基于神经示踪技术对胃病常用腧穴与胃关联机制研究的进展及存在问题＊

张丽丽，于 成，陈碧玮，杨凯伟，张海燕，陈少宗＊＊

（1. 山东中医药大学针灸推拿学院 济南 250355；2. 山东中医药大学附属医院 济南 250014；3. 山东中医药大学针灸研究院 济南 250355）

针灸治疗胃部疾病具有多种取穴组方的方案，常用腧穴主要分布于腹部、背部、下肢部，取穴组方以腹部腧穴与下肢腧穴联合应用为主，或者背部腧穴与下肢腧穴联用，Meta 分析表明，这些不同的取穴组方方案对胃部疾病都有积极的治疗作用[1-5]，为了研究不同腧穴与胃之间的联系机制，众多研究运用神经示踪技术对这一问题进行了探索，获得许多有价值的结果[6-11]，本文对这一方向的研究进行了系统回顾，并就存在的问题进行了讨论。

1 针灸临床治疗胃部疾病取穴规律研究

参考杜元灏等[12]统计的针灸疾病谱，选取适宜针灸的胃部相关疾病，主要包括功能性消化不良、胃下垂、慢性胃炎以及胃脘痛（中医病名）。检索中国知网、维普网、万方数据知识服务平台，收集关于针灸治疗胃部常见病取穴规律相关文献，检索时间为2012年1 月1 日-2022 年5 月1 日。检索词为主题词+自由词方式进行组合，中文检索词包括：“针刺”“针灸”“电针”“体针”“毫针”“功能性消化不良”“胃下垂”“慢性胃炎”“胃脘痛”“胃痛”“取穴”“选穴”“取穴规律”“选穴规律”，最终纳入23 篇文献。 利用SPSS Modeler18.0、Microsoft Excel2016 等数据挖掘工具二次统计总结胃部常见疾病的取穴规律（见表1、表2、图1）。

图1 胃部疾病常用腧穴关联网络图

表1 针灸治疗胃部相关疾病常用腧穴情况

表2 胃部疾病常用腧穴二次统计情况（使用频次＞30%）

研究发现，虽然针灸治疗同一种胃部疾病的取穴组方也有多个方案，涉及众多腧穴，但针灸治疗这5种常见胃部疾病的腧穴具有高度重合性，高度重合腧穴有足三里、中脘、内关、胃俞、脾俞5 个腧穴，其分布主要涉及四个部位：腹部（中脘）、背部（胃俞、脾俞）、上肢部（内关）、下肢部（足三里）。

2 利用神经示踪技术对治疗胃部疾病常用腧穴与胃的联系机制研究

胃部常见疾病的发病机制与胃肠动力紊乱、胃排空障碍、自主神经失衡、胃黏膜炎症性病变等因素密切相关[35-38]，胃受外源性交感神经[39-40]、迷走神经以及内源性肠神经系统的支配[41]，针刺对胃肠功能调节的作用机制依赖于神经-内分泌-免疫免疫网络[42]，神经系统在胃肠运动中起关键作用[43]，针刺对胃肠运动功能的调节取决于3 个水平：局部肠神经系统（ENS）、自主神经系统（ANS）和中枢神经系统（CNS）[44]。本文主要对利用神经示踪技术研究胃部疾病常用腧穴与胃在神经系统的关联机制进行综述。检索PubMed、中国知网、维普网、万方数据知识服务平台，搜集关于胃部疾病常用腧穴的神经示踪研究，检索时限均从建库至2022年5月1日。此外，追溯纳入文献的参考文献，以补充获取相关文献。检索采取主题词和自由词相结合的方式。中文检索词包括：经脉、腧穴、穴位、穴区、穴、神经示踪、神经示踪剂、示踪剂、示踪技术、示踪。英文检索词包括：Meridians, acupuncture point,acupoint, acupuncture area, acupuncture, acupuncture therapy, electro-acupuncture, needling, filiform needle,nerve tracer, tracer, neuronal tracers, neural tracing technique, neuro-anatomical tracing, tracer technique 等。中文数据库检索策略：（'经脉' OR '腧穴' OR '穴位'OR '穴区' OR '穴'） AND（'神经示踪' OR '神经示踪剂' OR '示踪剂' OR '示踪技术' OR '示踪'），Pubmed 检索策略见图2，检索结果见图3。

