硫酸化透明质酸的制备、活性及应用研究进展

2023-09-01卞兆荃王成山郭学平

食品与药品 2023年3期

卞兆荃，魏健，王成山，郭学平

（华熙生物科技股份有限公司，山东济南 250101）

透明质酸（hyaluronic acid，HA）是由葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖双糖重复单元组成的糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）。HA广泛分布于机体各组织中，具有特殊的理化性质和独特的生理功能，广泛用于骨科[1]、眼科[2]、化妆品[3]和保健食品[4]等多个领域。但未经改性的HA有稳定性差、易降解等缺点，在人体中无法长期保留，限制了其在药物和组织支架等方面的应用。通过对HA进行改性得到HA衍生物可有效克服这些缺点，拓展其应用[5-7]。

硫酸化透明质酸（sulphated hyaluronic acid或sulfated hyaluronic acid，sHA）是HA的硫酸酯。近年研究表明，相比其他硫酸化多糖，sHA表现出更优异的抗炎和抗肿瘤等功效，在伤口愈合和生物涂层方面，sHA同样显示出广阔的应用前景。本文对sHA的制备、生物活性以及现有和潜在应用研究进展进行综述。

1 sHA的合成

sHA的合成方法较多，早期EP0940410A1[8]采用HA四丁基铵盐与三氧化硫-吡啶于N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中低温反应，后期加入冰水终止反应，经沉淀、透析、冷冻干燥后可得sHA。Hintze等[9]用三氧化硫-DMF作为反应物，该反应物相比三氧化硫-吡啶更适于合成高取代sHA，室温反应1 h即可得到取代度2.8以上的sHA，现已成为较主流的合成sHA方法。Guarise等[10]用甲烷磺酸作为助溶剂实现了HA钠盐在DMF中的溶解，再与三氧化硫-吡啶复合物反应得到sHA。与传统方法相比，此法可省去前期合成HA四丁基铵盐的步骤。Fidia公司进一步优化纯化工艺[11]，后处理采用一系列精细的洗涤步骤代替传统的透析操作，得到了纯度和产率均极高的sHA产品，可有效减少后处理时间和成本。

2 sHA的生物活性

2.1 抗肿瘤、癌症

已有研究指出，HA可调节、抑制癌细胞生长和转移[12-13]，对HA进行修饰可进一步加强其抗肿瘤和抗癌活性。近年，sHA等HA衍生物在抗肿瘤、抗癌方面的研究受到广泛关注。Benitez等[14]研究sHA在前列腺癌细胞中的作用，结果表明，sHA可有效减弱透明质酸酶HYAL1的活性，抑制癌细胞的增殖和侵袭。Jordan等[15]发现，在膀胱癌的临床前模型中，sHA可能通过抑制血管生成和HA受体-PI-3K/AKT信号，从而抑制癌细胞增殖、迁移和侵袭，表现抗肿瘤活性。Koutsakis等[16]用Mr50×103的HA和sHA处理乳腺癌细胞，在抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力方面，sHA效果更显著；进一步研究表明，sHA抗癌活性可能与其更强地促进上皮间质转化标记物表达、抑制基质金属蛋白酶表达有关。Spinelli等[17]评估不同取代度sHA（0.7，sHA1；2.5，sHA3）对乳腺癌、肺癌和结直肠癌模型肿瘤细胞的作用及对肿瘤微环境中的其他细胞（如单核/巨噬细胞）的作用，结果表明，在肿瘤细胞中sHA3能降低细胞活性并诱导细胞毒性，sHA3未引起细胞凋亡但显著降低细胞增殖率，即sHA3通过诱导细胞凋亡以外的分子死亡机制影响癌细胞的死亡；进一步研究表明，sHA降低单核/巨噬细胞中血管生成因子和结合蛋白（如肿瘤坏死因子α诱导蛋白6）表达，下调HA水平，进而诱导形成抗肿瘤和抗血管生成微环境。

2.2 抗凝血

肝素是常见的临床用天然抗凝剂，但过高的抗凝血作用会诱发不良反应。Magnani等[18]合成了7种不同取代度sHA并进行抗凝血实验研究，结果表明，sHA的抗凝血作用随取代度增加而提高，但与天然肝素相比，其显示更弱的全身抗凝活性。抗凝血酶III（AT-III）与肝素结合被活化，进而与凝血酶相互作用并抑制血液凝固。Miura等[19]分别向血浆中添加肝素和sHA，通过测量残余凝血酶量评估AT-III的活性，结果表明，与肝素不同，sHA不能促进人血浆中AT-III与凝血酶的结合，故表现出更弱的抗凝血作用。

