乙醇分化5 s，水洗7 min，伊红染2 min，流水快速冲洗，切片依次进行无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下拍照，进行图像采集分析[11]。

1.5.4 心脏超声检测大鼠心功能

末次给药结束后麻醉大鼠，将胸部左侧锁骨至肋下缘进行脱毛处理。在备皮处涂抹医用超声耦合凝胶，用探头定位在乳头肌水平长轴切面，频率设定17.5 MHz，进行M 型超声检查。选用左室收缩末期内径（LVDs）、左室舒张末期内径（LVDd）、左室收缩末期容积（LVESV）、左室舒张末期容积（LVEDV）评价左心室重塑情况，左室射血分数（LVEF）、每搏输出量（SV）、心输出量（CO）、短轴缩短率（LVFS）评价心功能情况，以上指标均连续测量3个周期，取平均值。

1.5.5 ELISA 检测大鼠血清IL-17A、IL-6、TNF-α、IL-10含量

腹主动脉取血后，静置30 min，低温高速离心机以4℃，3000 r·min-1离心10 min，取上层血清-80℃冻存备用。采用ELISA 法检测血清IL-17A、IL-6、TNF-α、IL-10水平，实验步骤按照试剂盒方法进行操作。

1.5.6 流式细胞术检测大鼠脾脏及外周血Th17、Treg含量

摘取大鼠脾脏，用冰浴生理盐水冲洗，研磨过滤至流式管，以1500 r·min-1离心5 min，弃上清，用PBS重悬后分为两管。一管用细胞刺激剂（含蛋白质转运抑制剂）进行体外刺激，37℃，5% CO2孵育箱培养6 h后用PBS 洗涤1 次，依次加入5 µL CD4、CD3 抗体，室温避光孵育20 min后离心弃上清，加入1 mL细胞破膜缓冲液Ⅰ，室温避光孵育1 h；加入2 mL 细胞破膜缓冲液Ⅱ混匀，1500 r·min-1离心5 min，弃上清；加入5 µL抗大鼠IL-17A 抗体，室温避光孵育30 min，加细胞破膜缓冲液Ⅱ 2 mL，1500 r·min-1离心5 min，弃上清，加入400 µL PBS 重悬细胞上机检测；另一管进行Treg 检测，按上述步骤先进行CD4、CD25染色，然后用细胞核膜试剂盒操作说明对细胞进行破核膜处理，加入5 µL FoxP3 抗体，孵育30 min，PBS 重悬上机检测。大鼠外周血检测方法同上，其中加入细胞膜表面抗体孵育后，需进行红细胞裂解，余步骤同前。

1.5.7 免疫组化观察大鼠心肌组织IL-6、STAT3、p-STAT3表达

将心肌组织切片依次浸入二甲苯、梯度乙醇中脱蜡，水洗后，柠檬酸抗原修复缓冲液煮8 min（STAT3采用EDTA 抗原修复液），自然冷却后用PBS 溶液洗涤3 次；切片放入3% H2O2，室温避光孵育15 min，水洗3 次；在组化圈内滴加3% BSA 均匀覆盖组织，室温封闭30 min，在切片上滴加用PBS 按比例稀释好的一抗（IL-6 1∶800，STAT3 1∶800、p-STAT3 1∶800），平放于湿盒内4℃孵育过夜；PBS 清洗3 次后加入二抗（HRP标记），室温孵育50 min；PBS 清洗后，切片稍甩干，加入DAB 显色液10 min 后终止显色；苏木素复染1 min，水洗返蓝；脱水后中性树胶封片、扫描，HALO 数字病理图像分析软件测定阳性细胞表达面积[12]。

1.5.8 Western blot检测大鼠心肌组织IL-6、STAT3、p-STAT3、RORγt、FoxP3蛋白含量

采用RIPA裂解液提取大鼠心肌组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。将20 µg 蛋白样品加入12% SDSPAGE 凝胶中进行电泳。电泳结束后，将蛋白转移到PVDF 膜上。将膜完全浸至3% BSA-TBST 中封闭。封闭结束后根据蛋白质相对分子量裁膜，并先后在稀释于5%脱脂奶粉-TBST 溶液的一抗（IL-6 1∶1000、STAT3 1∶2000、p-STAT3 1∶1000、RORγt 1∶2000、FoxP3 1∶2000 稀释）和含HRP 的二抗中孵育。孵育结束后TBST 洗膜，ECL 暗室显色。通过Image J 软件对所测蛋白条带进行分析，用内参的灰度值作为比较，对结果进行分析并计算相对百分数。

1.6 统计分析

应用SPSS 23.0软件统计，计量资料符合正态分布且方差齐，用均值±标准差（）表示，多组间比较应用单因素方差分析，方差不齐应用秩和检验，P＜0.05 说明差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色观察心肌组织形态学改变