图2 文献检索策略（以Pubmed为例）

图3 文献筛选流程图

2.1 常用腧穴与胃的关联机制研究现状

神经示踪技术主要依赖于轴突运输，根据示踪剂的不同示踪特点，可将其分为多个种类，根据其轴突运输的方向，可分为顺行、逆行两个类别；根据其轴突运输是否跨越突触，可分为跨突触、非跨突触两类。逆行神经示踪主要适用于观察神经纤维的起源细胞到特定的靶区，顺行神经示踪剂适用于观察单个或多组细胞在中枢神经系统中的投射[45]，跨突触神经示踪剂则可以有效地实现多级神经网络的标记[46]，这些技术在穴位-靶器官的关联机制研究中发挥了重要作用，陶之理[11,47]较早地将神经示踪技术运用到针灸学科，利用辣根过氧化物酶（HRP）研究腧穴和内脏间的神经支配联系[48]。对于研究腧穴-靶器官的关联机制主要采用逆行神经示踪法，2000 年以前主要使用的神经示踪剂为HRP[10,49-52]或CB-HRP[53-57]，2000 年以后神经示踪剂种类逐渐增多，碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）、双苯甲亚胺（Bisbenzimide，Bb）、霍乱毒素亚单位B 结合荧光素等荧光类示踪剂逐渐运用[7-8,58-62]，实现了腧穴-内脏神经环路的多重标记，同时病毒类跨突触示踪剂的发展也为针刺效应的脑环路研究提供了新方法[9,63-64]。

神经系统决定的腧穴与靶器官的关联机制涉及3 个层次：第1 个层次的机制是腧穴-靶器官关联的外周（脊神经节）机制，包括长轴突反射、短轴突反射2种形式；第2个层次的机制是腧穴-靶器官关联的脊髓机制，包括内脏躯体共同汇聚机制、脊髓反射（传入-传出反射）、背根反射（DRR）3 种形式[65（]见图4），外周途径的完整性是针刺对靶器官发挥效应的必要条件[66-67]；第3 个层次的机制是腧穴-靶器官关联的高位中枢机制。背根神经节（Dorsal root ganglion，DRG）是腧穴与内脏感觉信号传入的基本环节[68]，脊髓是大部分躯体和内脏感觉信息整合的中继站[69]，两者是躯体与内脏信号整合的重要部位。目前对常用腧穴与胃之间关联机制的研究主要为外周DRG 和脊髓水平[6-9,60]，对脑干及脑干以上水平的联系机制研究相对较少。

图4 腧穴-靶器官相关节段性联系脊髓机制、外周机制示意图[65]

