人参皂苷Rg1对重症急性胰腺炎模型大鼠肺损伤的治疗作用及其机制＊

2023-09-01朱大侠刘礼剑夏红星

世界科学技术-中医药现代化 2023年5期

江勇，朱大侠，刘礼剑，夏红星

（南华大学衡阳医学院附属南华医院衡阳 421002）

重症急性胰腺炎（Severe acute pancreatitis，SAP）是临床上最为常见的急性腹部炎症性疾病，具有发病快、死亡率高和并发症多等特点。急性肺损伤（Acute lung injury，ALI）是SAP引起的多种器官功能障碍中发生率最高、出现较早的一种常见并发症[1]。核苷酸结合寡聚化结构域样受体3（Nucleotide-binding domain，leucine-rich-containing family，pyrin domain-containing-3，NLRP3）炎症小体是炎症复合体的传感蛋白，属于机体固有免疫系统，可以通过控制多种促炎细胞因子的分泌而调节炎症反应[2]。研究表明，NLRP3 炎症小体激活参与SAP 的进程，抑制NLRP3 炎症小体激活，能有效减轻胰腺损伤，并且有效缓解SAP 导致的其他脏器损伤，包括肺损伤[3]。人参皂苷是人参中的主要有效成分，其中人参皂苷Rg1是重要的单体之一，具有抗炎和抗氧化作用[4]。研究表明[5]，人参皂苷Rg1 通过抑制炎症反应减轻脓毒症肺损伤，但其是否对SAP 引起的肺损伤具有治疗作用还未知。

本研究以SAP 大鼠模型为研究对象，探讨人参皂苷Rg1 对SAP 引起的肺损伤的治疗作用，并初步阐明了其作用机制是否与NLRP3 炎症小体介导的炎症反应有关。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级雄性SD 大鼠75 只，8 周龄，体质量220-260 g，购于湖南嘉泰实验动物有限公司，动物许可证编号：SCXK（湘）2019-0003。在20-25°C，湿度50%，昼夜交替（12 h/12 h）的清洁环境中适应性饲养1 周，期间给予大鼠常规饲料，自由饮水，保持通风。本研究动物实验在南华大学实验动物学部进行，经南华大学衡阳医学院附属南华医院实验动物伦理委员会批准（批准号2020zcx-07）。

1.2 主要试剂和仪器

人参皂苷Rg1（含量 ≥ 98%，上海融禾医药科技发展有限公司）；注射用乌司他丁（10 万U/支，广东天普生化医药股份有限公司，批准文号：国药准字H19990132）；白细胞介素（IL）-1β（SBJ-R0546）、IL-6（SBJ-R0755）、IL-18（SBJ-R0759）和肿瘤坏死因子（TNF）-α（SBJ-R0040）酶联免疫吸附实验（ELISA）检测试剂盒购自南京森贝伽生物科技有限公司；血清淀粉酶检测试剂盒（E33651，美国InvitrogenGTX 公司）；脂肪酶活性检测试剂盒（BC2340，北京索莱宝科技有限公司）；逆转录试剂盒（K1691，美国Promega 公司）；实时荧光定量聚合酶链反应（Quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）试剂盒（RR820A，大连TaKaRa 公司）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白试剂盒（P0012，上海碧云天生物技术公司）；NLRP3（NBP2-12446）、ASC（NB100-56564）和caspase-1（NBP1-45433）抗体购自美国NOVUS 公司；GAPDH（ab181602）抗体（英国Abcam 公司）。日立7600P 全自动生化分析仪（日本HITAACHI 公司）；Anthos 2010 酶标仪（英国Anthos 公司）；ABL700 全自动血气分析检测仪（丹麦雷度公司）；ABI7500 荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。