HE 染色结果显示，假手术组大鼠心肌组织排列紧密有序，心肌细胞形S态完整，未见间质水肿及炎性细胞浸润。模型组大鼠心肌纤维排列紊乱、断裂，心肌间隙增大，部分肌纤维断裂，见炎性细胞浸润。参芪复方组大鼠的心肌损伤得到一定改善，心肌纤维排列较为整齐，肌纤维断裂溶解情况缓解（图1）。

图1 心肌HE染色（HE，×200）

2.2 心脏超声

与假手术组相比，模型组大鼠LVEF、LVFS、SV、CO 均显著下降，LVDs、LVDd、LVESV、LVEDV 均明显增加（P＜0.01）。与模型组相比，参芪复方组大鼠LVEF、LVFS、SV、CO 均有不同程度提升（P＜0.01 或P＜0.05）；参芪复方组大鼠LVDs、LVESV 均显著降低（P＜0.01）（表1-2）。

表1 参芪复方对IHF大鼠心功能的影响（）

表1 参芪复方对IHF大鼠心功能的影响（）

注：与假手术组比较，##P＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

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表2 参芪复方对IHF大鼠心室结构的影响（）

表2 参芪复方对IHF大鼠心室结构的影响（）

注：与假手术组比较，##P＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

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综合心肌组织病理形态变化、心功能和心室结构指标评价，参芪复方高剂量组初步显示出较好的改善效果，故在后续实验中选择参芪复方高剂量组进行其他水平的检测。

2.3 参芪复方对大鼠脾脏及外周血Th17、Treg细胞的影响

与假手术组相比，模型组大鼠脾脏与外周血的Th17 细胞明显升高，Treg 细胞明显减少，Th17/Treg 细胞比显著升高（P＜0.01）；参芪复方组大鼠脾脏与外周血的Th17 细胞水平显著下降，Treg 细胞升高，同时伴随Th17/Treg 细胞比的显著下降（P＜0.01 或P＜0.05）（表3-4，图2-3）。

表3 参芪复方对大鼠脾脏Th17、Treg细胞含量的影响（，n=6）

表3 参芪复方对大鼠脾脏Th17、Treg细胞含量的影响（，n=6）

注：与假手术组比较，##P＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

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表4 参芪复方对大鼠外周血Th17、Treg细胞含量的影响（，n=6）

表4 参芪复方对大鼠外周血Th17、Treg细胞含量的影响（，n=6）

注：与假手术组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜ 0.01。

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图2 脾脏流式细胞检测代表图（左：Th17，右：Treg）

图3 外周血流式细胞检测代表图（左：Th17，右：Treg）

2.4 参芪复方对大鼠血清IL-17A、IL-6、TNF-α、IL-10水平的影响

与假手术相比，模型组大鼠血清IL-17A、IL-6、TNF-α 含量显著上升，IL-10 显著下降（P＜0.01）；参芪复方给药后可显著降低IL-17A、IL-6、TNF-α 水平（P＜0.01），提高IL-10水平（P＜0.05）（表5）。

表5 参芪复方对大鼠血清IL-17A、IL-6、TNF-α、IL-10平的影响（）

注：与假手术组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

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2.5 免疫组化检测大鼠心肌组织IL-6、STAT3、p-STAT3的表达

与假手术组相比，模型组大鼠心肌IL-6、STAT3、p-STAT3阳性面积增加（P＜0.05）；与模型组相比，参芪复方组大鼠心肌IL-6、STAT3、p-STAT3表达有不同程度下降（P＜0.05）（表6，图4）。

表6 各组大鼠心肌IL-6、STAT3、p-STAT3阳性表达结果比较（，n=6，%）

表6 各组大鼠心肌IL-6、STAT3、p-STAT3阳性表达结果比较（，n=6，%）

注：与假手术组比较，#P＜0.05；与模型组相比，*P＜0.05。

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图4 心肌组织IL-6、STAT3、p-STAT3免疫组化（×200倍）

2.6 参芪复方对大鼠心肌组织IL-6、STAT3、p-STAT3、RORγt、Foxp3蛋白表达的影响

与假手术相比，模型组大鼠心肌IL-6、STAT3、RORγ 蛋白表达均升高，Foxp3 表达下降（P＜0.05）；而复方参芪可有效降低IL-6、STAT3、RORγ 蛋白表达，增加Foxp3表达（P＜0.05）（图5）。

图5 各组IL-6、STAT3、p-STAT3、RORγt、FxoP3蛋白表达比较

3 讨论

中医药在治疗IHF方面有着独特的理论和丰富的经验支撑，在改善患者预后、提高生存质量方面发挥重要作用[13]。多项研究表明人参、黄芪的有效成分可以通过抗氧化、改变血管舒缩功能、减少血小板粘附、影响离子通道、改变自主神经递质释放和改善血脂谱等多机制、多靶点途径发挥心脏保护作用[14-15]。为了观察参芪复方对IHF 的治疗效果，本研究采用冠状动脉结扎制备了心力衰竭模型，结果提示参芪复方可以减轻大鼠缺血性损伤导致的心肌组织病理损伤，心肌纤维排列紊乱得到改善，炎性细胞浸润减少。另外通过心超评估大鼠心功能和心脏结构，发现参芪复方高剂量组大鼠LVEF、LVFS、LVDs、LVESV 均有明显改善，说明参芪复方在治疗IHF方面具有良好的药效。