2.2 躯干部常用腧穴与胃的关联机制研究

胃部疾病在躯干部常选用的腧穴为中脘（腹部）、脾俞（背部）、胃俞（背部），相关神经示踪研究结果见表3、表6。

表3 腹部常用腧穴/腧穴-胃的神经示踪情况

表4 胃部疾病四肢部常用腧穴/腧穴-胃在外周神经节及脊髓的神经示踪情况

表5 胃部疾病四肢部常用腧穴/腧穴-胃在脊髓及脑的神经示踪情况

表6 胃部疾病常用腧穴在背根神经节的阳性标记情况

现代针灸学认为[65]腧穴的作用包括节段性效应和超神经节段的整体性效应，或称为特异性和广谱性效应[70]，与靶器官处于相同神经节段的腧穴其作用是节段性和整体性效应的叠加，而与靶器官距离较远的腧穴往往只有整体性效应[65,70]，刺激与靶器官相同节段的腧穴可以特异性地激活相应节段的交感和迷走神经[71]。胃感觉传入主要为T6-T10神经节段[72]，研究显示中脘、胃俞、脾俞与胃在胸段DRG 有重叠的神经节段[6,8,73]，在DRG 还存在躯体-内脏双标记神经元，因此DRG 是腧穴-胃信号传入、整合的重要部位，信号经DRG 进入脊髓背角进一步汇聚、整合通过躯体-内脏反射、背根反射对胃产生调节作用，同时在椎旁神经节也观察到脾俞的逆行标记，因此躯干部腧穴可能通过感觉及交感途径对胃产生调节作用，Li 等[74]的研究也证实在保证交感神经完整的前提下针刺健康大鼠气海、梁门、胃俞等腹部腧穴会抑制胃动力，切断交感神经效应消失，在切断迷走神经或脊髓化大鼠中该效应几乎不受影响。虽然躯干部的腧穴对胃有抑制作用，但并不是单方向抑制，其效应与机体病理状态密切相关，有研究证实中脘、胃俞的针刺信号可在DVC汇聚整合后经迷走神经促进胃的运动[75-76]，当胃动力低下时针刺躯干部腧穴能促进胃动力，但其促进作用较肢体远端腧穴弱[77]，因此躯干部腧穴对胃除节段性效应外，其针刺信号可经脊髓上行至高位中枢进一步发挥对胃的“泛调节”作用，包括神经传出、神经内分泌传出、神经免疫传出[67]，但其机制较为复杂仍需进一步研究。

中脘、胃俞、脾俞虽然与胃均有重合的神经节段，但中脘、胃俞神经节段支配集中于T10-T11，而脾俞稍偏于上部与胃的神经支配更为密切，Xu 等[78]的研究表明处于相似神经节段支配的腧穴其感觉及运动神经元是分离的，因此其针刺作用的神经通路可能并不相同，同时相同节段的腧穴配伍使用是否会产生协同作用也需要进一步研究。

2.3 四肢部常用腧穴与胃的关联机制研究

针灸治疗胃部疾病四肢部的腧穴主要为足三里（下肢）、内关（上肢），相关神经示踪研究结果见表4-6。

对于足三里穴有3项研究使用的是逆行非跨突触神经示踪剂，一项研究使用跨突触神经示踪剂。利用非跨突触神经示踪剂的研究结果存在一定差异，衣华强等[7]采用PI、Bb进行示踪，结果显示足三里感觉神经元主要位于DRG T6-L2节段，Cui等[79]和Wang 等[80]采用霍乱毒素亚单位B 结合Alexa Fluor 荧光素的示踪剂，Cui 等[79]研究显示DRG L3-L6节段存在阳性神经元，Wang 等[80]的研究结果为L4-L6，陶之理[47]采用HRP 的研究结果为T6-T12、L1-L7、S1-S3，出现上述差异性主要考虑与神经示踪剂、实验操作等因素不同有关： PI 和Bb 属于荧光染料，常用于逆行示踪且不跨突触，可以实现荧光双标记[81]，缺点是分子量小、易于扩散，同时存在过路纤维摄入问题；CTB 来源于霍乱毒素能够与神经节苷脂GM1 的戊多糖链结合从而粘附于细胞表面[82]，特异性地标记神经细胞[83]，主要用于逆行非跨突触的神经示踪[84]，性质相对稳定[85]；HRP 是从辣根中提取出来的一组同功酶的混合物，可以被神经终末或受损的轴索摄取然后逆行标记神经元，同时具备一定的跨突触特性[86]，缺点是参与细胞代谢，在溶酶体时间过久容易造成降解，还存在“再摄取”现象[87]，因此上述神经示踪剂性质不同，故摄取和运输的质量、在组织中扩散的趋势及效率、产生局部坏死的能力也不同[45]，除示踪剂不同外注射部位深度及方向、两种示踪剂注射的间隔时间、取材时间、动物物种等也存在差异（表4），诸多因素可能造成结果间存在差异，综合上述研究结果足三里穴与胃可能在胸腰段DRG 存在密切联系，有待进一步研究。Lee 等[9]采用跨突触神经示踪剂探究足三里与胃的神经环路，结果显示两种信号在延髓、脑桥、中脑、间脑、端脑各级中枢均有汇聚，其中孤束核（NTS）、迷走神经背核（DMV）、最后区（AP）、中缝大核（NRM）、臂旁核（PBN）、蓝斑（LC）、中央杏仁核（CeA）等核团有大量阳性标记（见表4），由NTS、DMV、AP 构成的迷走背核复合体（DVC）是调节胃运动和分泌的重要中枢，大量研究证实NRM、PBN、LC、CeA 等核团均与DVC有密切的纤维联系，同时以DVC为基本中枢发挥对胃的调控作用[88]。Li 等[74]的研究也证实足三里穴能够促使健康大鼠胃动力增加，但迷走神经或脊髓被切断后该效应消失，因此足三里的针刺信号与胃的传入信号在脊髓水平汇聚整合后可上达高位中枢的众多核团，最终主要经DVC-迷走神经对胃功能进行调节，所以DVC 是针刺调节胃肠功能的重要靶点，未来可以利用光遗传、化学遗传等技术以DVC 为核心开展针刺调节胃肠功能的中枢整合机制研究[88]。