1.3 方法

1.3.1 动物造模及分组

参考文献[6]采用逆行胰胆管注射5%牛黄胆酸钠溶液法建立SAP模型，具体方法为：SAP大鼠模型构建成功后在制备SAP 模型前，所有大鼠均禁食12 h 后，采用30 mg·kg-1戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，常规消毒铺巾，腹部正中做切口，暴露腹腔十二指肠，识别胆胰管，用动脉夹阻断胆胰管入肝门处，然后在胆胰管连接十二指肠处，使用硬膜外导管探入胆胰管，以0.2 mL·min-1流速注入5% 牛磺胆酸钠溶液0.1 mL·100 g-1，胆胰管出现扩张后，维持8-10 min，当胰腺出现明显水肿出血情况，说明SAP 模型制作成功。松开动脉夹，取出导管，复位十二指肠后逐层缝合关闭腹腔。利用随机数字法，将造模成功的大鼠分为模型对照组、乌司他丁组和人参皂苷Rg1低、高剂量组（10、40 mg·kg-1），每组15只。另取15只大鼠作为假手术组，该组大鼠在模型制备过程中仅开腹后翻开胆胰管，不做其他处理。

1.3.2 药物干预

造模成功后，低剂量组大鼠腹腔注射10 mg·kg-1人参皂苷Rg1，高剂量组大鼠给予腹腔注射40 mg·kg-1人参皂苷Rg1[7]，乌司他丁组大鼠给予尾静脉注射2×104U·kg-1[8]，假手术组和模型对照组大鼠腹腔注射等量生理0.9%氯化钠溶液，每天1 次，共2 天。给药2 天后采用脊椎脱臼法处死大鼠并取材。

1.3.3 血清脂肪酶和淀粉酶活性检测

大鼠处死前腹主动脉取血，随后立刻将血液3000 r·min-1离心10 min（离心半径r=10 cm），取血清置于-20℃保存。采用日立7600P 全自动生化分析仪检测血清淀粉酶活性，采用ELISA 试剂盒检测血清脂肪酶含量。

1.3.4 苏木精-伊红（HE）染色

大鼠处死后取部分胰腺和左肺组织，立即置于4%中性甲醛溶液中固定，常规制备胰腺、肺组织石蜡切片，进行HE 染色后观察胰腺和左肺组织病理学变化。采用Schmidt 病理评分法[9]评定胰腺病理变化程度：从胰腺组织水肿、炎症浸润、空泡和坏死4 个方面进行评定，每项评分0-4 分。采用Hoffuaer 病理评分法[10]评定肺部组织病理变化程度：根据水肿、炎症细胞浸润和出血对肺组织切片进行评估，每项评分0-4分。评分越高，表明胰腺或肺组织病理改变越严重。

1.3.5 肺泡灌洗液（BALF）中IL-1β、IL-6、IL-18 和TNF-α水平检测

大鼠处死后，颈部正中切口，分离肌肉后，暴露气管。在气管上剪Y 型口，插入自制的静脉套管针行气管插管，用PBS 溶液5 mL 第1 次灌洗，注入回收后，再用5 mL PBS 溶液重复灌洗2 次后，回收3 次的肺泡灌洗液。采用ELISA 试剂盒和Anthos 2010 酶标仪检测大鼠BALF炎症细胞因子IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α水平。

1.3.6 肺组织湿/干（W/D）比值测定

大鼠处死后取右肺，擦干表面水分后，使用电子分析天秤称湿质量（W），然后将其置于80℃干燥箱中烘烤20 h至恒质量，再称干质量（D）。根据W/D比值=（W-D）/D×100%计算肺组织W/D比。

5.5 细胞因子 Gonçalves等[61]探讨了BALF中细胞因子水平与IPA的关联性，结果显示，IL-8肺泡水平≥904 pg/mL预测IPA的敏感性和特异性分别为90%、73%，阴性预测值88%，说明IL-8是IPA良好的生物标志物。此项研究突出了IPA患者中肺泡细胞因子呈一定特异性。同时，Heldt等[62]研究认为，血清和BALF中IL-6和IL-8水平与IPA有关，提示细胞因子用于诊断IPA的潜在价值。