2.3 抗炎

Savage等[20]研究高取代度sHA对牙周炎的抑制作用发现高取代度sHA抑制与牙周炎的发生密切相关的多个因素，如牙龈杆菌生长和生物膜形成、Toll样受体2/ Toll样受体4介导的细胞激活和体外破骨细胞的形成等。这种对牙周炎多种介质的联合作用有助于预防或治疗牙周炎。Jouy等[21]研究表明，高取代sHA对体外培养的人巨噬细胞有很强的抗炎作用，即使被降解至低分子量依然能保持活性，弥补了作为抗炎药的高分子量HA用于炎症环境时可能被降解致使无效或促炎的缺陷。Pulsipher等[22]研究sHA对口腔黏膜炎的影响，sHA可靶向模式识别受体并抑制下游促炎细胞因子表达，有效干预辐射诱导的小鼠的口腔黏膜炎，且可在不干扰辐射治疗的情况下诱导肿瘤消退，有望成为一种潜在治疗药物。

2.4 对细胞因子和酶的作用

2.4.1 转化生长因子β1（TGF-β1）转化生长因子β（TGF-β）是一组调节细胞迁移、黏附、增殖和分化[23-25]的细胞因子。其中，TGF-β1活性最强，在调节炎症反应、免疫反应，广泛参与体内各种生理、病理过程中起作用。Smissen等[26]研究表明，含有sHA的人工细胞外基质可显著降低TGF-β1的生物活性。另外，sHA通过占用结合位点阻止TGF-β1的信号通路，从而减少TGF-β1驱动的真皮成纤维细胞分化。Koehler等[27]通过表面等离子体共振检测TGF-β1受体复合物与sHA的相互作用，发现高取代sHA阻断了TGF-β1与转化生长因子β1型受体（TβR-I）和转化生长因子βII型受体（TβR-II）的结合。进一步研究表明，sHA更倾向结合TGF-β1上的TβR-I位点，形成的复合物又会阻碍配体与TβR-II位点的结合。然而向TβR-II/TGF-β1复合物中添加高取代sHA可显著提升与TβR-I的结合，表明结合顺序非常重要。因sHA衍生物对TGF-β1生物活性的抑制作用可能有助于局部干预TGF-β1驱动的皮肤纤维化，故其是很有前景的功能性生物材料。

2.4.2 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）人诱导多能干细胞（hiPSCs）保持未分化状态，具有多能性，有望应用于药物开发[28]、发育研究[29]、免疫调节[30]和再生医学[31]等诸多领域。bFGF是维持hiPSC未分化状态的重要信号因子。已有研究表明，在人星形胶质细胞和人表皮角质形成细胞的培养过程中加入sHA，可促进bFGF信号传导[32]。机制研究表明[33]，sHA对bFGF有很高的结合亲和力，二者结合后可增强bFGF/细胞外调节蛋白激酶（ERK）信号传导，并在无养料和无bFGF条件下维持hiPSC的未分化状态和多能性。同时，HA不会与bFGF结合或促进bFGF/ERK信号转导，也不能维持hiPSC的未分化状态。这为避免人为添加bFGF所带来的高成本及可能的异种污染提供了解决方案。

2.4.3 血管内皮生长因子165（VEGF165）血管内皮生长因子A（VEGF-A）是一种同二聚体糖蛋白，是生理和病理血管生成中最有效和特异的调节剂。VEGF165是VEGF-A的主要亚型，在细胞外基质中与硫酸化糖胺聚糖（sGAG）相互作用并在血管生成、血管内皮细胞存活中发挥作用。Koehler等[34]通过实验和计算研究证实，sGAG干扰VEGF165与血管内皮生长因子受体-2的相互作用，抑制了VEGF165的生物活性，从而发挥抗血管生成的作用。这一发现为sGAG衍生物在血管生成过程中的调节潜力提供了新的见解，并为sGAG在治疗异常血管生成方面的应用前景指明了方向。

2.4.4 基质金属蛋白酶（MMP）与组织金属蛋白酶抑制剂（TIMP）细胞外基质是一个高度动态的网络，通过微调蛋白质的形成和降解平衡不断重塑。MMP是细胞外基质降解的关键协调者，活性受TIMP和GAG控制。在慢性创伤中，MMP和TIMP之间的不平衡会导致病理性的细胞外基质降解，需要新的适应性生物材料与这些调节因子相互作用重建平衡。Rother等[35]研究表明，sHA以一种明确的方式隔离TIMP-3，而不改变其对基质金属蛋白酶1（MMP-1）和基质金属蛋白酶2（MMP-2）的抑制电位，因此有望通过sHA调节TIMP-3水平，从而控制细胞外基质的重塑。Ruiz-Gómez等[36]研究MMP-2与不同GAG（硫酸软骨素、HA、sHA和肝素）的相互作用，以及GAG对MMP-2/TIMP-3复合物形成的影响发现，sHA降低MMP-2和TIMP-3蛋白水平及MMP-2活性，且只有sHA支持这两种蛋白在纤维状结构中的排列。模型结果表明，sHA通过抑制它们的相互作用，影响TIMP-3诱导的MMP-2抑制。