内关穴神经支配主要为C5-T1节段[89]，与胃处于不同的神经节段，对此有研究[90-91]表明内关主要通过迷走神经对胃发挥调节作用，Jang等[92]研究证实内关的针刺信号可以上达孤束核，脊髓与孤束核之间存在相互联系的神经环路[93-96]，针刺内关穴后NTS 出现放电，切断迷走神经则没有放电，因此内关的针刺信号也经迷走神经对胃产生调节作用，与足三里的神经通路有一定相似性，但二者中枢DMV的投射部位存在一定差异[97]，其具体差异机制有待深入研究。

3 小结

利用神经示踪技术对腧穴-胃之间神经解剖学联系的研究为针刺治疗胃部疾病提供了有力的形态学依据，不同部位的腧穴与胃在神经解剖学中的联系并不相同，躯干部的常用腧穴基本与胃处于相同的神经节段，能够通过激活交感神经发挥对胃肠的调节作用，四肢部腧穴其针刺信号主要经脊髓上达高位中枢经迷走神经发挥对胃的调控作用，同时所有常用腧穴均能通过高位中枢发挥对胃功能调节的整体性效应，但针刺信号与胃的传入信号在高位中枢的整合机制较为复杂需进一步研究。

目前在腧穴-胃神经解剖学联系的研究中，因实验动物、神经示踪剂、手术操作流程、取材时间等相关因素的不同导致结果存在差异，降低研究之间的可比性。因此未来的研究应尽量选取扩散稳定、标记效率高、抗淬灭的神经示踪剂，统一实验动物、操作流程等一系列要素；其次，支配腧穴的神经节段分布高峰不同，因此与胃关联的密切程度也不同，该差异是否直接影响针刺对胃部调节效应的大小？除常用腧穴之外是否还有其他的腧穴也与胃有密切的神经解剖学联系？左右侧腧穴的作用机制是否存在差异？不同腧穴间配伍是协同还是拮抗作用？上述问题均有待进一步研究；第三，目前多数研究以外周或中枢脊髓水平为主，对脑干及以上水平的研究较少。随着新兴的实验技术的发展，跨突触神经示踪剂的不断成熟，未来可以综合光遗传、化学遗传、钙成像、膜片钳、Cre-LoxP 技术研究针刺作用的神经生物学机制，为针灸临床选穴组方提供科学指导。