1.3.7 动脉血中氧合指数（Oxygenation index，OI）检测

大鼠处死前腹主动脉取血5 mL，立刻置入ABL700全自动血气分析检测仪进行OI分析。通过仪器观察到动脉血氧分压（PaO2），空气中吸入的氧浓度分数（FiO2）参考值为21%，根据公式OI=PaO2/FiO2计算动脉血中OI值。

1.3.8 NLRP3、caspase-1 和ASC mRNA 的表达水平检测

大鼠处死后取左肺部分组织，液氮快速研磨后，加入TRIzol试剂提取组织总mRNA。严格根据逆转录试剂盒和荧光定量PCR 试剂盒操作步骤，使用ABI7500 荧光定量PCR 仪检测待测样本中NLRP3、caspase-1 和ASC mRNA 相对表达量。引物序列：NLRP3 forward 5’-GGAGTGGATAGGTTTGCTGG-3’，reverse 5’-GGTGTAGGGTCTGTTGAGGT-3’（180 bp）；caspase-1 forward 5’-TGCCGTGGAGAGAAACAAGG-3’，reverse 5’-CCCCTGACAGGATGTCTCCA-3’（278 bp）；ASC forward 5’-TCTGGAG GGGTATGGCTTGG-3’，reverse5’-GAGTGCTTGCCTGTGTTGGT-3’（235 bp）；GAPDH forward 5’-TGCTGGGGCTGGCATTGCTC-3’，reverse 5’-TCCTTGCTGGGCTGGGTGGT-3’（153 bp）。ABI 荧光定量PCR 仪设定程序：预变性95℃ 5 min，变性94℃1 min，退火61℃ 45 s，延伸72℃ 30 s 循环30 次，最终延伸72℃ 10 min。以GAPDH 为内参，采用2-ΔΔCT法计算待测基因mRNA相对表达水平。

1.3.9 NLRP3、caspase-1和ASC蛋白的表达水平检测

大鼠处死后取左肺部分组织，按照1:8 比例加入蛋白酶抑制剂，用匀浆器匀浆后，4℃、14 000 r·min-1离心10 min（离心半径r=10 cm），提取组织总蛋白。用BCA 试剂盒检测提取的蛋白量。预先制备12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶，电泳分离后转移到聚偏二氟乙烯膜上。加入5%脱脂奶粉室温封闭2 h，含有吐温-20 的Tris-HCl 缓冲盐溶液（TBST）洗涤3 次后，加抗体NLRP3（1∶500）、caspase-1（1∶1000）、ASC（1∶1000）和内参GAPDH（1∶10000），4℃孵育过夜。TBST洗涤3次后，加辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶5000），室温孵育1 h。ECL化学显影后，在利用超敏ECL化学发光试剂盒对PVDF 膜进行显影曝光后，用Image J 软件对条带灰度值进行量化，待测蛋白的相对表达量为待测蛋白条带灰度值/GAPDH蛋白条带灰度值。

1.3.10 统计学方法

采用SPSS 19.0 版统计软件进行数据分析。采用Kolmogorov-Smirnov 分析数据是否符合正态分布，若数据符合正态分布，则进行方差齐性分析；若不符合正态分布，则采用非参数检验。将符合正态分布的数据以均值±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，其中组间两两比较采用LSD-t分析。将非正态分布数据以四分位数间距（IQR）表示，多组间比较采用Kruskal-Wallis 检验，两组间比较采用Wilcox检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠急性胰腺炎指标

与假手术组比较，模型对照组大鼠血清脂肪酶和淀粉酶活性均显著提高（Z=4.66、t=19.43，P＜0.01）；与模型对照组比较，人参皂苷Rg1 高剂量组和乌司他丁组大鼠血清脂肪酶和淀粉酶活性均显著下降（H=39.13、F=60.10，P＜0.05），而人参皂苷Rg1 低剂量组大鼠血清脂肪酶和淀粉酶活性无显著性差异（P＞0.05）。见表1。