2.4.5 透明质酸酶探索能特异性阻断透明质酸酶的抑制剂有利于相应疾病治疗的发展。Isoyama等[37]评估21种抗透明质酸酶1（HYAL-1）、睾丸、蜂毒和链霉菌透明质酸酶抑制剂发现，sHA能最有效地抑制 HYAL-1，但也能降低蜂毒透明质酸酶和睾丸透明质酸酶的活性。细胞迁移诱导透明质酸酶1（CEMIP）是最近发现的一种透明质酸酶，通过不同于其他透明质酸酶的机制和条件切割HA。Schmaus等[38]研究表明，高取代sHA可有效抑制CEMIP活性，且其抑制CEMIP的选择性高于其他透明质酸酶。此外，高取代sHA对HA水平的影响是通过CEMIP抑制介导，表明sHA衍生物抑制CEMIP在依赖于CEMIP功能的病理条件下具有潜在效用。

3 应用

3.1 伤口敷料

Rother等[39]将胶原蛋白和高取代sHA组成的人工细胞外基质加入HA/胶原基水凝胶中，所得改良水凝胶可结合大量TGF-β1，并延缓凝胶中生长因子释放，通过重新平衡失调的TGF-β1诱导的细胞反应来改善皮肤修复。Thönes等[40]研究表明，含有sHA的凝胶可在较长时间内结合并缓慢释放肝素结合表皮生长因子，从而诱导角质形成细胞迁移和表皮生长因子受体信号传导等，进而促进伤口愈合。除此之外，含sHA的水凝胶被证实可用于调节炎症巨噬细胞活性和缓释VEGF165，以改善皮肤创面愈合结果，故在伤口愈合材料方面表现出应用潜力[41-42]。

3.2 组织支架、涂层

Guarise等[43]合成了一种多巴胺功能化sHA负载抗生素，将所得材料用于涂覆钛假体。带负电荷的sHA既能高效地与带正电荷的抗生素进行静电结合加以固定，又能起到骨再生作用。通过从植入物涂层持续释放抗生素，抑制细菌传播；后续体外实验进一步验证了该涂层的抗菌性[44]。Al-Maawi等[45]将高取代sHA与胶原纤维结合获得功能化胶原基支架。细胞实验表明，该支架可减少细胞因子VEGF、TGF-β1释放，增加白细胞介素8和上皮生长因子释放，并在30 d后可充分融入植入区并保持稳定的结构，有望成为一种全层皮肤再生支架。Krieghoff等[46]将含有sHA的人工细胞外基质包覆在支架上，研究评估所得支架的成骨潜力。结果表明，加入高取代sHA可提升小鼠和人间充质干细胞的成骨能力和矿化能力，表明涂层对成骨有积极作用。Kemkemer等[47]研制了一种含水的高分子量sHA涂层，用于改善热塑性聚碳酸酯聚氨酯弹性体（TPCU）的表面性能；该功能化不仅提高材料生物相容性，也可增加TPCU的耐磨性；体外实验表明，使用该涂层后的TPCU支架表面的软骨细胞增殖明显增强。

3.3 治疗性药物、材料

Kabra等[48]研究表明，sHA既能抑制胶原介导的血小板结合，又能抑制血小板衍生生长因子活性，故可作为一种潜在的肝纤维化治疗药物。Dickkopf-1（Dkk1）是一种与骨愈合相关的Wnt抑制因子，Gronbach等[49]证实sHA对Dkk1具有有效清除作用，结合sHA的生物大分子材料有望应用于未来成骨和骨缺损愈合相关的临床。Nguyen等[50]将不同取代度sHA和胺基封端的聚（N-异丙基丙烯酰胺）偶联获得了一种治疗性热凝胶，用于治疗角膜炎症，该治疗剂对眼表面具有热响应性，能输送sHA至少7 d，因此在角膜区域可有效发挥抗炎和延长治疗活性的效果。

3.4 药物输送

Purcell等[51]开发了硫酸化和甲基丙烯酸酯改性的HA大分子单体，并通过自由基引发的交联将它们整合到HA水凝胶中。研究表明，sHA大分子单体与肝素结合蛋白（SDF-1α）具有与肝素相当的亲和力，故该功能化水凝胶可有效减缓包裹的SDF-1α释放，用于各种药物输送应用。CN110200911A[52]公布了一种sHA-阿霉素（DOX）聚合物和sHA-甘草次酸聚合物自组装组成混合纳米胶束，实现了肝癌靶向给药和DOX在肿瘤细胞内的有效释放，从而实现更强的肿瘤抑制作用。