心脏由心肌细胞、心肌成纤维细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞、免疫细胞等组成[16]。在稳态条件下，非心肌细胞表现出静止的表型，当发生缺血性损伤后，非心肌细胞活化作用于心脏发挥双面作用。其中，CD4+T 淋巴细胞介导的免疫反应在HF 的发病机制中起重要作用。首先，抗原呈递细胞识别了受损的心肌细胞释放出来的自身抗原蛋白，随后，幼稚CD4+T淋巴细胞通过MHCⅡ类分子产生抗原特异性免疫反应，原始抗原的幼稚CD4+T 细胞被激活，最终分化为具有不同表型的亚群[17]。在MI 早期阶段，CD4+T 淋巴细胞亚群能够促进瘢痕形成，防止心脏破裂；然而，持续激活的亚群细胞可能以自身免疫反应的方式靶向心脏，促进心脏肥大、纤维化、重塑和衰竭[3]。

Th17 与Treg 细胞作为CD4+T 细胞的效应亚群之一，它们在不同的细胞因子和信号通路刺激下进行分化、扩增并作用于心脏产生不同效应[18-19]。二者可以相互转化、相互制衡，它们之间的平衡对于控制炎症和改善心脏免疫微环境具有重要作用。Th17 细胞的特征是分泌促炎因子IL-17介导炎症反应及自身免疫疾病[20-21]；还能诱导间充质细胞或者成纤维细胞分泌IL-6、TNF-α 等炎性细胞因子，而炎症介导的间质纤维化会增加心肌僵硬度，促进IHF的发生。HF患者中循环Th17细胞的升高与左心室功能障碍呈正相关，且与不良预后高度相关[22]。Treg 细胞主要分泌IL-10 等抗炎因子，高表达叉头核蛋白3（Foxp3）转录因子，是抑制免疫炎症反应和维持免疫稳态的重要媒介[23]。急性心肌梗死后小鼠心脏和纵隔淋巴结中的Tregs 增加并能够促进心肌组织修复；临床研究也报告了Tregs的低水平与心血管疾病的高风险之间存在正相关，可作为心衰恶化患者再住院的独立预测因子。本研究发现IHF 大鼠外周血与脾脏中Th17 与Treg 细胞处于失衡态势，以促炎表现Th17 细胞为主要表达，同时伴随着炎性因子IL-17A、IL-6、TNF-α 的升高和抑炎因子IL-10 的降低。而参芪复方可以有效抑制IHF 大鼠炎症反应，促使Th17/Treg 平衡向Treg 偏移，改善这一病理态势。

Th17 细胞的分化取决于自身的转录因子类视黄醇孤儿核受体（RORγt），并受IL-6 的调节[24-25]。IL-6能够与可溶性IL-6R 形成复合物，与细胞膜上gp130分子结合，导致STAT3 通路激活[26]，诱导RORγt 的表达，并诱导Foxp3 过度表达减少对ROR-γt 的抑制，促进幼稚CD4+T 细胞分化为Th17 细胞，进而导致Th17和Treg 细胞之间的免疫功能失调。因此，靶向IL-6/STAT3 信号通路，激活Tregs 和抑制Th17 细胞的免疫调节疗法可能是防治IHF 的一种有效策略。人参、黄芪及其有效成分在不同疾病中能够发挥不同的功效，有研究发现，人参皂苷CK 能够通过抑制STAT3 的磷酸化调控人肝癌细胞凋亡[27]；人参皂苷Rb1 可以激活STAT3 通路抑制心肌细胞凋亡和炎症反应，减轻川崎病小鼠的心肌损伤[28]；黄芪甲苷可以通过抑制IL-6/STAT3 信号通路促进反复呼吸道感染大鼠的Th17/Treg 细胞平衡[29]。而国内外关于中药参芪复方通过调节IL-6/STAT3 通路对IHF 心肌损伤发挥免疫保护作用的研究鲜有报道。所以本研究初次验证了参芪复方可以通过抑制IL-6/STAT3通路发挥心肌保护作用，免疫组化和Western Blot 结果分别显示参芪复方可以抑制IL-6、STAT3、p-STAT3、RORγt 的蛋白表达，增加Foxp3的蛋白表达。

综上述，参芪复方可抑制IL-6/STAT3 表达，抑制Th17 细胞过度分化，促使Th17/Treg 平衡向Treg 修复表型偏移、减轻炎症反应、缓解心肌损伤、改善心脏功能，下调IL-6/STAT3信号通路表达可能是其起效的分子机制之一，更确切的详尽作用机制还需进一步深入研究与论证。