表1 5组大鼠血清脂肪酶和淀粉酶活性比较（或IQR，n=15）

注：与假手术组比较，①P＜0.01；与模型对照组比较，②P＜0.01。

2.2 大鼠胰腺和肺组织病理变化

如图1所示，假手术组胰腺组织形态正常，未见明显病理改变；模型对照组和人参皂苷Rg1 低剂量组大鼠胰腺组织出现明显水肿，胰腺间质出血，细胞坏死，组织形态不完整，并且有大量炎症细胞浸润；人参皂苷Rg1高剂量组与乌司他丁组大鼠胰腺坏死损伤明显减轻。如图2所示，假手术组肺组织形态正常，无明显病理变化；模型对照组和人参皂苷Rg1 低剂量组大鼠肺组织水肿明显，肺泡内出血，且有大量炎症细胞浸润；人参皂苷Rg1 高剂量组与乌司他丁组大鼠肺组织水肿、炎症细胞浸润以及出血症状明显减轻。与假手术组比较，模型对照组胰腺和肺组织病理评分显著升高（Z=4.66、4.67，P＜0.01）；与模型对照组比较，人参皂苷Rg1高剂量组和乌司他丁组的胰腺和肺组织病理评分均降低（H=36.93、37.13，P＜0.01），而人参皂苷Rg1低剂量组的病理评分无显著性差异（P＞0.05）。见表2。

图1 5组大鼠胰腺组织病理形态改变（HE，×200）

图2 5组大鼠肺组织病理形态改变（HE，×200）

表2 5组大鼠胰腺和左肺组织病理评分比较（IQR，n=15）

2.3 大鼠BALF 中炎症细胞因子IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α水平

如表3 所示，与假手术组比较，模型对照组大鼠BALF中炎症细胞因子IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α水平均显著上升（Z=4.67、Z=4.67、t=9.20、Z=4.67，P＜0.01）；与模型对照组比较，人参皂苷Rg1 高剂量组和乌司他丁组大鼠BALF 中炎症细胞因子水平均显著下降（H=30.12、H=37.79、F=35.55、H=31.02，P＜0.01），而人参皂苷Rg1低剂量组无显著性差异（P＞0.05）。

表3 5组大鼠BALF中炎症细胞因子IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α水平（pg·mL-1，或IQR，n=15）

注：与假手术组比较，①P＜0.01；与模型对照组比较，②P＜0.01。

2.4 大鼠右肺组织W/D比值和动脉血OI值比较

与假手术组比较，模型对照组大鼠肺组织W/D 比值及动脉血中OI 值均显著上升（t=9.89，Z=4.67，P＜0.01）；与模型对照组比较，人参皂苷Rg1 高剂量组和乌司他丁组大鼠肺组织W/D 比值及动脉血中OI 值均显著下降（F=51.87，H=29.64，P＜0.01），而人参皂苷Rg1低剂量组无显著性差异（P＞0.05）。见表4。

表4 5组大鼠右肺组织W/D值和动脉血OI值比较（或IQR，n=15）

注：与假手术组比较，①P＜0.01；与模型对照组比较，②P＜0.01。

2.5 大鼠肺组织NLRP3、caspase-1 和ASC 的表达水平比较

与假手术组比较，模型对照组大鼠肺组织中NLRP3、caspase-1 和ASC mRNA 和蛋白水平均显著上升（mRNA：t=25.53、17.24、22.57，P＜0.01；蛋白：t=16.21、21.43、21.48，P＜0.01）；与模型对照组比较，人参皂苷Rg1 高剂量组和乌司他丁组的肺组织中NLRP3、caspase-1 和ASC mRNA 和蛋白水平均下降（mRNA：F=113.44、44.83、85.75、P＜0.01；蛋白：F=87.70、64.38、109.61，P＜0.01），而人参皂苷Rg1 低剂量组无显著性差异（P＞0.05）。见图3。

图3 5组大鼠肺组织NLRP3、caspase-1和ASC mRNA和蛋白的表达水平

3 讨论与结论

3.1 急性肺损伤病理特征

急性肺损伤是SAP最常见的远端器官并发症之一，发病率和死亡率均较高。急性胰腺炎中有60%-70%的SAP 相关死亡是由急性肺损伤引起[11]。但现阶段仍缺乏SAP导致急性肺损伤的有效临床治疗策略。SAP能通过全身炎症导致肺损伤[12]。本研究显示，SAP大鼠肺组织病理形态发生了显著变化，出现了水肿、出血和大量炎症细胞浸润，肺出现明显水肿；另外动脉血氧合指数升高。这些结果均提示SAP大鼠出现了严重肺损伤，与前人结论SAP导致肺损伤一致。

3.2 NLRP3炎症小体与SAP诱导的肺损伤

NLRP3炎症小体是由无活性的caspase-1前体、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）和NLRP3 组成的复合体。NLRP3炎症小体的激活，诱导发生caspase-1依赖性介导的程序性细胞死亡（细胞焦亡），并伴随大量促炎因子释放，最终诱发级联放大性炎症反应[13]。SAP患者外周血NLRP3炎症小体活性明显增加，并且IL-1β和IL-18水平升高，与SAP病情严重程度成正相关[14]。在SAP导致肺损伤过程中，NLRP3炎症小体明显激活，引发炎症因子IL-β和IL-6的释放，促进炎症过程，同时caspase-1的表达量增加，肺损伤加重[15]。这些均说明NLRP3炎症小体参与了SAP导致的肺损伤。本研究显示，SAP通过上调全身炎症水平引起的肺损伤与NLRP3炎症小体异常激活有关，与前人的结论一致。提示NLRP3炎症小体参与SAP 引起的肺损伤过程，因此后续以NLRP3炎症小体为靶点寻找新的治疗方法或药物。

3.3 人参皂苷Rg1 通过抑制NLRP3 炎症小体活性缓解SAP诱导的肺损伤

人参是人参属的一种多年生植物，传统上被用作一种草药来缓解如糖尿病、高血压、神经疾病、疼痛和炎症等疾病及其症状[16]。人参皂苷是人参中的主要活性成分，是甾体三萜皂苷，具有抗炎作用。人参皂苷Rg1 通过调控炎症因子IL-4、IL-10、IL-13、IL-6、IL-1β 和TNF-α 的表达发挥抗炎作用，对抑郁症大鼠起神经保护作用[17]。人参皂苷Rg1 通过降低血清中IL-6、IL-1β、和TNF-α 的水平，减轻脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤[18]。这些研究说明，人参皂苷Rg1 通过抗炎作用，能有效减轻炎症引起的机体脏器损伤，但人参皂苷对SAP 引起的肺损伤是否具有类似的保护作用尚未有研究报道。本研究显示，高剂量（40 mg·kg-1）人参皂苷Rg1 对SAP 引起的全身急性炎症和肺损伤具有明显治疗作用，并且治疗效果接近阳性药物乌司他丁，说明人参皂苷Rg1 能通过抑制炎症反应，减轻SAP 时的全身炎症以及肺损伤，这与人参皂苷Rg1 的抗炎作用一致。研究报道[19]，人参皂苷Rg1 通过抑制NLRP3 炎症小体表达活性，逆转了炎症细胞因子IL-1β 水平升高，对轻度应激抑郁大鼠具有潜在抗抑郁作用。人参皂苷Rg1还可以通过阻断TLR4/NF-kB/ NLRP3 途径减轻脂多糖诱导的脓毒症小鼠炎症，恢复脓毒症引起的心功能受损[20]。但人参皂苷Rg1 减轻SAP 引起的肺损伤是否与调控NLRP3 炎症小体活性有关尚不清楚。本研究首次表明，人参皂苷Rg1 通过抑制NLRP3 炎症小体活性，降低SAP 诱导的BALF 子IL-1β、IL-6、IL-18 和TNF-α 的高表达水平，减轻SAP 引起的肺损伤。